KR20240018511A - 가수분해성 하이드로겔 및 이의 용도 - Google Patents

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안드레스 제이. 가르시아
마리아 엠. 코로넬
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조지아 테크 리서치 코포레이션
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Abstract

본 발명은 하이드로겔, 보다 구체적으로는 절단가능한 에스테르 모이어티를 포함하는 가수분해성 하이드로겔 및 조직 공학 및 치료제 전달과 같은 응용 분야에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

가수분해성 하이드로겔 및 이의 용도
관련 출원의 인용
본 출원은 2021년 5월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 63/193,211에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이 문헌의 전문은 인용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 하이드로겔, 보다 구체적으로는 조직 공학 및 치료제 전달과 같은 응용 분야에서 사용될 수 있는 가수분해성 하이드로겔에 관한 것이다.
카고 (cargo) 분자 및 세포의 방출을 위한 치료제 전달 메커니즘의 발전은 세포 적합성 생체재료와 캡슐화 방법에 대한 연구를 통해 추진되어 왔다. 가교결합된 중합체 구조로 제작된 망상구조인 합성 하이드로겔은, 성장 인자 및 세포 산물과 같은 생리활성 물질을 캡슐화하여 생존력과 생리활성 카고 효능에 영향이 제한적이면서도 세포 거동을 지원하고 조절할 수 있는 3D 구조를 생성하는데 활용되어 왔다 (Guan, X., Avci-Adali, M., Alarcin, E., Cheng, H., Kashaf, S. S., Li, Y., Chawla, A., Jang, H. L., & Khademhosseini, A. (2017). Development of hydrogels for regenerative engineering. Biotechnology Journal, 12(5), 1600394). 이러한 하이드로겔 시스템의 기계적 특성, 예컨대 강성 및 매트릭스 온전성에 대한 조정가능성 (tunability)은 다양한 미세환경에서 사용할 수 있게 하는 유연성을 제공한다 (Saxena, S., Hansen, C. E., & Lyon, L. A. (2014). Microgel Mechanics in Biomaterial Design. Accounts of Chemical Research, 47(8), 2426-2434 and Guan, X., Avci-Adali, M., Alarcin, E., Cheng, H., Kashaf, S. S., Li, Y., Chawla, A., Jang, H. L., & Khademhosseini, A. (2017). Development of hydrogels for regenerative engineering. Biotechnology Journal, 12(5), 1600394) 게다가, 제조에 있어서 분해성 화학물질을 구현하는 능력은, 분해 후 분해된 성분들이 신장 여과를 통해 신체 밖으로 배출될 수 있기 때문에, 비침습적 재생의료 응용 분야에서 주된 이점을 구성한다 (Saxena, S., Hansen, C. E., & Lyon, L. A. (2014). Microgel Mechanics in Biomaterial Design. Accounts of Chemical Research, 47(8), 2426-2434 and Ulbrich, K. (1995). Synthesis of novel hydrolytically degradable hydrogels for controlled drug release. Journal of Controlled Release, 34(2), 155-165).
현탁액 상태의, 또는 과립형 벌크 하이드로겔을 위한 빌딩 블록으로서의 하이드로겔 미세입자 (마이크로겔)는, 이들의 광범위하게 조정가능한 기계적 특성, 주입성 및 높은 수준의 조직 유착성 (tissue integration)으로 인해, 최근 수년간 생물의학 응용 분야에서 매력적인 플랫폼으로 등장하였다 (Daly, A. C.; Riley, L.; Segura, T.; Burdick, J. A. Hydrogel Microparticles for Biomedical Applications. Nat Rev Mater 2020, 5 (1), 20-43). 마이크로겔의 물리적 특성 (예: 강성, 메쉬 크기 등)과 직접적으로 연결된 설계 매개변수 중 하나는 분해 속도이다. 중합체의 분해성 가교결합을 위한 메커니즘은 효소적, 광분해성, 가수분해성 메커니즘, 또는 분해 속도에 대해 다양한 정도로 제어할 수 있는 이들의 조합으로 광범위하게 분류될 수 있다 (Koh, J.; Griffin, D. R.; Archang, M. M.; Feng, A.-C.; Horn, T.; Margolis, M.; Zalazar, D.; Segura, T.; Scumpia, P. O.; Di Carlo, D. Enhanced In Vivo Delivery of Stem Cells Using Microporous Annealed Particle Scaffolds. Small 2019, 15 (39), 1903147, Griffin, D. R.; Weaver, W. M.; Scumpia, P. O.; Di Carlo, D.; Segura, T. Accelerated Wound Healing by Injectable Microporous Gel Scaffolds Assembled from Annealed Building Blocks. Nature Mater 2015, 14 (7), 737-744, Muir, V. G.; Qazi, T. H.; Shan, J.; Groll, J.; Burdick, J. A. Influence of Microgel Fabrication Technique on Granular Hydrogel Properties. ACS Biomater. Sci. Eng. 2021, 7 (9), 4269-4281, Foster, G. A.; Headen, D. M.; Gonzalez-Garcia, C.; Salmeron-Sanchez, M.; Shirwan, H.; Garcia, A. J. Protease-Degradable Microgels for Protein Delivery for Vascularization. Biomaterials 2017, 113, 170-175, Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties https://www.science.org/doi/10.1126/science.1169494 (accessed 2021-10-25), and Carleton, M. M.; Sefton, M. V. Injectable and Degradable Methacrylic Acid Hydrogel Alters Macrophage Response in Skeletal Muscle. Biomaterials 2019, 223, 119477). 이러한 방법들의 대부분은 공간적으로나 시간적으로 쉽게 제어되지 않는 자극원에 의존한다 (Jo, Y. S.; Gantz, J.; Hubbell, J. A.; Lutolf, M. P. Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis. Soft Matter 2009, 5 (2), 440-446).
