CN115177851A - 缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备方法 - Google Patents

缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种治疗肢体疼痛的微针贴片，具体涉及一种缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备方法。本发明提供的间充质干细胞外泌体微针贴片包括微针和防水背衬层，微针包括微针壳和微针核，防水背衬层包括防水层和背衬层；解决了现有技术存在操作复杂、患者耐受性差、价格高昂并且会造成二次伤害的问题，具有安全高效、使用方便、无副作用、价格低廉、易于保存以及可以重复使用等优点；同时，本发明还提供了一种所述间充质干细胞外泌体微针贴片的制备方法，包括模具制作、制作微针壳、制作微针核、制备背衬层、制备防水层以及干燥固化等步骤；该方法以微针模板倒模制备微针贴片，具有操作简单、成本低廉、易于大规模生产等优点。

Description

缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种治疗肢体疼痛的微针贴片，具体涉及一种缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备方法。
背景技术
颈肩腰腿痛多为慢性劳损及无菌性炎症引起的以病患部位疼痛、肿胀甚至功能受限为主的一组疾病，可由多种疾病单独或共同引起，例如肩周炎、颈椎病、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、腰椎间盘突出症、腰椎增生等，常表现为关节、肌肉酸痛、麻木、肿胀等症状，中老年人多见，近年来有年轻化趋势。据中国医疗保健国际交流促进会骨科疾病防治专业委员会的调查统计，在2000 名样本中，30～40岁的人群中59.1％的人患有颈腰椎病；50～60岁的人群当中，患者占81％；而60岁以上的人群发病率则高达82％。该病不仅发病率高，而且疗程长、易复发，由此带来的剧烈疼痛和长期的功能障碍严重影响患者的身心健康和生活质量。
间充质干细胞(mesenchymal stromal cell,MSC)在组织损伤后大量分泌各种因子改变微环境。这些因子影响细胞迁移、增殖、分化和基质合成等再生过程。越来越多的证据表明MSC来源的外泌体(MSC-exo)在组织再生过程中可作为生物活性治疗因子。MSC-exos是直径50-200nm的双层小泡，含有多种蛋白质、脂质及调控核酸，外泌体的双层膜质外壳可以防止其内容物的降解。 MSC-exos免疫原低，不会引起固有的不良反应或免疫排斥反应。众多研究表明， MSC-exos可能是再生医学中潜在的替代治疗颈肩腰腿痛的方法。参见YuanQL et al.Anatomical Record，2020，303(6):1735-1742。研究发现胎盘间充质干细胞来源的外泌体(PLMSC-Exo)可以逆转椎间盘退变、减轻局部炎症反应、缓解腰部疼痛及纠正姿势和步态异常。MSCs来源于骨髓、胎盘等多种间充质组织。参见Yuan QL et al.Stem Cellsand Development，2020，DOI: 10.1089/scd.2020.0083。与BMSCs相比，PLMSCs具有更大的分化潜能、治疗作用和更低的免疫原性。因此，PLMSC-Exo可能是治疗颈肩腰腿痛的一种有前途的选择。然而，该研究中治疗手段主要通过直接将PLMSC-Exo注射到病灶部位，操作复杂、患者耐受性差，需要专人操作，价格昂贵，且会造成二次伤害，一般患者难以接受。如果能有一种给药方式，即可避免口服给药的低效和副作用，又具有注射给药的高效性，还兼具经皮贴剂的方便、安全、顺应性，同时还能实现多个药物的协同作用，那必将极大地有助于颈肩腰腿痛的治疗和患者的病情缓解。
