CN101951903A

CN101951903A - 用于治疗或预防骨关节疾病的药物组合物

Info

Publication number: CN101951903A
Application number: CN2009801050043A
Authority: CN
Inventors: 恩里科·巴斯蒂亚内利
Original assignee: Bone Therapeutics SA
Current assignee: Bone Therapeutics SA
Priority date: 2008-02-15
Filing date: 2009-02-16
Publication date: 2011-01-19
Also published as: US20110027236A1; KR20100121484A; EP2257289B1; IL207546A0; IL207546A; CA2713878A1; CA2713878C; BRPI0905715A2; AU2009214044B2; JP2011523934A; US9415036B2; WO2009101210A1; JP5728234B2; EP2257289A1; US20170027991A1; AU2009214044A1

Abstract

本发明涉及用于急性和/或慢性治疗(或预防)骨关节疾病的药物组合物，其包含任选的足量的药用载体或稀释剂、多糖和/或糖胺聚糖、抗炎剂和干细胞。

Description

用于治疗或预防骨关节疾病的药物组合物

发明领域

本发明属于药学领域，涉及用于治疗或预防急性和/或慢性骨关节疾病的新的药物组合物。

发明背景

骨关节炎是最常见形式的关节炎，其为一种以关节软骨、与边缘骨赘形成有关的软骨下骨的缓慢退行性过程和轻度炎症为特征的疾病。据信慢性形式的骨关节炎影响15％的人群。其中，四分之一是重度残疾的。大多数骨关节炎病例的病因未知，被称为原发性骨关节炎。当骨关节炎的病因已知时，该病症称为继发性骨关节炎。继发性骨关节炎是由另外的疾病或病症引起的。可导致继发性骨关节炎的病症包括关节结构的反复性创伤或外科手术、出生时关节异常(先天性异常)、痛风、糖尿病及其它激素病症。其它形式的关节炎是全身性疾病，比如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)。

骨关节炎主要涉及臀、膝、脊柱和指(趾)节间的关节。骨关节炎的最常见症状是反复使用后受影响关节的疼痛。关节痛通常在晚上更严重。受影响关节可存在肿胀、温热和嘎吱响声。在长期不活动后还可出现关节的疼痛和僵直。在严重的骨关节炎中，软骨缓冲(cushion)的完损耗引起骨间摩擦，导致静息疼痛或运动受限的疼痛。

骨关节炎的特征在于软骨在几年内缓慢降解。在正常软骨中，基质合成和降解间存在着精细的平衡；然而，在骨关节炎中，软骨降解超过了合成。合成和降解之间的平衡受到年龄的影响，且受到滑膜和软骨细胞产生的一些因子的调节，所述因子包括细胞因子、生长因子、聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)和基质金属蛋白酶。除水之外，细胞外基质还由蛋白聚糖组成，蛋白聚糖由附着于由捕获在胶原框架或纤丝基质内的透明质酸形成的主链上的糖胺聚糖构成。关节软骨中的一种重要蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖(aggrecan)，其与透明质酸相结合，有助于提供软骨的可压缩性和弹性。聚集蛋白聚糖被蛋白聚糖酶裂解，导致其降解和后续软骨侵蚀。来自软骨基质的聚集蛋白聚糖的损失是在骨关节炎(OA)中观察到的首要病生理学变化之一。

由滑膜和软骨细胞产生的细胞因子，特别是IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，也是在软骨降解中起关键作用的成员。IL-1β是由骨关节炎的软骨而不是正常软骨自发释放的。IL-1β和TNF-α均刺激其自身的生成和它细胞因子(例如IL-8、IL-6和白细胞三烯抑制因子)、蛋白酶类和前列腺素E2(PGE2)的生成。在骨关节炎中，炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的合成及其受体的表达增加。在体外，两种细胞因子都已显示出强烈诱导软骨降解。在骨关节炎中过表达的其它促炎性细胞因子包括IL-6、IL-8、IL-11和IL-17，以及白细胞三烯抑制因子。

包括软骨在内的细胞外基质(ECM)被局部产生的基质金属蛋白酶降解。促炎性细胞因子(包括IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-18)增加基质金属蛋白酶的合成、减少基质金属蛋白酶酶抑制剂和减少细胞外基质合成。

在逆转细胞外基质降解的尝试中，软骨细胞增加的基质成分(包括蛋白聚糖)的合成。虽然其活性增加，但是可见上软骨层中蛋白聚糖的净损失。在骨关节炎的滑液中发现升高的抗炎细胞因子包括IL-4、IL-10和IL-13。它们的作用是减少IL-1β、TNF-α和基质金属蛋白酶的生成，以及抑制前列腺素的释放。局部生成的生长因子和分化因子如胰岛素样生长因子1、转化生长因子、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白也刺激基质合成。

现有技术

目前可获得的药理学治疗剂以缓解疼痛为目标，其包括镇痛药(即对乙酰氨基酚、环氧合酶-2特异性抑制剂、非选择性非甾体抗炎药、曲马多、阿片类)。然而，骨关节炎的临床表现通常为单关节或少关节的强度和位置的随时间变动。因此，为了避免不希望的全身作用，考虑局部治疗模式是合理的。几种化合物已经在关节内(例如糖皮质激素、透明质酸)或局部(例如辣椒素、水杨酸甲酯)使用。然而，关节内糖皮质激素的益处仅持续几天(Barron，M.C，2007，J.Am.Osteopath.，107，ES21-27)。