다양한 중합체 망상구조 및 가교결합 구조를 사용하여 하이드로겔의 분해성과 확산성을 조절함으로써 이 플랫폼의 분해 속도와 방출 프로파일을 정교하게 제어할 수 있다 (Jain, E., Hill, L., Canning, E., Sell, S. A., & Zustiak, S. P. (2017). Control of gelation, degradation and physical properties of polyethylene glycol hydrogels through the chemical and physical identity of the crosslinker. Journal of Materials Chemistry B, 5(14), 2679-2691). 효소적, 광분해성, 에스테르 기반 가수분해, 또는 분해 속도에 대해 다양한 정도의 제어가 가능한 이들의 조합을 비롯하여 하이드로겔의 분해성 가교결합에 대한 여러가지 메커니즘이 연구되어 왔다 (Sung, B., Kim, C., & Kim, M.-H. (2015). Biodegradable colloidal microgels with tunable thermosensitive volume phase transitions for controllable drug delivery. Journal of Colloid and Interface Science, 450, 26-33, Stukel, J., Thompson, S., Simon, L., & Willits, R. (2015). Polyethlyene glycol microgels to deliver bioactive nerve growth factor: Microgels to Deliver Bioactive NGF. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 103(2), 604-613, and Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., & Anseth, K. S. (2009). Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science, 324(5923), 59-63). 갈수록 널리 알려진 분해 기술은 서열 특이적 효소 분해에 초점을 맞춰 왔으며, 이로써 방출은 세포에 의해 수행되는 단백질 겔 가수분해 및 내인성 효소 방출에 좌우된다 (Kroger, S. M., Hill, L., Jain, E., Stock, A., Bracher, P. J., He, F., & Zustiak, S. P. (2020). Design of Hydrolytically Degradable Polyethylene Glycol Crosslinkers for Facile Control of Hydrogel Degradation. Macromolecular Bioscience, 20(10), 2000085 and Lueckgen, A., Garske, D. S., Ellinghaus, A., Mooney, D. J., Duda, G. N., & Cipitria, A. (2019). Enzymatically-degradable alginate hydrogels promote cell spreading and in vivo tissue infiltration. Biomaterials, 217, 119294). 펩타이드 가교결합제의 아미노산 서열을 변경함으로써, 분해는 캡슐화되는 세포의 유형과 예상되는 이식 환경에 맞게 조정될 수 있다. 이 방법은 유망한 것으로 밝혀졌지만, 분해는 공간적으로나 시간적으로 쉽게 제어할 수 없는 외부 자극원에 좌우된다 (Jo, Y. S., Gantz, J., Hubbell, J. A., & Lutolf, M. P. (2009). Tailoring hydrogel degradation and drug release via neighboring amino acid-controlled ester hydrolysis. Soft Matter, 5(2), 440-446). 또한, 제조 과정에서 사용되는 대량의 효소절단형 펩타이드 링커들 때문에, 임상적으로 적절한 크기로 확장하는데 비용이 많이 들고, 분해가능한 펩타이드 서열들이 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있으므로, 이들이 면역원성이 될 가능성이 있다 (Griffin, D. R., Archang, M. M., Kuan, C. H., Weaver, W. M., Weinstein, J. S., Feng, A. C., Ruccia, A., Sideris, E., Ragkousis, V., Koh, J., Plikus, M. V., Di Carlo, D., Segura, T., & Scumpia, P. O. (2020). Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing [Preprint]. Bioengineering). 매우 많이 개발된 또 다른 화학으로는 하이드로겔 링커의 광분해성 절단을 들 수 있다. 이 분해 방법은 제조 과정에서 가교결합제로서 광절단성 화합물을 사용하여 외부 광원에 의존한다 (Ji, H., Xi, K., Zhang, Q., & Jia, X. (2017). Photodegradable hydrogels for external manipulation of cellular microenvironments with real-time monitoring. RSC Advances, 7(39), 24331-24337, Villiou, M., Paez, J. I., & del Campo, A. (2020). Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and Tissue Adhesion. ACS Applied Materials & Interfaces, 12(34), 37862-37872, and Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., & Anseth, K. S. (2009). Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science, 324(5923), 59-63). 광분해성 하이드로겔은 조직 유착과 같은 다양한 응용 분야에서 사용되어 왔는데, 이 경우 세포 함유 하이드로겔은 제어된 광원을 통해 단량체로 분해되어 즉각적으로 세포를 방출하고 조직으로부터 분리된다 (Villiou, M., Paez, J. I., & del Campo, A. (2020). Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and Tissue Adhesion. ACS Applied Materials & Interfaces, 12(34), 37862-37872). 이러한 하이드로겔은 방출 속도가 제어될 수 있는 상처 드레싱 및 제어된 세포 요법 치료제와 같은 분야에 유리하다 (Villiou, M., Paez, J. I., & del Campo, A. (2020). Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and Tissue Adhesion. ACS Applied Materials & Interfaces, 12(34), 37862-37872). 그러나, 환자 순응도에 대한 필요와 조직 깊이 제약을 고려할 때, 광분해는 장기간 카고 방출을 위한 최선의 선택이 아닐 가능성이 높다.
조직 공학 및 치료 전달 응용 분야에 유용할 수 있는, 생체내 분해를 제어할 수 있는 하이드로겔이 분명 필요한 실정이다. 본 발명은 이러한 필요성 뿐만 아니라 다른 요구에 대한 사항들에 대해서도 접급하고 있다.
본 발명은 생체 내에서 분해를 제어할 수 있는 가수분해성 하이드로겔을 제공한다. 개시된 하이드로겔은 조직 공학, 약물 전달 및 재생 의료에 이르는 응용 분야에서 유용함을 입증할 수 있다. 과거 개시되었던 분해성 하이드로겔, 예컨대 PEG계 분해성 가교결합제를 사용한 것과 비교하면, 본 발명에 개시된 하이드로겔은 증가된 소수성과 보다 컴팩트한 크기로 인해 제조시 장점이 있다.
적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 함유하는 제1 가교결합제로 가교결합된 중합체 백본을 포함하는 하이드로겔이 제공된다:
상기 식에서, 모든 변수들은 본원에서 정의된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 중합체를 적어도 하나의 화학식 I의 모이어티를 포함하는 제1 가교결합제와 반응시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 하이드로겔을 합성하는 방법이 제공된다.
본원에 기술된 하이드로겔 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료제 전달 조성물도 제공된다. 대상체의 표적 부위에 치료제를 전달하는 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의 본원에 기술된 치료제 전달 조성물을 표적 부위에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법도 제공된다.
본원에 기술된 하이드로겔을 포함하는 세포 배양 배지, 조직 스캐폴드, 생물반응기 및 상처 드레싱도 추가로 제공된다.
조직 성장의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 조직 성장을 촉진하는 방법도 제공되는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
표적 부위를 확인하는 단계; 및
본원에 기술된 하이드로겔의 치료적 유효량을 표적 부위에 투여하는 단계.
본 발명의 하나 이상의 실시형태들에 대한 자세한 내용은 첨부하는 도면과 하기 상세한 설명에 기술한다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점들은 본 상세한 설명과 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a-1k는 가수분해성 마이크로겔이 에스테르 함유 디티올 가교결합제의 첨가에 의해 제조될 수 있음을 나타낸 것이다. 도 1a) PEG-4MAL 마크로머 (macromer)는 선형 PEG FITC로 변형되고 작은 디티올 분자인 DTT 및 EGBMA를 함유하는 연속상을 갖는 흐름 집속형 (flow-focusing) 미세유체 칩을 통해 분할된다. 이로써 형광으로 추적할 수 있는 단분산 마이크로겔이 생성된다. 기준자 1 mm. 도 1b-e) 오일상에서 EGBMA 농도에 따른 마이크로겔의 크기 분포. 삽도는 제조 후 각 마이크로겔의 강도를 나타낸 것인데, 3번의 독립적인 미세유체 실행으로부터 모은, 선형 PEG-FITC 추적기 (최소 n=36)를 사용한 마크로머 백본의 유사한 변형을 나타낸 것이다. 도 1f-g) 수성 완충액에서 마이크로겔 팽윤은 가교결합 단계의 EGBMA 링커의 몰 농도에 정비례한다 (샘플당 최소 n=6임). 도 1h) 용액 중 방출된 PEG-FITC의 추적은 마이크로겔의 EGBMA 농도에 좌우된다. 도 1i) 테이퍼형 미세모세관에 가해진 압력에 의해 변형된 마이크로겔의 3일차 이미지. 도 1j) 수성 완충액에서 3일간 항온배양한 후 다양한 농도의 EGBMA로 제작된 제한된 (confined) 마이크로겔에 대한 전단 응력 vs 변형률, n=6, 총 >60점. 도 1k) 수성 완충액에 다양한 시간 노출 후 모든 마이크로겔 제제의 전단 모듈러스의 정량, n=6. 달리 언급하지 않는 한, 모든 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었으며, 다중 비교를 위한 터키 (Tukey) 보정과 함께 혼합 효과 모델을 이용하여 팽윤 데이터를 분석하였고; 전단 모듈러스는 다중 비교를 위해 터키 보정과 함께 이원 분산분석 ANOVA로 분석하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ****p<0.0001.
도 2a-2d는 단핵구와의 마이크로겔 공동배양이 부착 신호와 염증 신호가 없을 때에는 활성화를 유도하지 않음을 나타낸 것이다. 항온배양 후 48시간째의 세포 생존은, 공동배양에서의 미세입자 존재로 인해 어떠한 변화도 나타내지 않는다. 마커 CD45, F4/80, CD206의 발현은 시험된 모든 그룹들에서 동일하다. 2d-삽도는 공동배양에서 모든 세포 발현 F4/80에 대한 CD206의 발현 배수를 나타낸다. 최소 n=6, 모든 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다. 데이터는 다중 비교를 위한 터키 보정과 함께 일원 분산분석 ANOVA로 분석하였다.