微针是最近十年发展起来的大分子物质经皮传递的理想手段，具有精确、高效、无痛、便利等优势。微针贴剂由微米级的微针基质和药物组成，以阵列形式排布，是特别适合皮肤使用的给药系统。其插入于皮肤内，可在少量组织液中迅速溶解，从而释放药物。制备原理是应用微针基质包载生物大分子药物，在温和的制备条件和生物相容、无刺激的试剂和辅料制备成可供皮肤给药的药物传递系统。应用微针技术解决生物大分子皮肤给药吸收问题和难于固定在伤面的问题。因此，开发一种能够缓解并治疗颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴在骨科领域具有重要的市场应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前直接将PLMSC-Exo注射到病灶部位给药方式治疗颈肩腰腿痛疾病存在的操作复杂、患者耐受性差、价格高昂并且会造成二次伤害的问题，而提供一种缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片及其制备方法。该缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片具有安全高效、使用方便、无副作用、价格低廉、易于保存以及可以重复使用等优点。同时本发明所提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的制备方法，以微针模板倒模制备微针贴片，具有方法简单、操作方便、成本低廉、技术门槛低、方便大规模生产等优点。本发明利用微针透皮贴片技术可以增加外泌体输送效率，直接到达病灶附近皮下部位，可以定点、定层、定量的将有效成分直接输送到所需的病灶组织附近。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，包括微针和防水背衬层，所述防水背衬层包括防水层和设置在防水层内侧的背衬层，所述微针包括微针壳和微针核，所述微针壳具有尖端和底端，所述尖端远离所述背衬层设置，所述底端附着于背衬层上，所述微针核设置于微针壳与背衬层所围成的空间内，其特殊之处在于：
所述微针壳是由聚乙烯醇、甲基丙烯酸酯明胶、非甾体抗炎药和无菌水混合固化而成；
所述微针核是由间充质干细胞外泌体、甲基丙烯酸酯透明质酸和磷酸盐缓冲液混合固化而成。
进一步的，所述微针核是由第一混合液固化而成，该混合液的组成为 2×1014～3×1014/L间充质干细胞外泌体、35～45g/L甲基丙烯酸酯透明质酸、 0.01～0.02mol/L磷酸盐，余量为无菌水。
进一步地，所述微针壳是由第二混合液固化而成，该混合液的组成为1900～2100g/L聚乙烯醇、18～23g/L甲基丙烯酸酯明胶、10～14g/L非甾体抗炎药，余量为无菌水。
进一步地，所述第一混合液的组成为2.5×1014/L干细胞外泌体、40g/L甲基丙烯酸酯透明质酸、0.015mol/L磷酸盐，余量为无菌水；
所述第二混合液的组成为2000g/L聚乙烯醇、20g/L甲基丙烯酸酯明胶、 12g/L塞来昔布，余量为无菌水。
进一步地，所述背衬层是由4～8份聚乙烯醇、2～4份羧甲基纤维素钠、2～ 8份甘油和100份水混合固化而成；
所述防水层是由用乙醇做溶剂配制浓度为9～11％(w/v)的羧甲基纤维素溶液固化而成。
进一步地，所述塞来昔布采用阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布和塞来昔布中的任意一种或几种；塞来昔布、阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬和尼美舒利是一类不含有甾体结构的抗炎药(NSAIDs)，该类药物具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种疼痛症状的缓解；
所述间充质干细胞外泌体来源于胎盘、脐带、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺的间充质干细胞。
进一步地，所述微针的尖端形状为斜尖或锥尖；
所述微针核高度为50～150μm，微针核直径为5～50μm；
所述微针壳高度为100～300μm，微针壳直径为10～100μm；
所述背衬层的边长为5～100mm的方形，防水层与背衬层形状一致且紧密贴合；
所述微针的数量为6～2000个，相邻两个微针之间的间距为0.5～5mm。
同时，本发明还提供了一种上述缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特殊之处在于，包括以下步骤：
a)模具制作：根据微针壳的形状制作所需的阴模；
b)制作微针壳：使用步骤a)所得阴模和与之匹配的阳模以及组成微针壳的原料制作所需微针壳，将阳模脱模，保留阴模；
c)制作微针核：培养间充质干细胞，分离间充质干细胞外泌体，将组成微针核的原料混合形成第一混合液，将该混合液加入到步骤b)中得到的微针壳内的凹槽中并进行加压，去掉凹槽表面多余的混合物，最后干燥得到微针核；