多糖构成了一类正在认识到其潜在效用的物质。除了它们的生物活性之外，多糖最重要的性质之一通常是它们形成水凝胶的能力。水凝胶的形成可以通过多种机制发生，并且受到所参与单糖的种类以及取代基的存在和性质的强烈影响。多糖的凝胶形成通常有两种类型：氢键键合型和离子型。氢键键合型凝胶是分子比如琼脂糖(热胶凝)和壳聚糖(pH依赖性胶凝)的特点，而离子键合型凝胶是海藻酸盐和角叉菜胶的特征。

蛋白聚糖是在关节软骨中发现的主要大分子之一。这些分子由核心蛋白和共价键连接的糖胺聚糖(GAG)链组成。GAG是长的、无支链的杂多糖，其由重复二糖单元组成，所述二糖单元具有糖醛酸(Muronic acid)氨基糖的通式结构。软骨特异性GAG包括软骨素4-硫酸盐(葡糖醛酸和在4位碳上具有SO₄的N-乙酰基-半乳糖胺)、软骨素6-硫酸盐(葡糖醛酸和在6位碳上具有SO₄的N-乙酰基-半乳糖胺)和硫酸角蛋白(半乳糖和在6位碳上具有SO₄的N-乙酰基-葡糖胺)。

这些分子能够形成具有相反电荷离子聚合物的水凝胶复合物，特别是阳离子多糖壳聚糖。该相互作用可构成实现软骨组织工程新材料的基础。其它重要的软骨GAG为透明质酸(葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺)。这一分子是滑液中的主要组分之一。透明质酸分子还作为蛋白聚糖聚集体中的主链结构存在于软骨基质中。通常，透明质酸作为细胞外基质的形成体起主要作用。纯化的透明质酸由于其高分子量和形成凝胶能力而用作结构生物材料。所述分子的性质可以通过化学修饰而进行广泛地改变。例如，羧基的部分酯化降低了该聚合物的水溶性，并且增加了其粘度。广泛的酯化产生了形成水不溶性膜或可膨胀凝胶的物质。乙基和苄基酯化的透明质酸酯膜具有优良的修复反应和生物降解性能。完全酯化的膜的体内寿命为几个月，而部分酯化的形式则显示出在几周内降解。

透明质酸是引起滑液的粘弹性性质的原因，滑液同时起润滑剂和减震器的作用。在滑液中，透明质酸涂布关节软骨的表面，并且占据胶原纤丝和硫酸化蛋白聚糖间软骨内的深部间隙。其保护软骨，阻断蛋白聚糖从软骨基质损失到滑液间隙中，保持正常软骨基质。在来自骨关节炎膝关节的滑液中，透明质酸、糖胺聚糖和硫酸角蛋白的浓度都低于来自正常膝关节的滑液中的浓度。另外，使用兔滑膜细胞的实验表明促炎性细胞因子IL-1和TNF-α刺激透明质酸合成酶的表达，其可有助于裂解炎症条件下的透明质酸。外源性透明质酸可促进产生新合成的透明质酸。在骨关节炎的治疗中，透明质酸和衍生物已被用作治疗辅助剂，其作为改善关节表面润滑性并从而减少关节疼痛的手段。一些体外培养研究也证实透明质酸通过抑制由纤连蛋白片段介导的软骨细胞软骨溶解而具有有益效应。透明质酸也显示出抗炎作用，以及对前列腺素合成和蛋白聚糖释放和降解的抑制作用。

壳聚糖是在节肢动物外骨骼中发现的甲壳素部分脱乙酰化的衍生物，是另一种蛋白聚糖，其为由β(1-4)连接的D-葡糖胺残基与可变数量的随机定位的N-乙酰基-葡糖胺基团组成的直链多糖。因此，其具有在关节软骨中存在的多种GAG和透明质酸的一些特征，根据来源和制备方法，壳聚糖的平均分子量可以为约50至约1000kDa。市售可获得的制品的脱乙酰度为约50至约90％。壳聚糖为一种半结晶聚合物，结晶度为脱乙酰度的函数。甲壳素(即0％脱乙酰化的)和完全脱乙酰化的(即100％)壳聚糖的结晶度最大。在中间脱乙酰度获得最小结晶度。

壳聚糖作为生物材料的大部分潜能源自其阳离子性质和高电荷密度。电荷密度允许壳聚糖与多种水溶性阴离子聚合物形成不溶性离子复合物或复合物团聚体。

实际上，壳聚糖低聚糖已经显示出对巨噬细胞的刺激作用，该作用与乙酰化残基有关。而且，壳聚糖及其母体分子甲壳素在体外和体内都已经显示出产生对嗜中性粒细胞的化学趋向作用。在体内，壳聚糖被酶促水解所降解。壳聚糖支架的机械性质主要取决于孔径和孔的方向。