도 3a-3e는 피하 마이크로겔 이식물의 분해가 EGBMA 링커의 농도에 정비례함을 나타낸 것이다. 도 3a) 근적외선 PEG 링커를 사용한 마이크로겔 제조와 등쪽 피하 주머니 주사에 대한 개략도. 주입 후와 이식 후 다양한 시점에서의 이식물 주머니의 예시적 이미지. 도 3b) 1개월의 기간 동안 및 체외이식 후 (수직 점선 이후 시점) 모든 제제들에 대해 정규화된 평균 방사 효율. 도 3c-e) 이식 후 0일, 9일, 25일째에 정규화된 방사 효율의 정량. 모든 데이터들은 평균 ± s.d.로 나타내며, DTT의 경우 최소 n=5 수용체, 다른 모든 그룹의 경우 n=10임. 일원 분산분석 ANOVA와 던네트 (Dunnett) 다중 비교 분석을 사용하여 P 값을 계산하였다. **p < 0.05, ***p < 0.0005, ****p<0.0001임.
도 4a-4g는 주사후 7일차에 합성 마이크로겔 이식물의 분해에 의해 골수 세포 동원과 분극이 조절되고 있음을 나타낸 것이다. 비분해성 및 분해성 마이크로겔의 다양한 제제를 포함하는 피하 이식물 포켓에서 골수 마커 CD11b, F4/80, MHCII 및 CD206의 유세포 분석과 정량. 모든 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다. 최소 n=4/수용체. P 값은 일원 분산분석 ANOVA를 사용하여 계산하였고, 오류 발견율을 조절하여 다중 비교를 보정하였다.
도 5a-5h는 주사후 7일차에 합성 마이크로겔 이식물의 분해에 의해 림프구 세포 동원이 조절되고 있음을 나타낸 것이다. 비분해성 및 분해성 마이크로겔의 다양한 제제를 포함하는 피하 이식물 포켓에서 림프구 마커 CD3, CD4, CD8, CD25 및 PD-1의 유세포 분석과 정량. 모든 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었다. 최소 n=4/수용체. P 값은 일원 분산분석 ANOVA를 사용하여 계산하였고, 오류 발견율을 조절하여 다중 비교를 보정하였다.
도 6a-6f는 이식가능한 합성 마이크로겔에 대한 사이토카인 반응이 역동적이고 이식가능한 물질의 분해 가능성에 의해 변화될 수 있는 IFN-γ 반응에 의해 좌우됨을 나타낸 것이다. 도 6a) 다양한 합성 마이크로겔 제제를 투여받은 동물들의 이식물 조직에서 측정한 32개의 사이토카인의 주성분 분석. 화살표의 색상과 방향은 PCA의 각 차원에 대한 기여도를 나타낸다. 도 6b) 측정된 모든 사이토카인들에 대한 사이토카인 상관관계는 피어슨의 상관 계수를 사용하여 평가한다. 도 6c) 왼쪽: 피어슨의 상관관계, 계통수 및 사이토카인 명칭을 기반으로 한 사이토카인의 계층적 군집분석은 모듈 멤버십 (module membership)을 의미한다. 도 6d) IFN-γ에 대한 모든 사이토카인들에 대한 상관관계 플롯. 도 6e-6f) 상자 플롯은 GM-CSF와 IL-4에 대한 사이토카인 농도를 나타낸 것으로, 원래 값은 log10 척도로 플롯팅하였다. 수용체당 최소 n=6. 제시된 P 값들은 보정된 주변 평균값 (estimated marginal mean, EMM) 비교에서 나온 것이다.
도 7은 가수분해되기 쉬운 에틸렌 링커를 미세입자 가교결합에 사용하여 치료제 전달을 위한 분해성 액적 미세유체 기반 마이크로겔을 제조하는 것을 나타낸 것이다. 생체내 에스테르 기반 분해에 의해 부여되는 조정가능성 및 분해성은 이식 부위에 대한 면역 세포의 침투와 숙주 면역 분극을 조절한다.
도 8은 제조 후 PEG-4MAL 마크로머 및 마이크로겔의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 9a-9c는 모세관 마이크로역학에 대한 실험적 설정을 나타낸 것이다. 도 9a) 테이퍼형 유리 마이크로피펫 (Fivephoton Biochemicals)의 치수는 다음과 같다: 팁 내경 = 50 ㎛; 베이스 외경 = 1.5 mm; 길이 = 5.5 cm; 테이퍼 스타일 = 장형. 고정밀 압력 조절기 (Elveflow)로 마이크로겔을 함유하고 있는 마이크로피펫에 압력을 가하였다. 상기 마이크로피펫을 1% BSA에 침지하여 최적의 흐름 역학을 촉진시켰다. 외부에서 가해진 압력이 내부 탄성 응력과 균형을 이룰 때, 마이크로겔은 변형되어 평형에 도달할 것이다. 마이크로피펫 팁 아래의 현미경 (EVOS)으로 이미지 (10X)를 얻은 후, ImageJ에서 분석하였다. 도 9b) 테이퍼형 영역에서의 마이크로겔 기하학. 마이크로겔은 평균 반경 R밴드와 평균 길이 L밴드로 벽과 접촉하였다. 테이퍼 각도는 θ이다. 압력 p가 증가하면, L밴드는 증가하고 R밴드는 감소한다. 탄성 특성은, 과거 설명된 바와 같이 (Wyss et al, Soft Matter, 2010), 이러한 측정치를 통해 계산되었다. 도 9c) 압력 증가에 따라 변형되는 마이크로겔의 일련의 이미지들.
도 10은 모든 (분해성 및 비분해성) 마이크로겔 제제들로 처리한 RAW 264.7 대식세포의 시험관내 세포독성을 나타낸 것이다. 그래프는 Alamar Blue 분석으로 측정한 7일간의 공동배양 동안의 세포 생존력을 나타낸다. 데이터는 평균의 평균 표준 편차를 나타낸다 (n = 4). 일원 분산분석 ANOVA에서는 통계적 차이가 발견되지 않았다.
도 11a-11d는 단핵구와의 마이크로겔 공동배양이 부착 신호와 염증 신호가 없을 때에는 활성화를 유도하지 않음을 나타낸 것이다. 도 11a-11d) 항온배양 후 96시간째의 세포 생존은, 공동배양에서의 미세입자 존재로 인해 어떠한 변화도 나타내지 않는다. 마커 CD45, F4/80, CD206의 발현은 시험된 모든 그룹에서 일치한다. 11d-삽도는 공동배양에서 모든 세포 발현 F4/80에 대한 CD206의 배수 발현을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타내었고, n=3이다. 데이터는 다중 비교를 위한 터키 보정과 함께 일원 분산분석 ANOVA로 분석하였다.
도 12a-12f는 모든 시점에 있어서 log10 척도 상에 플롯팅한 원래 값의 사이토카인 농도와 보정된 주변 평균값 (EMM) 비교를 보여주는 박스 플롯을 제공한다. 그룹당 n=6.
도 13a-13d는 모든 시점에 있어서 log10 척도 상에 플롯팅한 원래 값의 사이토카인 농도와 보정된 주변 평균값 (EMM) 비교를 보여주는 박스 플롯을 제공한다. 그룹당 n=6.
도 14는 등쪽 피하 공간에 주사된 마이크로겔의 이식 후 30일째의 H&E 염색이다.