d)制备背衬层：根据组成背衬层的原料在步骤c)中制备的微针核的底端表面和未被覆盖的阴模上表面制作背衬层；
e)制备防水层：将组成防水层的原料混合形成混合液，然后将混合物倾倒于步骤d)中制备的背衬层的上表面，最后烘干得到防水层；
f)干燥固化：将带有阴模的微针壳、微针核整体进行干燥固化，将阴模脱模得到微针贴片。
进一步地，步骤b)具体为：将组成微针壳的原料混合形成第二混合液，将该混合液离心除去空气，采用真空填充的方法将混合物填充到阴模的成型孔中，使用与所述阴模相匹配的阳模压入阴模成型孔中，进行干燥、阳模脱模得到微针壳；
步骤b)中，所述离心具体为：在3000r/min离心4～10min完全除去混合物中的气泡；
步骤c)中，所述磷酸盐缓冲液起调节PH的作用，混合物的PH为7.2；所述加压具体为用注射器进行简易加压操作。
同时，本发明还提供了一种采用间充质干细胞外泌体制备缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的用途；本发明在使用时，将间充质干细胞外泌体微针贴片贴于病痛部位的皮肤表面，待构成微针壳的壳基质材料降解后，其负载的非甾族类抗炎药可进行被动释放以抗炎镇痛，微针核装载的间充质干细胞外泌体在壳基质材料降解后被释放输送到损伤组织部位，可以抗炎并促进组织修复。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，使用过程中直接贴在病痛位置，待构成微针壳的壳基质材料降解后，可将微针核含有的外泌体释放出来，具有直达病灶、操作简单的优点；
2.本发明提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，在微针壳中负载有非甾族类抗炎药物，在使用过程中可以起到抗炎、镇痛作用，同时避免了直接服用药物所产生的副作用，安全性方面得到很大提高；
3.本发明提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，在微针核中含有间充质干细胞外泌体、甲基丙烯酸酯透明质酸及磷酸盐缓冲液，其中甲基丙烯酸酯透明质酸能够在外泌体表面形成保护膜，防止外泌体表面蛋白失活；磷酸盐缓冲液能够调节外泌体保存液的渗透压和离子强度，使得微针贴片使用过程中效果显著；
4.本发明提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，使用过程中微针能够穿透皮肤角质层屏障，为大分子药物提供了新型的给药途径，解决了外泌体修复液透皮吸收问题；微针贴片能够缓慢释放外泌体修复液，可以在较低的给药频率下，提高肌体的吸收率；微针贴片为局部用药，避免了全身用药的副作用；
5.本发明提供的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的制备方法，以微针模板倒模制备微针贴片，具有方法简单、操作方便、成本较低、材料可重复利用、易于大规模生产的优点，生产出来的贴片易于保存、价格实惠。
附图说明
图1为本发明缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片实施例的结构示意图；
图2为本发明实施例中所使用的胎盘间充质干细胞形态示意图；
图3为使用流式细胞仪对本发明实施例中的胎盘间充质干细胞上的干细胞表面抗原进行鉴定所得的结果图；
图4中，图4a-图4f分别为本发明实施例中胎盘间充质干细胞三系分化图；
图5中，图5a-图5e分别为本发明实施例中外泌体的鉴定结果图；
图6为本发明实施例的制备流程图；
图7为本发明实施例的结构及使用示意图；
图8为本发明实施例治疗颈肩腰腿痛的临床试验流程图；
图中附图标记如下：
1-防水背衬层，101-背衬层，102-防水层，2-微针，201-微针壳，202-微针核。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
间充质干细胞外泌体的制备
1、胎盘间充质干细胞分离培养