透明质酸是一种糖胺聚糖，广泛地用于治疗膝的骨关节炎。在英国的2个常规实践的调查显示，约15％的骨关节炎患者接受用透明质酸制剂进行关节内治疗。因为其粘弹性性质，其可以代替滑液。而且，其可以减少疼痛感。还报道了有益的分子和细胞作用。透明质酸经常通过关节内注射施用，但是有关其临床相关性的证据与其不一致。最近公开了现有技术状态的系统综述和荟萃分析(meta-analyses)，它们的作者得出结论：关节内的透明质酸最多具有小的作用，临床上有意义的作用意味着疼痛的可视模拟量表至少改善15mm(Bellamy等，2006；Cochrane Database Syst Rev.2006 Apr 19；(2)：CD005321)。这些数据构成了向骨关节炎患者关节内施用透明质酸的基础。该益处有时仅仅在注射一年之后才能看到，在某些实验中，必须每周进行三至五次注射(Barron，M.C，2007，J.Am.Osteopath.，107，ES21-27)。

α-2-肾上腺素能受体配体，特别是激动剂，是通常在医疗实践中用作抗高血压物质和在临床麻醉学中用作全身和局域性(locoregional)麻醉和镇痛之组分的药物。它们产生抗焦虑、镇痛、镇静、麻醉节约(anesthetic sparing)效应和围手术期血液动力学稳定作用。阴性的神经毒性研究允许它们通过全身和髓周途径使用(主要是可乐定)和用于外周神经阻断。在临床可用的α-2-肾上腺素受体激动剂中，可乐定仍然广泛地使用：该物质没有神经毒性，并且显示出比更有效和更具α-2-肾上腺素能受体选择性的激动剂右美托咪定更少的副作用(即低血压和镇静)。可乐定是一种强效的α-2-肾上腺素能受体部分激动剂，主要用于治疗高血压。该药物刺激血管运动中枢中的α-2-肾上腺素能受体，导致从中枢神经系统中的交感传出减少。心输出量和外周阻力同时减少，导致血压降低。较高的浓度通过活化血管平滑肌中突触后受体而引起血管收缩。然而，该药物的显著优点被包括口干、镇静和头晕在内的副作用所抵消。而且，从来没有报道过口服施用这些化合物的其它活性，比如抗炎作用。

除了沿脊椎施用α-2-肾上腺素能(α-2-肾上腺素受体)激动剂的众所周知的镇痛作用之外，已经在急性疼痛病症中一般性报道了它们的外周用途。对于围手术期镇痛方法而言，将可乐定加入到脑干周围(peritroncular)神经阻断剂中的局部麻醉剂中以增强镇痛效力和延长持续时间。ZOUHER A等；Paediatr Anaesth.2005 Nov；15(11)：964-70；Luiz-Cleber P.等；Anesth Analg.2005 Sep；101(3)：807-11，Murphy DR ″A non-surgical approach to low back pain″Med.Health R.I.，2000 April；83(4)：104-7)。此外，关节内注射可乐定及其添加到用于静脉内局部麻醉的局部麻醉剂溶液中也显示出抗感受伤害的作用。S.Armand等；Br J Anaesth.1998 Aug；81(2)：126-34；Gentili M，等Pain 1996；64：593-596；Reuben S，等Anesthesiol.1999；91：654-658。然而，其中设计该作用不会持续几天或几周。

已知α-2-肾上腺素受体激动剂阻止促炎性细胞因子如TNF-α和IL-1β的组织含量升高和抗炎细胞因子TGFβ的组织含量升高。这一点已在部分结扎坐骨神经、局部施用α2肾上腺素能受体激动剂、周围神经阻断的炎症神经性疼痛模型中表现出来。

发明简述

本发明涉及一种用于治疗和/或预防急性或慢性骨关节疾病和急性或慢性骨关节症状特别是骨关节炎的新的(关节内)药物组合物，该组合物包含：

-任选的足量的药用载体或稀释剂，

-多糖和/或糖胺聚糖，优选糖胺聚糖(包括蛋白聚糖)，

-干细胞(分化的或未分化的)，前提是这些干细胞不是人胚胎干细胞，具有潜在的抗炎性质，和

-足量的抗炎剂(化合物)。

在本发明的药物组合物中，所述多糖或糖胺聚糖(包括蛋白聚糖)作为薄膜或基质存在，优选地为糊剂或凝胶的形式，更优选地为具有足量水性溶剂的水凝胶的形式。

优选地，所述抗炎剂(化合物)选自甾体化合物(泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙…)、非甾体抗炎化合物(布洛芬、双氯芬酸、萘普生、COX-2抑制剂等)、缓解疾病的抗风湿药(DMARD，比如甲氨蝶呤、来氟米特等)、α2肾上腺素能受体激动剂、抗CD20剂、抗细胞因子剂(抗IL1、抗IL6、抗IL17)、抗TNF剂(英夫利昔单抗、依那西普(etanercerpt)、阿达木单抗、利妥昔单抗等)或其混合物。

有利地，所述抗炎化合物为与α-2-肾上腺素能受体相互作用的化合物，优选α-2-肾上腺素能受体激动剂。

所述α-2-肾上腺素能受体激动剂选自可乐定、对氨基可乐定、噻美尼定、5-溴-6-(2咪唑烷-2-基氨基)喹喔啉、右美托咪定、地托咪定、美托咪定、α-甲基多巴、羟甲唑啉(oxymetazonline)、溴莫尼定、替扎尼定、米伐折醇、洛非西定、赛拉嗪、胍法辛、胍氯芳、胍诺沙苄或其衍生物或结构类似物、α-甲基去甲麻黄碱(α-methyinorepherine)、氮克唑、吲哚拉明、6-烯丙基-2-氨基-5，6，7，8-四氢-4H-噻唑并[4，5-d]氮杂