도 15는 주사 후 30일 후에 등쪽 마이크로겔 이식물의 면역조직화학 평가를 나타낸 것이다. 샘플들을 범 대식세포 마커 CD68 (빨간색)과 핵 마커 DAPI (파란색)에 대해 염색하였다. 흰색 점선으로 나타낸 마이크로겔 영역. 삽도는 마이크로겔 주변 영역의 20X 예시적 이미지를 나타낸다. 삽도의 기준자는 20 ㎛이고, 10X 이미지는 50 ㎛이다.
도 16a 및 16b는 시험관내 및 생체내 분해성 하이드로겔 특성을 나타낸 것이다. 도 16a) 마우스의 피하 공간에 이식된 하이드로겔의 생체내 추적. 도 16b) 마이크로겔의 국소화 및 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 IVIS 이미지.
다양한 도면에서 유사한 참조 기호는 유사한 요소를 나타낸다.
본 발명의 하기의 상세한 설명을 현재 알려진 최선의 실시형태로 본 발명에 대한 실시가능한 교시로서 제공한다. 전술한 설명 및 관련 도면들에 제시된 교시의 유용성을 갖는 개시된 조성물과 방법이 속하는 기술 분야의 숙련자라면 누구나 본원에 개시된 많은 변형과 다른 실시형태들을 상정할 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명은 개시된 특정 실시형태들에 국한되지 않으며, 이의 변형과 다른 실시형태들도 첨부된 청구항의 범위 내에 포함시키고자 한다. 숙련된 기술자라면 누구나 본원에 설명된 측면들의 많은 변형과 적용에 대해 인지하고 있을 것이다. 이러한 변형과 적용도 본 발명의 교시에 포함시키고자 하며, 본원의 청구범위에 포함시키려 한다.
본원에서는 특정 용어들이 사용되었으나, 이들은 일반적이고 설명적인 의미로만 사용된 것이지, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서를 읽을 때 당업자에게 명백하듯이, 본원에 설명되어 예시된 개별적인 실시형태들은 각각, 본 발명의 범위와 개념으로부터 벗어남이 없이, 임의의 다른 여러 실시형태들의 특징들로부터 쉽게 분리되거나 이러한 특징들과 조합될 수 있는 뚜렷이 구분되는 구성요소와 특징들을 갖는다.
언급된 임의의 방법은 언급된 사건의 순서대로, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서대로 수행될 수 있다. 즉, 달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 본원에 설명된 방법이나 측면에서 그의 단계들이 특정한 순서로 수행되어야 함을 요하는 것으로 해석하지 않는다. 따라서, 어떤 방법 청구항이, 청구범위나 상세한 설명에서 해당 단계들이 특정한 순서에 국한되어야 한다고 구체적으로 언급하지 않는 경우라면, 어떤 면에서도 순서를 추론하고자 하지 않는다. 이는 단계들의 배열 또는 작업 흐름과 관련된 논리의 문제, 문법적 구성 또는 구두점에서 파생된 일반적인 의미, 또는 명세서에 설명된 측면들의 수나 유형을 비롯한, 해석에 있어서 가능한 임의의 비명시적 기반에도 적용된다.
본원에 언급된 모든 간행물들은 해당 간행물들이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질들을 개시 및 설명하기 위해 인용에 의해 본원에 포함된다. 본원에 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 공개된 것들에 대해서만 제공된다. 본원의 그 어떤 내용들도, 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 나아가, 본원에 제공된 발행일은 실제 발행일과 다를 수 있으므로, 별도의 확인이 필요할 수도 있다.
본원에 사용된 용어들은 단지 특정한 실시형태들을 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 한정하려고 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 기술 용어들은 개시된 조성물과 방법이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 또한, 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어들은 명세서 및 관련 기술의 내용상 이러한 용어들의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 명시적으로 정의되어 있지 않는 한 이상적이거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서도 안 된다.
본 발명의 다양한 측면들을 설명하기 전에, 하기의 정의들을 제공하며 달리 명시하지 않는 한 이렇게 사용되어야 한다. 본 발명의 다른 곳에서는 추가의 용어들이 정의될 수도 있다.
본원에 사용된 "~을 포함하는"은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 특정하는 것으로 해석되지만, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 구성요소 또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지는 않는다. 또한, "~에 의한", "~를 포함하는", "~를 포함하다", "~로 이루어진", "~를 함유하는", "~를 함유하다", "포함된", "~를 수반하는", "~를 수반하다", "수반된" 및 "~와 같은"이라는 용어들은 각각 개방적이고 비제한적인 의미로 사용되며 서로 교환하여 사용될 수 있다. 나아가, "~를 포함하는"이라는 용어는 "~로 필수적으로 이루어지는" 및 "~로 이루어지는"이라는 용어에 포함되는 예와 측면들도 포함하고자 한다. 이와 유사하게, "~로 필수적으로 이루어지는"이라는 용어는 "~로 이루어지는"이라는 용어에 포함되는 예를 포함하고자 한다.
명세서와 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는, 문맥상 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 복수의 지시대상도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포", "조직" 또는 "하이드로겔"에 대한 언급은, 이에 제한되지는 않지만, 2개 이상의 이러한 세포, 조직 또는 하이드로겔 등을 포함한다.
본원에서는 비율, 농도, 양과 기타 수치 데이터가 범위 형식으로 표현될 수 있다는 점에 유의한다. 각 범위에서의 끝점들은 다른 끝점과 관련하여 그리고 다른 끝점과는 독립적으로 모두 중요하다는 점도 추가로 이해할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값들이 존재하고, 각 값들 역시 해당 값 자체에 더하여 "약" 그 특정 값으로 본원에 개시된다는 점도 이해한다. 예를 들어, "10"이라는 값이 개시된다면, "약 10"도 개시되는 것이다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정값에서부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정값까지로 나타낼 수 있다. 이와 유사하게, 선행사 "약"을 사용하여 값을 근사치로 나타내는 경우, 그 특정 값이 추가의 측면을 형성함도 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, "약 10"이라는 값이 개시된다면, "10"도 개시되는 것이다.
범위를 나타내는 경우, 추가의 측면은 하나의 특정 값에서부터, 및/또는 또 다른 특정 값까지를 포함한다. 예를 들어, 언급한 범위에 해당 경계점 중 하나 또는 2개 모두 포함되는 경우, 포함된 경계점 중 하나 또는 2개 모두를 제외하는 범위도 본 발명에 포함되는데, 예를 들어 "x 내지 y"라는 말은 'x'에서 'y'까지의 범위 뿐만 아니라, 'x'보다 크고 'y'보다 작은 범위도 포함한다. 범위는 상한, 예컨대 '약 x, y, z, 또는 그 이하'와 같이 나타낼 수도 있으며, '약 x', '약 y', 및 '약 z'의 특정 범위들 뿐만 아니라 'x보다 작은', y보다 작은', 및 'z보다 작은'의 범위들도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 이와 마찬가지로, '약 x, y, z 또는 그 이상'이라는 말은 '약 x', '약 y', '약 z'의 특정 범위들 뿐만 아니라 'x보다 큰', y보다 큰', 및 'z보다 큰'의 범위들도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 'x'와 'y'가 수치값인 "약 'x' 내지 'y'"라는 말에는 "약 'x' 내지 약 'y'"가 포함된다.