在签署书面同意后，在无进行人工分娩、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎或染色体异常的情况下，孕妇HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。在选择性剖腹产后立即从女性供体中收集胎盘。在无菌条件下解剖胎盘组织，剪开胎盘蜕膜，选择胎儿面，剪取胎盘小叶中央蜕膜侧组织，用含10％青链霉素的HBSS反复冲洗，去除血迹，将羊膜从蜕膜的偏斜部分剥离，以尽量减少母细胞的存在。在无菌条件下将羊膜解剖成3×3×1cm3大小的块，再用pH为7.4的1×PBS彻底清洗组织，切成小块(约1-2mm3)。随后，将组织用1.6mg/ml胶原酶和200mg/ml脱氧核糖核酸酶I在37℃下振荡消化4h，用PBS洗涤两次后，将细胞和所有沉淀物重悬于补充有10％胎牛血清的DMEM生长培养基中，并放入25cm2组织培养瓶中，将培养物放入加有5％CO2的湿润组织培养箱中并保持温度在37℃，每3-4天更换一次培养基，连续观察细胞直到形成成纤维细胞样细胞的发育集落。当细胞融合度达到80％-90％时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA对贴壁细胞进行消化并传代培养，并以1×104细胞/cm2的密度重新铺板以进一步扩增。将某些批次的连续培养细胞冷冻保存在冷冻培养基(90％FBS和10％DMSO)中，并保存在液氮中以备将来使用，按1:3传代，取生长状态良好的P5～P7代细胞进行外泌体培养。
2、外泌体收集
将P5～P7代的胎盘间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％(v/v) 胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80％～90％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养72小时，收集培养基上清液备用；通过300×g 离心10min以去除细胞沉淀，然后将上清液以2000×g离心10min以去除死细胞，并以10000×g离心30min以去除细胞碎片，然后通过以100000×g离心70min 收获外泌体，通过重悬于20ml PBS中并以100000×g超速离心70min，将外泌体沉淀洗涤两次，在-80℃冰箱中储存备用。
间充质干细胞的鉴定和外泌体检测
1.胎盘间充质干细胞鉴定
(1)流式细胞术鉴定胎盘干细胞：为了评价胎盘间充质干细胞表面标志物的表达情况，取融合度为90％的P3-P5代胎盘间充质干细胞，使用PBS洗涤两次。在每个样品中，将4×105细胞重悬于50μLPBS中，并与10μL异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)结合的抗CD34、CD44、CD45、CD73、CD90或CD105 的抗体孵育，在4℃的黑暗环境中放置30min，用PBS洗涤后，将细胞用含1％多聚甲醛的PBS固定。通过与同型匹配对照PE偶联的小鼠免疫球蛋白G1(IgG1) 和FITC偶联的小鼠免疫球蛋白G2a(IgG2a)进行比较，鉴定出阳性细胞。使用流式细胞仪采集并分析至少两万个标记细胞，然后使用FlowJo V10软件分析结果。
(2)三系分化鉴定胎盘干细胞：按照MSC三谱系分化试剂盒的说明，通过将细胞分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞来研究细胞的多谱系分化能力，脂肪形成和成骨分化的染色溶液分别是油红O染色溶液和茜素红染色溶液；特别地，对于胎盘间充质干细胞向软骨细胞的分化，采用软骨小球培养方式进行培养21天，然后进行冷冻切片，用番红固绿进行染色。
(3)结果所示：从胎盘中分离的干细胞为多角形或梭型，细胞折光性强，如图2所示；经流式鉴定，分离的细胞强表达间充质干细胞的表面标记CD44、 CD73、CD90和CD105为阳性，而CD34和CD45为阴性，具有复合间充质干细胞的特征，证实从胎盘中分离的细胞为胎盘间充质干细胞，如图3所示。
(4)结果所示：在成脂分化诱导培养后，在相差显微镜下可以在细胞内部观察到圆形透亮小脂滴，其中一些融合为较大的脂质滴，而另一些则排列成串珠，如图4a所示；油红O染色将脂质滴染为红色，如图4c所示；在成骨分化诱导培养后，在相差显微镜下观察到细胞成长梭形紧密排列且轮廓不清晰，如图4b所示；茜素红染色结果显示大量红色小结节和红色钙沉淀，细胞结构不清楚，如图4d所示；番红固绿染色结果表明，在细胞小球切片中可以看到红色染色，如图4e、4f所示。这些结果表明，培养的细胞可以分化为成脂细胞，成骨细胞和成软骨细胞，这暗示这些细胞是胎盘间充质干细胞。
2.外泌体检测
(1)采用纳米颗粒追踪分析测试外泌体的粒径及浓度，透射电镜观测外泌体的形貌，蛋白电泳印迹法检测外泌体特异性抗原。