二盐酸盐或在表1中列出的化合物。

在本发明的组合物中，基于多糖的水凝胶和糖胺聚糖是非共价键连接的或者是共价键连接的。

优选地，所述糖胺聚糖选自低(＜900kDa)或高(＞900kDa)分子量的透明质酸。

在本发明的组合物中，所述透明质酸和α2肾上腺素能受体激动剂是非共价键连接的或者是共价键连接的。

在根据本发明的组合物中，所述糖胺聚糖选自蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、透明质酸(包括其衍生物)、壳聚糖、壳聚糖或甲壳素衍生物，或其混合物。

有利地，所述所述组合物的非人胚胎干细胞选自骨髓(从骨髓中得到的细胞)或脂肪组织或骨组织或关节组织、造血细胞和间充质基质细胞(分化的或非分化的)的混合物、间充质基质细胞、成骨细胞、软骨细胞或其组合。

本发明人发现，本发明的药物组合物适于治疗或预防急性和/或慢性骨关节疾病及炎症来源的相关症状(特别是骨关节的疼痛、运动性或功能)，比如骨关节炎、退行性关节炎、退行性关节炎、膝关节病、髋关节病及其中涉及关节的其它炎性一般性病症比如自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)、脊椎关节病、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、赖特尔综合征、牛皮癣性关节病、肠病性关节炎(与炎性肠病比如出血性结肠炎和克罗恩病有关)、神经病性关节病、急性风湿热、痛风、软骨钙质沉着病、羟磷灰石(calcium hydroxyapatite)晶体沉积疾病、莱姆病和所有其它退行性关节疾病。

本发明的组合物还适于获得有效的干细胞增殖，因此，用于改善再生的或破坏的组织。当治疗的组织再生时，该作用有利地由存在于本发明组合物中的活性化合物的协同作用引起。

因此，本发明组合物的特征在于抗炎活性、组织或细胞再生作用和有利的有效治疗和/或预防急性和/或慢性骨关节疾病和/或症状。本发明的组合物可联合具有这些作用。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述组合物表现为优选的制剂，优选为注射溶液，其用于向哺乳动物对象(包括人患者)特别是所述对象的膝、臀和脊柱递送存在于所述组合物中的有效量(治疗剂量)的活性化合物。

优选地，该注射溶液包含约0.1mg至约100mg/kg体重，优选约1mg至约10mg/kg体重的该多糖和/或糖胺聚糖，优选地为基于多糖的水凝胶的形式，并且，所述注射溶液可包括约0.1mg至约100mg/kg患者体重，优选约0.1mg至约0.8mg/kg患者体重的抗炎化合物，优选活化α-2-肾上腺素能受体的化合物，优选α-2-肾上腺素能受体激动剂。

所述注射溶液适于在哺乳动物对象(优选人患者)的关节中进行关节内施用(经皮注射)。

该制剂还适于局部施用(在哺乳动物对象，优选人患者的炎性关节中/或附近经皮注射)，该局部注射施用涉及表皮、肌肉或任何深部器官。

本发明的另一个方面涉及所述药物组合物在制备治疗和/或预防所述这些疾病和/或这些疾病引起的症状(疼痛)的药物中的用途。

本发明涉及出乎意料的发现：向哺乳动物对象特别是人患者关节内施用该药物组合物引起与骨关节疾病相关的症状的改善，比如骨关节疼痛的缓解、关节运动性和/或功能的改善、由上述疾病或病变诱导的炎性液体在关节内累积的减少。

本发明还涉及出乎意料的发现：向哺乳动物对象特别是人患者关节内施用本发明的药物组合物引起炎症和关节退化均减少、引起疾病改善和关节更新作用、在改善与骨关节疾病相关症状中的上述作用的组合。这些作用是由存在于所述组合物中的要素的协同组合获得的。

本发明还涉及出乎意料的发现：向哺乳动物对象特别是人患者关节内施用本发明的药物组合物还引起第一种组分治疗活性起效时间缩短、第一种组分作用的持续时间增加。

本发明的组合物和方法还使得能够减少为获得所期望效果所需的施用量，并允许作用起效更快。

本发明还涉及一种通过关节内给哺乳动物对象(优选人患者)，特别是膝、臀和脊柱或任何关节(例如指(趾)节间的)施用足量的本发明药物组合物来治疗和/或预防(预防性)选自上述疾病或症状之病症的方法。

本发明的最后一个方面涉及一种药盒，其包含含有本发明组合物之成分(载体/稀释剂、多糖、糖胺聚糖、抗炎剂(或抗炎化合物)、干细胞或其组合)的一个或多个瓶，以及用于将这些成分(同时或依次地)或该组合物递送至哺乳动物对象(优选患有上述骨关节疾病或症状(特别是疼痛)的人患者)的炎性关节的装置，并且，所述装置具有

-贮存该药物组合物的贮库器具，

-可沿所述贮库纵轴移动以分配该药物组合物的活塞工具，以及

-固定在所述贮库器具上用于将该药物组合物递送至哺乳动物对象之外周神经的空心针。

当阅读完下述本发明的详细说明连同所附实施例后，本发明的这些和其它目的和特征将变得完全显而易见。

发明详述

本文所用的术语“关节内”指向关节经皮注射本发明的药物组合物。

本文所用的术语“局部施用”指在炎性关节内或炎性关节附近经皮注射。因此，局部注射施用涉及表皮、真皮、肌肉或任何深部器官。

局部施用的主要优点是将镇痛作用选择性地限制在受损伤区域。而且，局部施用允许高的局部浓度水平，而几乎没有或者没有全身性释放。局部施用和关节内注射透明质酸是一种公认的对上述病症的治疗方式。