이러한 범위 형식은, 편리함과 간결성을 위해 사용되는 것이기 때문에, 해당 범위의 경계점으로 명시적으로 언급된 수치 값들을 포함할 뿐만 아니라 해당 범위 내에 포함된 모든 개별 수치 값들 또는 하위범위들을, 마치 상기 각 수치 값과 하위범위들이 명시적으로 언급되어 있는 것처럼 포함하도록 유연한 방식으로 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예시를 위해, "약 0.1% 내지 5%"의 수치 범위는 약 0.1% 내지 약 5%의 명시적으로 언급된 값 뿐만 아니라, 표시된 범위 내의 개별 값들 (예컨대, 약 1%, 약 2%, 약 3% 및 약 4%)과 하위범위들 (예컨대, 약 0.5% 내지 약 1.1%; 약 5% 내지 약 2.4%; 약 0.5% 내지 약 3.2%, 및 약 0.5% 내지 약 4.4% 및 기타 가능한 하위범위들)도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 "약", "대략", "~ 또는 약" 및 "실질적으로"라는 용어들은, 논의되는 양 또는 값이 청구범위에 언급되거나 본원에 교시된 것과 동일한 결과 또는 효과를 제공하는 정확한 값(들)임을 의미한다. 즉, 양, 크기, 조성, 매개변수 및 기타 수량과 특성들은 정확하지 않고 정확할 필요도 없지만, 허용 오차, 환산 인수, 반올림, 측정 오차 등, 및 동등한 결과 또는 효과가 얻어지도록 당업자에게 공지된 다른 요인들을 반영하여, 필요에 따라 근사치 및/또는 더 크거나 작을 수도 있다. 어떤 상황에서는, 동등한 결과나 효과를 제공하는 값을 타당하게 측정할 수 없다. 그러한 경우, 본원에 사용된 "약" 및 "~ 또는 약"은, 달리 명시되거나 암시되지 않는 한, 해당 명목값이 ±10% 변동을 나타냄을 의미하는 것으로 일반적으로 이해한다. 일반적으로, 양, 크기, 조성, 매개변수 또는 기타 양이나 특성들은 명시적으로 언급되어 있는지의 여부와 관계없이 "약", "대략" 또는 "~ 또는 약"이다. "약", "대략" 또는 "~ 또는 약"이 정량적 값 앞에 사용되는 경우, 달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 매개변수는 특정한 정량적 값 자체도 포함하는 것으로 이해한다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하거나 바람직하지 않은 증상에 영향을 주기에는 충분하지만 일반적으로 유해한 부작용을 유발하기에는 불충분한 양을 의미한다. 임의의 특정 환자에 대한 특정한 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 질병과 해당 질병의 중증도; 사용된 특정 조성물; 해당 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 특정 조성물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 조성물과 병용하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 건강 전문의의 지식과 전문성 내에서 의료 업계에서 익히 공지되어 있을 수 있는 이와 유사한 요인들을 비롯한 다양한 요인들에 따라 달라질 것이다. 특정 질병이나 질환을 치료하는 경우, 경우에 따라서는 원하는 반응이 해당 질병이나 질환의 진행을 억제하는 것일 수도 있다. 이는 일시적으로 해당 질병의 진행을 늦추는 것만을 포함할 수도 있다. 그러나, 어떤 경우에는, 해당 질병의 진행을 영구적으로 중단하는 것이 바람직할 수도 있다. 이것은 임의의 특정 질병에 대해 당업자에게 공지된 일상적인 진단 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 질병 또는 질환의 치료에 대한 원하는 반응은 해당 질병 또는 질환의 발병을 지연시키거나 심지어 그 발병을 방지하는 것일 수도 있다.
예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 조성물의 용량을 시작한 뒤, 원하는 효과가 달성될 때까지 해당 용량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 필요한 경우, 1일 유효 용량을 투여 목적에 따라 다회분 용량으로 분할할 수도 있다. 따라서, 단회 용량 조성물은 이러한 양 또는 해당 1일 용량을 구성하는 이의 약수를 함유할 수도 있다. 사용금기 사유가 있는 경우라면 각 담당의는 용량을 조정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약리학적 제제의 최대 용량 (단독으로 또는 다른 치료제와 조합하는 경우), 즉 타당한 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자라면 누구나, 의학적인 이유, 심리적인 이유 또는 사실상 다른 모든 이유들로 환자가 저용량 또는 견딜만한 용량을 주장할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
개시된 조성물의 치료학적 유효량에 대한 반응은, 예를 들어 치료제 또는 약리학적 제제의 투여 후에 질병 증상의 감소 또는 제거와 같은 해당 치료제 또는 약제의 생리학적 효과를 측정하여 측정될 수 있다. 다른 분석법들도 당업자에게 알려져 있을 것이어서, 반응 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 치료제의 양은, 예를 들어 개시된 조성물의 양을 증가 또는 감소시킴으로써, 투여되는 개시된 조성물을 변경함으로써, 투여 경로를 변경함으로써, 투여 시점을 변경하는 등에 의해 다르게 할 수 있다. 용량은 다양할 수 있고, 하루 또는 수일간 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 주어진 종류의 의약품의 경우의 적절한 용량에 대한 지침은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방적 유효량"은 질병 또는 질환의 발병 또는 개시를 예방하는데 효과적인 양을 의미한다.
본원에 사용된 "예방하다" 또는 "예방하는"는 이라는 용어는, 특히 사전 조치에 의해, 어떤 일이 발생하는 것을 배제, 회피, 제거, 미연에 방지, 중지 또는 방해하는 것을 의미한다. 본원에서 감소하다, 억제하다 또는 예방하다라는 말이 사용되는 경우, 구체적으로 달리 지시가 없는 한, 다른 두 단어의 사용도 명시적으로 개시되는 것으로 이해한다.
본원에 사용된 "선택적"또는 "선택적으로"라는 용어들은, 차후 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 상세한 설명에는 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 척추동물 유기체, 예컨대 포유동물 (예컨대, 인간)을 지칭할 수 있다. "대상체"는 세포, 세포군, 조직, 장기 또는 유기체, 바람직하게는 인간 및 그의 구성요소를 지칭할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "~를 치료하는" 및 "치료"는 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미할 수 있다. 상기 효과는 조직 결함과 같은 질병, 증상 또는 이의 병태를 예방하거나 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있지만, 반드시 예방적일 필요는 없다. 상기 효과는 질병, 질환, 증상 또는 해당 질병, 장애 또는 질환에 기인한 부작용의 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"라는 용어는 대상체, 특히 인간의 장애에 대한 임의의 치료를 포함할 수 있고, 하기 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발병을 저지하는 것; 및 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병 및/또는 그의 증상이나 병태를 경감 또는 개선시키는 것. 본원에 사용된 "치료"라는 용어는 치료적 치료 단독, 예방적 치료 단독, 또는 치료적 치료와 예방적 치료 양자 모두를 지칭할 수 있다. 치료가 필요한 개체 (치료가 필요한 대상체)에는 이미 해당 장애가 있는 개체 및/또는 해당 장애를 예방해야 하는 개체가 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "~을 치료하는"이라는 용어는 질병, 장애 또는 병태를 억제하는 것, 예컨대 그의 진행을 방해하는 것; 및 질병, 장애 또는 병태를 완화시키는 것, 예컨대 질병, 장애 및/또는 병태의 퇴행을 유발시키는 것을 포함할 수 있다. 질병, 장애 또는 병태를 치료한다는 것은, 근본적인 병태 생리학이 영향을 받지 않는다 하더라도, 특정 질병, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것, 예컨대 진통제 투여에 의해, 이러한 제제가 통증의 원인을 치료하지 못한다 하더라도, 대상체의 통증을 치료하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "용량", "단위 용량" 또는 "복용량"은 대상체에 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위로서, 각 단위가 개시된 화합물 및/또는 이의 약제학적 조성물의 사전에 결정된 양을 함유하여 그의 투여와 관련된 원하는 반응(들)을 유도하는 것인 단위를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "치료적"이라는 말은 질병, 장애, 병태 또는 부작용을 치료, 치유 및/또는 완화시키는 것을 지칭하거나, 또는 질병, 장애, 병태 또는 부작용의 진행 속도를 감소시키는 것을 의미할 수 있다.