(2)结果所示，从胎盘间充质干细胞的条件培养基中提取外泌体，并在透射电镜下进行分析。观察结果表明，来自胎盘间充质干细胞的外泌体呈经典杯状，大小不均，直径范围为30-100nm，如图5a所示；NanoSight用于分析粒径分布，发现外泌体的粒径主要在50-150nm之间，如图5b-5d所示；蛋白质印迹分析的结果表明，在外泌体中观察到了阳性CD9和CD63表达，且其富集程度高于其所来源的细胞，如图5e所示。这些结果表明成功收集了外泌体。
缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的制备
实施例一
1.配置微针壳201的第二混合液
第二混合液的组成：2000g/L的聚乙烯醇、20g/L的甲基丙烯酸酯明胶、 12g/L塞来昔布和无菌水。
2.配置微针核201的第一混合液
第一混合液的组成：2.5×1014/L的间充质干细胞外泌体、40g/L的甲基丙烯酸酯透明质酸、0.015mol/L磷酸盐和无菌水；调节PH值至7.2。
3.防水层102、背衬层101的制备
(1)背衬层101的配方：膜材料聚乙烯醇6份、增稠剂羧甲基纤维素钠3 份、增塑剂甘油5份和水100份。
(2)防水层102的配方：用乙醇做溶剂配制浓度为10％(w/v)的乙基纤维素溶液(10mL无水乙醇，1g乙基纤维素，共10mL)。
4.缓解颈肩腰腿痛的干细胞微针贴片的制备
(1)倒模：取PDMS和固化剂，以10:1(w/w)混匀形成混合物，然后将混合物真空脱气30min，再倒入阴模板中，在40℃温度下干燥1h后脱模制成阴模。本实施例制备的阴模是PDMS阴模，为边长50mm的正方形，内含密度为 15×15/cm2、深度为1mm、底部直径为300μm的针状凹槽，相邻针状凹槽之间的间距为1mm。
(2)制备微针壳201：将聚乙烯醇、甲基丙烯酸酯明胶、塞来昔布和无菌水混合形成组成为2000g/L的聚乙烯醇、20g/L的甲基丙烯酸酯明胶、12g/L塞来昔布和无菌水的第二混合液，将该混合液在3000r/min离心8min完全除去空气后，用真空泵连续抽真空1h，然后将第二混合液填充到制备好的阴模的成型孔中，使用与阴模相匹配的阳模压入成型孔中，放置在干燥器中于室温下干燥，脱模得到微针壳201；本实施例采用的阳模是针尖长度为阴模针尖长度的0.5倍的另一个阴模板，且阳模的基底面积是PDMS阴模基底面积的0.5倍。
(3)制备微针核202：将间充质干细胞外泌体、甲基丙烯酸酯透明质酸、磷酸盐混合形成组成为2.5×1014/L的间充质干细胞外泌体、40g/L的甲基丙烯酸酯透明质酸、0.015mol/L磷酸盐和无菌水的第一混合液，第一混合液的PH为 7.2，将后将该混合液加入到已经制备的微针壳201的凹槽中并用注射器进行简易加压，通过塑料刮刀除去凹槽表面过量的混合物，放置于干燥器中于室温下进行干燥得到微针核202。
(3)制备背衬层101：将配比为聚乙烯醇6份、增稠剂羧甲基纤维素钠3 份、增塑剂甘油5和水100份的原料混合形成混合物，将混合物在80℃温度下恒温搅拌，待完全溶解混匀后保温静置5min，在转速为3000r/min离心8min，然后将离心后的混合物倾倒于制备的微针核5的底端表面和未被覆盖的阴模上表面，用2mm规格的涂膜器快速刮平，水平放置40℃烘箱中干燥0.5h，得到紧附于微针核202的衬层101。
(4)制备防水层102：将10mL无水乙醇和1g羧甲基纤维素配置成浓度为 10％(w/v)的羧甲基纤维素溶液，然后将其倾倒于已制备的背衬层101的上表面，水平置于烘箱中在40℃温度下干燥1h，待膜成形后得到防水层102。
(5)制备缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片：将带有阴模的微针壳201、微针核202整体在20℃下干燥24h至恒重后，脱去阴模得到完整的微针贴片，其具体结果如图1所示。
如图6所示，展示了具体的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴制备流程。
为便于使用及量产，最优微针贴片为边长为50mm，共有1000个微针2，相邻微针2之间的间距是1mm。
对比例一
与上述实施例一的制备过程不同之处在于对比例一中微针核不含有外泌体。
对比例二
与上述实施例一的制备过程不同之处在于没有微针结构。
一、试验步骤
1.招募100名志愿者进行试验，志愿者从临床前2周开始，不使用临床实验期间允许之外的其它治疗方式，签订知情同意书。