局部施用和关节内注射抗炎化合物和干细胞是很容易实现的，并且与蛋白聚糖的组合提供长效作用。因此，可以有力地使与放置侵入性药物递送系统有关的问题和由于全身性释放而引起的令人烦恼的副作用降至最小。使用这样的治疗可改善健康相关的生活质量、患者的满足感和经济评价，特别是在慢性病症中。

优选地，所施用的蛋白聚糖选自基于多糖的水凝胶或糖胺聚糖，例如透明质酸或其盐或者透明质酸与脂肪族、杂环或环脂族系列的醇所成的酯，或者硫酸化形式的透明质酸或者包含透明质酸试剂的组合。基于多糖的水凝胶或糖胺聚糖或其衍生物的合适剂量通常为约0.1mg至约100mg/kg体重/天，或约0.5mg至约10mg/kg体重/天，更优选约2mg至约8mg/kg体重/天。

有利地，所施用的干细胞来自骨髓、脂肪组织、骨组织或关节组织，其由造血细胞和间充质基质细胞、间充质基质细胞(分化的或非分化的)、成骨细胞或软骨细胞的混合物、或其任意组合组成。

根据第一个实施方案，所施用的干细胞为成骨细胞，或者优选为选自骨祖细胞(osteoprogenitor)、前成骨细胞和成骨细胞的细胞群。

根据第二个实施方案，所施用的干细胞为软骨细胞，或者甚至更优选地为选自软骨祖细胞(chondroprogenitor)、前软骨细胞和软骨细胞的细胞群。

在一个优选的实施方案中，所述α2肾上腺素能受体激动剂可以是可乐定、对氨基可乐定、噻美尼定、5-溴-6-(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉、右美托咪定、地托咪定、美托咪定、α-甲基多巴、羟甲唑啉、溴莫尼定、替扎尼定、米伐折醇、洛非西定、赛拉嗪、胍那苄、胍法辛、胍氯芳、胍诺沙苄或其衍生物或结构类似物、α-甲基去甲麻黄碱(α-methyinorepherine)、氮

克唑、吲哚拉明、6-烯丙基-2-氨基-5，6，7，8-四氢4H-噻唑并[4，5-d]氮杂

二盐酸盐、其类似物或选自表1的化合物及其类似物。

表1：

α-2-肾上腺素能受体激动剂的分类

胍类

胍丁胺

倍他尼定

双胍类

西咪替丁

肌酸

加贝酯

胍乙啶

胍法辛

胍

英普咪定

碘代-3-苄基胍

甲基胍

米托胍腙

亚硝基胍

吡那地尔

罗贝胍

磺胺脒

扎那米韦

咪唑类

4-(3-丁氧基-4-甲氧基苄基)咪唑烷-2-酮

尿刊酸(acide urocanique)

氨基咪唑甲酰胺

安他唑啉

生物素

二(4-甲基-1-高哌嗪基硫代羰基)二硫化物

卡比马唑

西咪替丁

克霉唑

肌酸酐

达卡巴嗪

右美托咪定

益康唑

依诺昔酮

ethymizol

依托咪酯

法倔唑

氟司必林

组胺

组氨醇

咪唑克生

咪唑烷类

咪唑啉类

可乐定

妥拉唑啉

英普咪定

左旋咪唑

洛沙坦(losartane)

美托咪定

咪康唑

萘甲唑林

尼立达唑

硝基咪唑类

昂丹司琼

羟甲唑啉

酚妥拉明

四米唑

甲巯咪唑

三甲硫吩

可乐定衍生物

2，6-二甲基可乐定

4-叠氮基可乐定

4-羧基可乐定-甲基3，5-二氯酪氨酸

4-羟基可乐定

4-碘代可乐定

烯丙尼定

阿可乐定

氯乙基可乐定

可乐定4-异硫氰酸酯

可乐定4-甲基异硫氰酸酯

可乐定受体

可乐定-替换物质

羟基苯乙酰基氨基可乐定

N，N′-二甲基可乐定

根据本发明使用的活性化合物是已知的。包含透明质酸的药物制剂是市售可获得的，如可乐定及其它α2肾上腺素能受体激动剂。可以根据现有技术中描述的方法，以基本上已知的方式制备所述化合物。

本文所用的术语“可乐定”指N-(2，6-二氯苯基)-4，5-二氢-1H-咪唑-2-胺，并且包括其可药用盐，例如与无机酸或有机酸的盐，所述无机酸比如氢卤酸，所述有机酸例如低级脂肪族单羧酸或二羧酸，比如乙酸、富马酸或酒石酸或芳香族羧酸，比如水杨酸也是合适的。

以治疗有效量使用可乐定。本发明还包括α2肾上腺素能受体激动剂在制备通过关节内注射而将治疗剂量的所述激动剂递送至关节或其封闭区域的注射制剂中的用途，其中所述溶液包含约3μg至约1500μg的所述α2肾上腺素能受体激动剂。优选地，所述制剂包含约30μg至约500μg的所述α2肾上腺素能受体激动剂。更优选地，所述溶液包含50μg至350μg的所述α2肾上腺素能受体激动剂。在一个优选的实施方案中，所述α2肾上腺素能受体激动剂为可乐定。可乐定的实际浓度可以变化，取决于所治疗的疼痛综合征的性质和程度，以及是否正在施用用于治疗或预防目的的药物。