화합물은 표준 명명법을 사용하여 설명된다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 기술 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기술된 화합물들은, 문맥상 달리 지시되거나 제외되지 않는 한, 각각 구체적으로 기술된 것처럼, 거울상이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 라세미체 및 기타 이성질체, 예컨대 로타머를 포함한다. 본원에 제공된 화합물들은 키랄 중심을 함유할 수 있음을 이해한다. 이러한 키랄 중심은 (R-) 또는 (S-) 배열일 수 있다. 본원에 제공된 화합물들은 거울상이성질체적으로 순수하거나, 또는 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체 혼합물일 수도 있다. 본원에 제공된 화합물둘의 키랄 중심은 생체 내에서 에피머화를 겪을 수 있음을 이해한다. 따라서, 당업자라면 누구나, 생체 내에서 에피머화를 겪는 화합물의 경우, (R-) 형태의 화합물 투여가 (S-) 형태의 화합물의 투여와 동등함을 알 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 쐐기 또는 점선이 아닌 실선으로만 나타낸 화학 결합을 갖는 화학식은 각각의 가능한 이성질체, 예컨대 각각의 거울상이성질체, 부분입체이성질체와 메조 화합물, 및 이성질체의 혼합물, 예를 들어 라세미체 또는 스칼레믹 (scalemic) 혼합물을 고려한다.
두 문자 또는 기호 사이에 있지 않은 대시 ("-")는 치환기에 대한 부착 지점을 나타내는 데 사용된다. 예를 들어, -(C=O)NH2는 케토 (C=O) 기의 탄소를 통해 부착된다.
본원에 사용된 "치환된"이라는 용어는, 지정된 원자 또는 기 상의 임의의 하나 이상의 수소가 상기 지정된 원자의 정상 원자가를 초과하지 않고 생성된 화합물이 안정하다는 조건 하에, 나타낸 그룹으로부터 선택된 모이어티로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환기가 옥소 (즉, =O)인 경우라면, 해당 원자 상의 2개의 수소가 대체된다. 예를 들어, 옥소로 치환된 피리딜기는 피리딘이다. 치환기 및/또는 변수들의 조합은, 이러한 조합이 안정한 화합물 또는 유용한 합성 중간체를 생성하는 경우에만 허용가능하다. 안정한 활성 화합물은, 분리될 수 있고 저장 수명이 적어도 1개월인 제형으로 제제화될 수 있는 화합물을 의미한다. 활성 화합물의 안정적인 제조 중간체 또는 전구체는 반응이나 기타 사용에 필요한 기간 내에 분해되지 않는다면 안정적이다. 안정한 모이어티 또는 치환기는 사용에 필요한 기간 내에 분해, 반응 또는 분해되지 않는 것들이다. 불안정한 모이어티의 비제한적인 예로는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있어서 식별가능한, 헤테로원자들을 불안정한 배열로 결합하는 것들을 들 수 있다.
임의의 적절한 기는, 안정한 분자를 형성하여 본 발명의 원하는 목적을 충족시키는 "치환된" 또는 "선택적으로 치환된" 위치에 존재할 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 알킬, 할로알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클, 알데하이드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할로, 하이드록시, 케토, 니트로, 시아노, 아지도, 옥소, 실릴, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드, 설포닐아미노 또는 티올을 포함한다.
"알킬"은 직쇄 또는 분지쇄형 포화 지방족 탄화수소 기이다. 특정 실시형태에서, 알킬은 C1-C2, C1-C3 또는 C1-C6이다 (즉, 알킬 사슬의 길이는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소일 수 있음). 본 명세서에 사용된 특정 범위는 독립적인 종으로서 기술된 범위의 각 구성원의 길이를 갖는 알킬기를 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 C1-C6알킬은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 나타내며, 이들 각각은 독립적인 종으로 기술하고자 하며, 본 명세서에 사용된 C1-C4알킬은 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 나타내며, 이들 각각은 독립적인 종으로 기술하고자 한다. C0-Cn알킬이 본원에서 또 다른 기, 예를 들어 (C3-C7사이클로알킬)C0-C4알킬, 또는 -C0-C4(C3-C7사이클로알킬)과 함께 사용되는 경우, 표시된 기 (이 경우, 사이클로알킬)은 단일 공유 결합 (C0알킬)에 의해 직접 결합되거나, 또는 알킬 사슬 (이 경우, 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자)에 의해 부착된다. 알킬은 다른 기들, 예컨대 -O-C0-C4알킬(C3-C7사이클로알킬)에서와 같이 헤테로원자를 통해 부착될 수도 있다. 알킬의 예에는, 이에 제한되지는 않지만, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄 및 2,3-디메틸부탄을 포함한다. 한 실시형태에서, 알킬기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"사이클로알킬"은 포화된 모노 또는 다중 사이클릭 탄화수소 고리 시스템이다. 2 이상의 고리로 구성되는 경우, 해당 고리는 융합되거나 가교된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 일반적인 사이클로알킬 기의 비제한적 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸이 포함된다. 한 실시형태에서, 사이클로알킬기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"알케닐"은, 사슬을 따라 안정한 지점에서 발생할 수 있는, 각각 독립적으로 시스 또는 트랜스인, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄형 또는 분지쇄형 지방족 탄화수소기이다. 비제한적인 예에는 C2-C4알케닐 및 C2-C6알케닐이 포함된다 (즉, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 가짐). 본원에 사용된 특정 범위는 알킬 모이어티에 대해 상술한 바와 같이 독립적인 종으로서 기재된 범위의 각 구성원을 갖는 알케닐기를 나타낸다. 알케닐의 예로는 에테닐 및 프로페닐을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 한 실시형태에서, 알케닐기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"알키닐"은, 사슬을 따라 임의의 안정한 지점에서 발생할 수 있는, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄형 또는 분지쇄형 지방족 탄화수소기, 예를 들어 C2-C4알키닐 또는 C2-C6알키닐이다 (즉, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 가짐). 본원에 사용된 특정 범위는 알킬 모이어티에 대해 상술한 바와 같이 독립적인 종으로서 기재된 범위의 각 구성원을 갖는 알키닐기를 나타낸다. 알키닐의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 에티닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐 및 5-헥시닐을 포함한다. 한 실시형태에서, 알키닐기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"알콕시"는 산소 가교 (-O-)를 통해 공유 결합된 상기 정의된 알킬기이다. 알콕시의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 2-부톡시, tert-부톡시, n-펜톡시, 2-펜톡시, 3-펜톡시, 이소펜톡시, 네오펜톡시, n-헥속시, 2-헥속시, 3-헥속시 및 3-메틸펜톡시를 포함한다. 이와 유사하게, "알킬티오" 또는 "티오알킬" 기는 황 가교 (-S-)를 통해 공유 결합된 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬기이다. 한 실시형태에서, 알콕시기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"알카노일"은 카르보닐 (C=O) 가교를 통해 공유 결합된 상기 정의된 알킬기이다. 카르보닐 탄소는 탄소의 수에 포함되는데, 예를 들어 C2알카노일은 CH3(C=O)- 기이다. 한 실시형태에서, 알카노일기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
"할로" 또는 "할로겐"은 독립적으로 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도 중 임의의 것이다.