2.病人纳入标准：①腰部、臀后部、股前后及大转子等处疼痛，活动、久坐、久站后加重，症状反复发作，时间＞6个月；②腰部压痛阴性、直腿抬高试验阴性、无神经根损害体征；③腰部X线和CT检查均无异常，MRI检查正常或出现黑间盘、腰椎间盘局限性高信号区、Modic征；④年龄18～70岁；⑤近2 周内发作过至少1次；⑥近7天腰部疼痛视觉模拟评分量表(Visual analogue scale，VAS)评分平均分≥30mm；⑦同意参与本研究，签署知情同意书。
3.病人排除标准：①脊柱骨折、肿瘤及椎间盘感染者，有皮肤感染影响贴合者；②有腰部手术史者；③合并心理性疾病或认知功能障碍者；④活动性肺结核或心、肺、肝、肾等重要器官严重疾患者；⑤各种原因引起的出血或凝血功能异常者；⑥月经期、哺乳期者；⑦未签署知情同意书者。
4.实验分组：100例随机分为外泌体微针贴组、纯微针贴组、普通贴组和对照组，共四组，每组25例；其中外泌体微针贴组为负载胎盘间充质干细胞外泌体的微针贴剂组；纯微针贴组为不负载外泌体的微针贴；普通贴组为无微针2 的贴；对照组为无贴组。各组患者在性别、年龄、疾病持续时间、疼痛程度、及合并症等方面均无显著性差异(P>0.05)。为避免伦理问题，各组可服用相同剂量的抗炎药布洛芬每日2次，治疗周期为7天。上述各组贴剂，贴于腰腿疼痛部位，每日1次，连续30次为一个疗程。图7展示了间充质干细胞外泌体微针贴片的结构及使用示意图，间充质干细胞外泌体微针贴片在使用时，将其贴在病痛位置，微针壳201在微针贴片应用于皮肤上后快速降解，其负载的非甾族类抗炎药(NSAID)可进行被动释放以抗炎镇痛，微针核202装载间充质干细胞外泌体，内部外泌体在微针壳201的壳基质材料降解后被释放输送到损伤组织部位，可以抗炎并促进组织修复。
5.疗效评价：记录各组腰腿痛程度、腰腿部功能及生活质量评估。腰腿部疼痛采用视觉模拟评分法(VAS)、腰腿部功能采用ODI评分及患者满意度评分表评价。以上量表随访周期为首次治疗开始后1周、1月及6月。图8展示了微针贴片治疗颈肩腰腿痛的临床试验流程图。
6.统计学方法：采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析。治疗后不同时点腰痛VAS评分和ODI评分的比较采用重复测量资料的方差分析。分析实验结果时采用意向性治疗原则，对脱落病例采用末次观测值结转法评估其腰痛VAS评分和ODI评分。检验水准α＝0.05，P＜0.05认为具有统计学差异。
二、试验结果
1.纳入患者基本特征比较，结果如表1所示：
表1四组患者基线资料比较
Figure RE-GDA0003802299090000121
结果显示，四组患者基线资料比较，差异无统计学意义，有可比性。
2.患者腰腿痛VAS评分情况，结果如表2所示：
表2四组治疗前后腰腿痛VAS评分结果比较
Figure RE-GDA0003802299090000122
结果显示，间充质干细胞外泌体微针贴片组治疗后腰腿痛明显改善，疗效优于纯微针贴组、普通贴组和对照组。
3.患者腰腿部功能ODI评分情况，结果如表3所示：
表3四组治疗前后腰腿部功能ODI评分结果比较
Figure RE-GDA0003802299090000131
结果显示，间充质干细胞外泌体微针贴片组治疗后腰腿部功能明显改善，疗效优于纯微针贴组、普通贴组和对照组。
4.患者满意度，结果如表4所示：
表4四组患者满意度分数比较
Figure RE-GDA0003802299090000132
结果显示，间充质干细胞外泌体微针贴片组治疗后患者满意度优于纯微针贴组、普通贴组和对照组。
综上，间充质干细胞外泌体微针贴片在颈肩腰腿痛治疗中效果显著，可显著改善就医者的疼痛及功能障碍，提高满意度，值得广泛推广应用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，包括微针(2)和防水背衬层(1)，所述防水背衬层(1)包括防水层(102)和设置在防水层(102)内侧的背衬层(101)，所述微针(2)包括微针壳(201)和微针核(202)；所述微针壳(201)具有尖端和底端，所述尖端远离所述背衬层(101)设置，所述底端附着于背衬层(101)上，所述微针核(202)设置于微针壳(201)与背衬层(101)所围成的空间内，其特征在于：
所述微针壳(201)是由聚乙烯醇、甲基丙烯酸酯明胶、非甾体抗炎药和无菌水混合固化而成；
所述微针核(202)是由间充质干细胞外泌体、甲基丙烯酸酯透明质酸和磷酸盐缓冲液混合固化而成。