假定基于其抗炎性质，抑制促炎性细胞因子TNF-α和IL1-β以及增加抗炎细胞因子比如TGFβ，则在注射施用中α2受体激动剂将用于骨关节炎性病症和其中存在骨关节炎性病症的疾病(比如上述那些)中。

根据本发明的方法和制剂，在骨关节疼痛的人病例和动物模型中，透明质酸和α2肾上腺素能受体激动剂形式之组合的注射剂都引起长效的疼痛缓解。所述方法是安全的，避免了主要的药物副作用，并且可用于急性和慢性治疗和/或预防，而无需使用侵入性技术。

可以向所述组合物中掺入有效量的防腐剂以抑制微生物的生长，所述微生物如细菌、酵母菌和霉菌。可以使用抵抗产品之微生物污染的任何常规防腐剂，只要其可药用并且不与可乐定起反应即可。优选的防腐剂是抗微生物的芳香醇，比如苄醇、苯氧乙醇、苯乙醇等，以及通常称为尼泊金化合物的对羟基苯甲酸酯类，比如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等，及其混合物，但不限于这些。特别优选的是苯甲醇和苯氧乙醇。

任选地，可以包括麻醉剂如利多卡因等。对于根据本发明的施用而言，可以将活性量的缓解神经性疼痛的化合物与常规药用赋形剂和/或添加剂一起包含在固体或液体药物制剂中。

通过溶解或分散所述化合物而制备的活性成分的液体制剂(比如溶液剂、混悬剂或乳剂)可包含常见的稀释剂(比如水、油)和/或助悬剂(比如聚乙二醇)和任选的在载体中的药用辅助剂(例如盐水、含水右旋糖、甘油或乙醇)，以形成溶液剂或混悬剂等。还可以加入进一步的添加剂，比如防腐剂、调味剂等。

实施例

在炎症模型中，用刺激的外周血单核细胞测试α2肾上腺素受体激动剂(例如可乐定)、糖胺聚糖(例如透明质酸)和干细胞之组合的作用。

通过Ficoll-梯度离心分离来自健康志愿者的肝素化静脉血的PBMC(外周血单核细胞)。在PBS中洗涤MNC(单核细胞)三次，并再悬浮在补充有100U/ml青霉素、l00μg/mL链霉素和10％热灭活FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基中。将细胞以100.000个细胞接种在96孔板上，总体积为200μl/孔。

将PBMC以100.000个细胞/200μL铺板于96孔微滴定板中，利用或不用10μg/mL的植物凝集素(PHA)刺激。测试透明质酸“HA”(200μg/mL)和对氨基可乐定“A2A”(5μM)对PBMC的作用。

MSC(间充质基质细胞)来源于20至60mL从健康志愿者的髂嵴获得的肝素化骨髓(BM)。将BM与磷酸缓冲盐水(PBS，2v∶v)混合，并使其在密度梯度Ficoll溶液上分层。离心后，从界面收集单核细胞，并用PBS洗涤两次。将细胞再悬浮于补充有15％ FBS的标准MEM培养基中。将细胞以2×10⁶个细胞/75cm²置于烧瓶中，并保持在包含5％ CO2的37℃湿润大气中。使细胞接触24小时，之后更换初始培养基。在第10天，在37℃下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离细胞1-5分钟。然后，照射细胞(在2200Ci下，10分钟)，之后以12.500个细胞/孔接种在96孔板中用于增殖测定，以获得比例1∶8(MSC∶PBMC)。

增殖测定

将该培养物与1μCi/mL的3H-胸苷一起培养24小时，之后终止培养，测定增殖。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用冰冷的5％三氯乙酸(TCA)洗涤两次。最后，用0.1N NaOH-0.1％ Triton-X100裂解细胞。收集上清液，并且在闪烁液的存在下在β-计数器上进行分析。将结果处理为cpm(“每分钟计数”＝在一分钟的连续计数系列中观察到的放射性元素的衰变数目)。IL-1β(β)检测(通过ELISA)。用Quantikine ELISA试剂盒(R & D Systems Inc，Mineapolis，USA)测量来自PBMC或培养物上清液的IL-1β的水平。IL-1β的最小检测浓度估计为1.0pg/mL。

将PHA刺激引起的PBMC释放IL-1β和PBMC的增殖设定为对照，并与HA和/或A2A处理的PBMC的测量结果进行比较。

还测量了由LPS刺激TH1细胞引起的对IL-1β之PBMC释放的抑制和PBMC增殖的抑制，PHA刺激的细胞提供类似的趋势。

单独的HA的作用

*：未测定

*：未测定

由PHA刺激引起的IL-1β分泌显示出比基线条件下(其中IL-1β水平检测不到)显著增加，将其设定为100。PMBC细胞的增殖也显著地增加约20倍。出乎意料地，单独加入HA观察到类似的细胞因子增加(相对于基线条件)，而PBMC增殖不受影响。当用PHA刺激时，加入HA协同增加IL-1β的分泌超过刺激条件下的3倍，但是能够使PBMC的增殖减少2倍。