"아릴"은 방향족 고리(들)에 탄소만 포함하는 방향족기이다. 한 실시형태에서, 아릴 기는 1 내지 3개의 개별 또는 융합된 고리를 함유하고, 고리 구성원으로서 헤테로원자를 갖지 않는 6 내지 14개 또는 18개의 고리 원자이다. 표시된 경우, 이러한 아릴기는 탄소 또는 탄소가 아닌 원자 또는 기로 추가로 치환될 수 있다. 이러한 치환은, 예를 들어 3,4-메틸렌디옥시페닐기를 형성하기 위해, N, O, B, P, Si 및 S로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 4원 내지 7원 또는 5원 내지 7원 포화 또는 부분 불포화 사이클릭 기로의 융합을 포함할 수 있다. 아릴 기에는, 예를 들어 페닐 및 나프틸 (1-나프틸 및 2-나프틸 포함)이 포함된다. 한 실시형태에서, 아릴기는 펜던트형이다. 펜던트형 고리의 예로는 페닐기로 치환된 페닐기를 들 수 있다. 한 실시형태에서, 아릴기는 본원에 설명된 바와 같이 선택적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클"은 포화 및 부분 포화된 (N, O 및 S로부터 선택될 수 있는) 헤테로원자 함유 고리 라디칼을 지칭한다.헤테로사이클이라는 용어는 모노사이클릭 3 내지 12원 고리 뿐만 아니라 바이사이클릭 5 내지 16원 고리 시스템 (융합, 가교, 또는 스피로 바이사이클릭 고리 시스템을 포함할 수 있음)을 포함한다. 여기에는 -OO-, -OS- 및 -SS- 부분을 포함하는 고리는 포함되지 않는다. 포화 헤테로사이클 기의 예로는, 1 내지 4개의 질소 원자를 함유하는 포화 4원 내지 7원 모노사이클릭 기 [예컨대, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 아제티디닐, 피페라지닐 및 피라졸리디닐]; 1 내지 2개의 산소 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 포화 4원 내지 6원 모노사이클릭 기 [예컨대, 모르폴리닐]; 및 1 내지 2개의 황 원자 및 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 포화 3원 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기 [예컨대, 티아졸리디닐]을 포함한다. 부분 포화된 헤테로사이클 라디칼의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 디하이드로티에닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로푸릴, 및 디하이드로티아졸릴을 포함한다. 부분 포화 및 포화된 헤테로사이클 기의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 피라졸리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로피라닐, 티아졸리디닐, 디하이드로티에닐, 2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥사닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 디하이드로벤조티에닐, 디하이드로벤조푸릴, 이소크로마닐, 크로마닐, 1,2-디하이드로퀴놀릴, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀릴, 1,2,3,4-테트라하이드로-퀴놀릴, 2,3,4,4a,9,9a-헥사하이드로-1H-3-아자-플루오레닐, 5,6,7-트리하이드로-1,2,4-트리아졸로[3,4-a]이소퀴놀릴, 3,4-디하이드로-2H-벤조[1,4]옥사지닐, 벤조[1,4]디옥사닐, 2,3-디하이드로-1H-벤조[d]이소타졸-6-일, 디하이드로피라닐, 디하이드로푸릴 및 디하이드로티아졸릴을 포함한다. 바이사이클릭 헤테로사이클은, 헤테로사이클릭 라디칼이 아릴 라디칼과 융합된 기를 포함한다 (여기서, 부착 지점은 헤테로사이클 고리임). 바이사이클릭 헤테로사이클에는 카보사이클릭 라디칼과 융합된 헤테로사이클릭 라디칼도 포함된다. 대표적인 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 1 내지 5개의 질소 원자를 함유하는 부분 불포화 축합 헤테로사이클릭 기, 예를 들어 인돌린과 이소인돌린, 1 내지 2개의 산소 원자와 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 부분 불포화 축합 헤테로사이클릭 기, 1 내지 2개의 황 원자와 1 내지 3개의 질소 원자를 함유하는 부분 불포화 축합 헤테로사이클릭 기, 및 1 내지 2개의 산소 또는 황 원자를 함유하는 포화 축합 헤테로사이클릭 기를 포함한다.
"헤테로아릴"은 N, O, S, B 및 P로부터 선택된 (일반적으로 N, O 및 S로부터 선택됨) 1 내지 4개, 또는 일부 실시형태에서는 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 (나머지 고리 원자들은 탄소임) 안정한 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 다중사이클릭 방향족 고리이거나, 또는 N, O, S, B로부터 선택된 (나머지 고리 원자들은 탄소임) 1 내지 4개, 일부 실시형태에서는 1 내지 3개 또는 1 내지 2개의 (나머지 고리 원자들은 탄소임) 헤테로원자를 함유하는 적어도 하나의 5원, 6원 또는 7원 방향족 고리를 함유하는 안정한 바이사이클릭 또는 다중사이클릭 방향족 고리이다. 한 실시형태에서, 유일한 헤테로원자는 질소이다. 한 실시형태에서, 유일한 헤테로원자는 산소이다. 한 실시형태에서, 유일한 헤테로원자는 황이다. 모노사이클릭 헤테로아릴 기는 보통 5 내지 6개의 고리 원자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 바이사이클릭 헤테로아릴기는 8원 내지 10원 헤테로아릴기, 즉 1개의 5원, 6원 또는 7원 방향족 고리가 제2 방향족 또는 비방향족 고리에 융합 (여기서, 부착 지점은 방향족 고리임)되어 있는 8개 또는 10개의 고리 원자를 함유하는 기이다. 헤테로아릴기의 S 및 O 원자의 총수가 1을 초과하는 경우에는, 이러한 헤테로원자들은 서로 인접하고 있지 않다. 한 실시형태에서, 헤테로아릴기의 S 및 O 원자의 총수는 2 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 헤테로아릴기의 S 및 O 원자의 총수는 1 이하이다. 헤테로아릴 기의 예에는, 이에 제한되지는 않지만, 피리디닐, 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 퓨리닐, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이 포함된다.
적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 함유하는 제1 가교결합제로 가교결합된 중합체 백본을 포함하는 하이드로겔이 제공된다:
상기 식에서,
m과 n은 독립적으로 1 또는 2이고;
A는 C2-C10 알킬이며;
는 제1 가교결합제 내의 모이어티에 대한 부착 지점이다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, m은 1이다. 화학식 I의 일부 실시형태에서, m은 2이다. 화학식 I의 일부 실시형태에서, n은 1이다. 화학식 I의 일부 실시형태에서, n은 2이다.
화학식 I의 일부 실시형태에서, A는 C2 알킬, C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬, C6 알킬, C7 알킬, C8 알킬, C9 알킬 또는 C10 알킬로부터 선택된다. 화학식 I의 일부 실시형태에서, A는 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸 및 2,3-디메틸부틸로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화학식 I의 모이어티는 하기로부터 선택될 수 있다:
및 .
중합체 백본은 하이드로겔의 제조에 사용되는 임의의 중합체 또는 중합체들의 조합으로 이루어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 하이드로겔은 하나 이상의 다작용성 분자 또는 중합체를 가교결합시켜 형성된 중합체 망상구조이다. 생성된 중합체 망상구조는 친수성으로, 수성 환경에서 팽윤하여 겔유사 물질, 즉 하이드로겔을 형성한다. 일반적으로, 하이드로겔은 가교결합제 (예컨대, 본원에 기술된 제1 가교결합제)에 결합된 백본을 포함한다.
하이드로겔은 수불용성, 친수성, 높은 물 흡수성 및 팽윤성을 특징으로 한다. 하이드로겔의 분자 성분, 단위 또는 세그먼트는 상당 부분의 친수성 성분, 단위 또는 세그먼트, 예컨대 수소 결합이 가능하거나 이온 종 또는 해리가능한 종, 예컨대 산 (예: 카르복실산, 포스폰산, 설폰산, 설핀산, 포스핀산 등), 염기 (예: 아민기, 양성자 수용기 등)를 갖는 세그먼트, 또는 물에 침지되는 경우에 이온 특성을 나타내는 기타 기들 (예: 설폰아미드)을 특징으로 한다. 아크릴로일기 (및 정도는 덜하지만 메타크릴로일기) 및 아크릴 중합체 또는 옥시알킬렌 단위를 포함하거나 이로 말단화된 중합체 사슬 (예: 폴리옥시에틸렌 사슬 및 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체 사슬) 부류도 친수성 중합체 내에 존재할 수 있는 친수성 세그먼트로서 익히 인식되어 있다. 대표적인 수불용성 중합체 조성물을 아래에 제공하지만, 당업계에 공지된 전체 하이드로겔 물질의 부류들을 다양한 수준으로 사용할 수 있다. 하기에 제시된 산성기를 함유하는 중합체들은, 선택적으로, 단량체나 중합체 또는 양자 모두에서 알칼리 금속 염기로 부분적으로 또는 완전히 중화될 수도 있다.