2.根据权利要求1所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述微针核(202)是由第一混合液固化而成，该第一混合液的组成为2×1014～3×1014/L干细胞外泌体、35～45g/L甲基丙烯酸酯透明质酸、0.01～0.02mol/L磷酸盐，余量为无菌水。
3.根据权利要求2所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述微针壳(201)是由第二混合液固化而成，该第二混合液的组成为1900～2100g/L聚乙烯醇、18～23g/L甲基丙烯酸酯明胶、10～14g/L非甾体抗炎药，余量为无菌水。
4.根据权利要求3所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述第一混合液的组成为2.5×1014/L干细胞外泌体、40g/L甲基丙烯酸酯透明质酸、0.015mol/L磷酸盐，余量为无菌水；
所述第二混合液的组成为2000g/L聚乙烯醇、20g/L甲基丙烯酸酯明胶、12g/L塞来昔布，余量为无菌水。
5.根据权利要求3所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述背衬层(101)是由4～8份聚乙烯醇、2～4份羧甲基纤维素钠、2～8份甘油和100份水混合固化而成；
所述防水层(102)是由用乙醇做溶剂配制浓度为9～11％(w/v)的羧甲基纤维素溶液固化而成。
6.根据权利要求3所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述非甾体抗炎药采用阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布和塞来昔布中的任意一种或几种；
所述间充质干细胞外泌体来源于胎盘、脐带、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝或胰腺的间充质干细胞。
7.根据权利要求1至6任一所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片，其特征在于：
所述微针(2)的尖端形状为斜尖或锥尖；
所述微针核(202)高度为50～150μm，微针核直径为5～50μm；
所述微针壳(201)高度为100～300μm，微针壳直径为10～100μm；
所述背衬层(101)的边长为5～100mm的方形，防水层(102)与背衬层(101)形状一致且紧密贴合；
所述微针(2)的数量为6～2000个，相邻两个微针(2)之间的间距为0.5～5mm。
8.一种权利要求1所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)模具制作：根据微针壳(201)的形状制作所需的阴模和阳模；
b)制作微针壳(201)：使用步骤a)所得阴模和阳模以及组成微针壳(201)的原料制作所需微针壳(201)，将阳模脱模，保留阴模；
c)制作微针核(202)：培养干细胞，分离干细胞外泌体，将组成微针核(202)的原料混合形成第一混合液，将该混合液加入到步骤b)中得到的微针壳(201)内的凹槽中并进行加压，去掉凹槽表面多余的混合物，最后干燥得到微针核(202)；
d)制备背衬层(101)：根据组成背衬层(101)的原料在步骤c)制备的微针核(202)的底端表面和未被覆盖的阴模上表面制作背衬层(101)；
e)制备防水层(102)：将组成防水层(102)的原料混合形成混合液，然后将混合物倾倒于步骤d)中制备的背衬层(101)的上表面，最后烘干得到防水层(102)；
f)干燥固化：将带有阴模的微针壳(201)、微针核(202)整体进行干燥固化，将阴模脱模得到微针贴片。
9.根据权利要求8所述的缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的制备方法，其特征在于：
步骤b)具体为：将组成微针壳(201)的原料混合形成第二混合液，将该混合液进行离心，除去混合物中的气泡；然后采用真空填充的方法将混合物填充到阴模的成型孔中，使用与所述阴模相匹配的阳模压入阴模成型孔中，进行干燥、阳模脱模得到微针壳(201)；
所述离心具体为：在3000r/min离心4～10min；
步骤c)中，所述第一混合液的PH调节为7.2；所述加压具体为用注射器进行简易加压操作。
10.一种采用间充质干细胞外泌体制备缓解颈肩腰腿痛的间充质干细胞外泌体微针贴片的用途。
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