单独的A2A的作用

*：未测定

A2A对于基线(未刺激)条件没有影响。令人感兴趣的是，当用PHA刺激时，由于PHA刺激，加入A2A完全抑制了IL-1β分泌的增加至不可检测的水平，但是不能抑制PBMC的增殖。

A2A和HA之组合的作用

*：未测定

*：未测定

令人感兴趣的是，组合HA/A2A证实了对PHA/HA情形的强效抗炎作用。实际上，加入A2A能显著地恢复(超过50％)由于PHA/HA刺激引起的IL-1β分泌的增加，使其水平达到单独PHA的情形下之一。出乎意料地，A2A进一步能够再抑制PBMC增殖35％。

加入MSC的作用

测试MSC对PBMC增殖和IL-1β分泌的作用，观察相对于基线(未刺激)条件下的刺激作用。出乎意料地，在刺激的条件下(例如，存在PHA)增殖作用维持，而不是对IL-1β分泌的促炎性作用，观察到了强效的抑制作用(-62％)。

*：未测定

*：未测定

在PHA刺激条件下和在透明质酸的存在下，MSC具有中等的(约10％)抗炎和抗增殖作用。

*：未测定

*：未测定

最后，在PHA刺激条件下和在A2A存在下，MSC没有任何影响。

*：未测定

*：未测定

在炎症期间，已知较低分子量的透明质酸片段是炎症和免疫刺激物，其诱导细胞因子如IL-6和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的分泌。HA也具有增加淋巴细胞和单核细胞粘附至细胞外基质上的性质(Yamawaki等，2009)。本实验表明，透明质酸对细胞因子(例如IL-1β)的生成具有强效刺激作用，而对PBMC增殖没有此作用。

已经证实可乐定改变Th1/Th2细胞因子的产生(Xu等，2007；Cook-Mills等，1998)。本实验表明，加入α2肾上腺素受体激动剂完全抑制由于PHA刺激引起的细胞因子(例如IL-1β)分泌的增加，但是不能抑制PBMC增殖。

出乎意料地，组合HA/A2A证实了同时对细胞因子产生和炎症细胞增殖的强效抗炎作用。实际上，向HA中加入A2A能够显著抑制IL-1β分泌的增加，并且进一步能够抑制PBMC增殖。

MSC的体外性质是其具有减少各种类型淋巴细胞的增殖同时具有体外和体内免疫赦免(immune privilege)的能力(Bocelli-Tyndall等，2007)。然而，已表明MSC的数目和孵育时间是MSC淋巴细胞调节中的关键因素：对淋巴细胞增殖的抑制对于MSC浓度是剂量依赖性的(LeBlanc in 2003)。

令人感兴趣的是，这些结果表明，MSC通过同时增加IL-1β的分泌和增加PBMC的增殖而对未刺激的PBMC具有中等刺激作用。相反地，MSC显示出对于IL-1β分泌的强效抗炎作用(-62％)，但是增加了PBMC的增殖。本发明人认为MSC不诱导PBMC的增殖，但是能够增加其存活率。这可通过PBMC附着到MSC的表面上来举例说明(参见附图1)。这一点似乎可通过在MSC存在下，用PHA刺激的PBMC观察到的生存力增加来证实；生存力增加超过20％。

再生作用

将MSC在软骨形成培养基中培养7、14和21天，测试了4种条件：

-对照

-A2A：5μMol氨基可乐定

-HA：200μg/ml透明质酸

-HA+A2A：200μg/ml透明质酸和5μMol氨基可乐定

在第14天和第21天，将沉淀物固定在10％缓冲的福尔马林中6小时，并且在PBS中洗涤两次。然后，将沉淀物埋入OCT(Sakura Finetek，Belgium)中。切下厚度为5μm的切片，用阿利新蓝(Alcian blue)染色，之后，用核固红(Nuclear fast red)(Klinipath，Belgium)复染色。

阿利新蓝是一种用于证实糖胺聚糖(GAG)的最广泛使用的阳离子染料。GAGs将被染成蓝色，而核固红将把细胞核复染色成粉红色或红色，将细胞质复染色成浅粉色。简言之，所述步骤为：1)在阿利新蓝溶液中染色30分钟；3)在流动的自来水中洗涤2分钟；4)在蒸馏水中冲洗；5)在核固红溶液中复染色5分钟；6)在流动的自来水中洗涤1分钟；7)通过95％乙醇进行脱水，并且2次改变为无水乙醇，每次3分钟；8)在Ultraclear(一种二甲苯取代物(Klinipath，Belgium))中澄清；9)用Ultrakit固定介质(Klinipaht，Belgium)固定。甲苯胺蓝将蛋白聚糖染色成红色-紫色(异染性染色)，将细胞核染色成蓝色(正染性染色)。异染性是由于碱性染料的pH、染料浓度和温度引起的，组织成分被染料溶液染色成不同的颜色。利用异染性组织成分，蓝色或紫色染料将显示出红色色移，红色染料将显示出黄色色移。甲苯胺蓝通常用于染色组织(比如软骨)中的蛋白聚糖和糖胺聚糖。

结果。尽管来自不同条件的沉淀物具有类似的大小(平均0.7mm；从0.9至0.4mm)，但阿利新蓝染色显示出沉淀物的细胞含量(cellularity)受到条件变化的显著影响。例如，加入透明质酸强烈地减少了沉淀物的细胞含量。平行地，在对照和单独A2A条件下，基质(即粘多糖和糖胺聚糖)含量几乎不存在，如在图2中在不存在蓝色染色情况下所阐明的，而在透明质酸和透明质酸/可乐定条件下，载玻片被均匀地染成蓝色，证实了存在重要的基质产生。相对于单独的HA条件，组合条件HA/A2A似乎进一步增加了基质产生。

图2：对于不同的培养条件，在低放大倍率(上图)和高放大倍率(下图)下阿利新蓝的染色：对照、A2A(单独的可乐定)、HA(单独的透明质酸)和HA/A2A(透明质酸和可乐定的组合)。

令人感兴趣的是，细胞核染色证实了向透明质酸(HA)中加入可乐定(HA/A2A)增加了沉淀物的细胞含量。

总之，透明质酸、抗炎性化合物(比如α2肾上腺素受体激动剂)和间充质基质细胞的组合显示了出乎意料的协同抗炎作用和再生作用：

-对于重新产生软骨基质，需要存在间充质基质细胞；

-该产生通过加入透明质酸而显著增加(和加速)，但是加入透明质酸具有强效促炎性作用；

-这些透明质酸的强效促炎性作用被加入α2-肾上腺素能激动剂所完全抵消；

-加入α2-肾上腺素能激动剂支持了间充质基质细胞和透明质酸之组合通过增加细胞制备物的细胞含量和基质产生的再生作用。

参考文献

Bocelli-Tyndall et al.(Rheumatology；46：403-408(2007)).

Bondeson et.al.(Arthritis Res Ther；8(6)：R187(2006)).

Cook-Mills et.al.，1995.(Immunology.85 544-549(1995)).

Le Blanc et.al.，(Scandinavian Journal of Immunology，57，11-20(2003)).

Levesque et al.，(The Journal of Immunology，166：188-196(2001)).

Mchugh et al.(Clin Exp Immunol.99：160-167(1995)).

Pelletier et al.(Arthritis Rheum.44(6)：1237-47(2001)).

Yamawaki H et al.(Glycobiology，19，83-92(2009)).

Claims

1.一种药物组合物，其包含

-任选的足量的药用载体或稀释剂，

-多糖和/或糖胺聚糖，

-有效量的抗炎化合物，和

-有效量的干细胞，前提是该干细胞不是人胚胎干细胞，

用于治疗和/或预防急性和/或慢性骨关节疾病和/或症状，优选地，所述治疗和/或预防通过关节内注射进行。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述糖胺聚糖选自蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角蛋白或透明质酸、其衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物或甲壳素衍生物。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述抗炎化合物选自甾体化合物、非甾体抗炎化合物、改善疾病的抗风湿药、α2-肾上腺素能受体激动剂、抗CD20剂、抗细胞因子剂、抗TNF剂或其混合物。

4.根据权利要求3的药物组合物，其中所述抗炎化合物为α2肾上腺素能受体激动剂。

5.根据权利要求4的药物组合物，其中所述激动剂选自可乐定、对氨基可乐定、噻美尼定、5-溴-6-(2-咪唑烷-2-基氨基)喹喔啉、右美托咪定、地托咪定、美托咪定、α-甲基多巴、羟甲唑啉、溴莫尼定、替扎尼定、米伐折醇、洛非西定、赛拉嗪、胍那苄、胍法辛、胍氯芳、胍诺沙苄或其衍生物或结构类似物、α-甲基去甲麻黄碱、氮

克唑、吲哚拉明、6-烯丙基-2-氨基-5，6，7，8-四氢4H-噻唑并[4，5-d]氮杂二盐酸盐。

6.根据权利要求1的药物组合物，其中所述干细胞选自骨髓浓缩物、造血干细胞和间充质干细胞(分化的或非分化的)的混合物、间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞或其组合。

7.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其包含0.1至100mg/kg体重的多糖或糖胺聚糖。

8.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其包含0.1至100mg/kg体重的抗炎化合物。

9.根据前述权利要求1至8中任一项的药物组合物，其中所述干细胞为成人间充质干细胞或(非人)胚胎间充质干细胞。

10.根据权利要求1至8中任一项的药物组合物，其为注射溶液。

11.权利要求10的药物组合物，其中每周两次、优选每周一次、更优选两周或三周一次注射所述注射溶液。

12.根据权利要求1至11中任一项的药物组合物，其中所述急性或慢性骨关节症状选自疼痛、活动性和/或功能。

13.根据权利要求1至12中任一项的药物组合物，其中所述骨关节疾病选自骨关节炎、退行性关节炎、膝关节病、髋关节病、及其中涉及关节的其它炎症性一般性病症或症状，比如系统性红斑狼疮(SLE)、脊椎关节病、风湿性多肌痛、强直性脊柱炎、赖特尔综合征、牛皮癣性关节病、肠病性关节炎(与炎性肠病如出血性结肠炎和克罗恩病有关)、类风湿性关节炎、神经病性关节病、急性风湿热、痛风、软骨钙质沉着病、羟磷灰石晶体沉积疾病和莱姆病。

14.一种药盒，其包含：

-含有根据前述权利要求1至13中任一项之组合物的瓶，

-将所述组合物递送至哺乳动物对象之炎性关节的装置，并且所述装置具有

-贮存所述组合物的贮库器具，

-可沿所述贮库纵轴移动以分配所述药物组合物的活塞器具，以及

-固定在所述贮库器具上用于将所述药物组合物递送至哺乳动物对象之外周神经的空心针。