중합체 백본을 구성할 수 있는 일부 대표적인 중합체로는, 이에 제한되지는 않지만, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리말레산, 이들의 공중합체, 및 이들의 알칼리 금속 및 암모늄 염; 전분과 아크릴산, 전분과 비누화 아크릴로니트릴, 전분과 비누화 에틸 아크릴레이트의 그래프트 공중합체, 및 비누화된 아크릴레이트-비닐 아세테이트 공중합체; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알킬에테르, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리아크릴아미드 및 이들의 공중합체; 말레산 무수물과 알킬 비닐에테르의 공중합체; 및 아크릴로니트릴, 아크릴레이트 에스테르, 비닐 아세테이트의 비누화된 전분 그래프트 공중합체, 및 아크릴산, 메타크릴산 및 말레산의 전분 그래프트 공중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체 백본은 바이오중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오중합체는 제1 가교결합제와의 가교결합을 가능하게 하는 작용성을 제공하는 방식으로 작용화되거나 변형되었을 수 있다. 사용될 수 있는 바이오중합체의 대표적인 예에는, 이에 제한되지는 않지만, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 엘라스틴, 펙틴, 아가로스, 글리코아미노글리칸, 알기네이트, 셀룰로오스, DNA, RNA 또는 이들의 작용화된 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체 백본은 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이의 작용화된 유도체를 포함한다. 이러한 중합체 백본의 대표적인 예는, 이에 제한되지는 않지만, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-아크릴레이트 (PEG-DA), 다중-아암형 (arm) 폴리(에틸렌 글리콜)-아크릴레이트 (PEG-Ac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디티올 (PEG-diSH), 폴리(에틸렌 글리콜)디비닐 설폰 (PEG-diVS), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)비닐 설폰 (PEG-VS), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-메타크릴레이트 (PEG-DMA), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-메타크릴레이트 (PEG-Mac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-알릴 에테르 (PEG-diAE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-알릴 에테르 (PE-AD), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-비닐 에테르 (PEG-diVE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 에테르 (PEG-VE), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-말레이미드 (PEG-diMI), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드 (PEG-MI), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-노보렌, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)노보렌, 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 및 폴리에틸렌 글리콜 올리고푸마레이트를 포함하는 중합체로부터 형성될 수 있다.
일부 특정 실시형태에서, 중합체 백본은 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드로부터 형성될 수 있다.
상기 예시적인 중합체들은 본원에 기술된 제1 가교결합제 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 가교결합제를 사용하여 중합 동안 또는 중합 후에 가교결합될 수 있다. 가교결합은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 방사선의 존재 하에 라디칼 개시제를 통한 개시를 통해 수행될 수 있다.
제1 가교결합제는 중합체 백본과 반응할 수 있는 적어도 2개의 모이어티를 포함한다. 중합체 백본 자체는 제1 가교결합의 적어도 2개의 모이어티와 반응할 수 있는 활성기를 가지고 있어 공유 결합을 형성한다. 일단 가교결합되면, 제1 가교결합제 내에 화학식 I의 모이어티의 존재로 본원에 제공되는 하이드로겔에 대해 관찰된 가수분해의 특성으로 이어지는 것으로 일반적으로 이해되고 있다.
일부 실시형태에서, 제1 가교결합제는 하기 화학식 II의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
X1과 X2는 각각 중합체 백본과 반응할 수 있는 모이어티로부터 독립적으로 선택되고;
L1과 L2는 각각 연결 모이어티로부터 독립적으로 선택되며;
m, n 및 A는 제1항에서와 같이 정의된다.
화학식 II의 일부 실시형태에서, m은 1이다. 화학식 II의 일부 실시형태에서, m은 2이다. 화학식 II의 일부 실시형태에서, n은 1이다. 화학식 II의 일부 실시형태에서, n은 2이다.
화학식 II의 일부 실시형태에서, A는 C2 알킬, C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬, C6 알킬, C7 알킬, C8 알킬, C9 알킬 또는 C10 알킬로부터 선택된다. 화학식 II의 일부 실시형태에서, A는 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸 및 2,3-디메틸부틸로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 화학식 II의 화합물은 하기로부터 선택된다:
및 .
X1과 X2는 각각 독립적으로 중합체 백본에서 발견되는 활성 기 또는 모이어티와 반응할 수 있는 작용기의 임의의 적절한 모이어티일 수 있다. 이러한 기의 대표적인 예에는 할로, 하이드록시, 아미노, 티올, 카르복실산, 에스테르 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, X1 및 X2 기는 각각 독립적으로 중합가능한 기, 예컨대 옥시라닐, 아크릴로일 또는 메타크릴로일 기 등을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, X1 및 X2는 각각 -SH이다.
L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합, 또는 모이어티 X1 및 X2를 이것이 부착되는 해당 카르보닐기에 공유 결합시키는 임의의 다른 적절한 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, L1 및 L2는 C1-C6 알킬, C1-C6 헤테로알킬, C1-C6 할로알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, 3- 내지 8원 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클, 6원 내지 10원 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 아릴, 5원 내지 10원 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로아릴, 또는 이들의 임의의 적절한 조합 (이들 각각은 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환됨)으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-C10 알킬, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, L1 및 L2는 각각 메틸렌이다.
특정 실시형태에서, 제1 가교결합제는 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체 백본은 제2 가교결합제로 추가로 가교결합된다. 이러한 실시형태에서, 제2 가교결합제는 일반적으로 가수분해적으로 안정한데, 즉 제1 가교결합제 내에서 발견되는 화학식 I의 모이어티 또는 하이드로겔을 사용하고자 하는 조건 하에 가수분해적으로 절단될 수 있는 임의의 다른 모이어티를 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, 제2 가교결합제는 디티오트레이톨 (DTT)을 포함할 수 있다.
제2 가교결합제를 함유하는 실시형태에서, 하이드로겔의 분해는 제1 가교결합제와 제2 가교결합제의 몰비를 변화시킴으로써 조정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 가교결합제와 제2 가교결합제의 몰비는 약 100:1 내지 약 1:100, 예를 들어 약 90:1, 약 80:1, 약 70:1, 약 60:1, 약 50:1, 약 40:1, 약 30:1, 약 25:1, 약 20:1, 약 15:1, 약 10:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:10, 약 1:15, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:40, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90, 또는 약 1:100 범위일 수 있다. 제2 가교결합제보다 높은 제1 가교결합제의 몰비는 가수분해를 증가시키고 분해 시간을 단축시키는 반면, 제2 가교결합제보다 낮은 제1 가교결합제의 몰비는 가수분해를 저해하고 분해 시간을 증가시킨다는 것은 숙련된 독자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
하이드로겔의 분해 생성물은 실질적으로 생체적합성이어야 하는데, 즉 살아있는 대상체의 신체, 조직 또는 세포에, 아니면 하이드로겔이 배치되는 부위나 살아있는 대상체의 다른 임의의 부분에 실질적으로 불리한 영향을 미치지 않아야 한다. 물질의 생체적합성을 평가하는 방법은 익히 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 하이드로겔은 세포의 기능 및/또는 특징을 조절할 수 있는 생물활성제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 생물활성제는 하이드로겔 상에 또는 내부에 분산된 세포의 기능 및/또는 특성을 조절할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 생물활성제는, 예를 들어 조직 결함에 이식된 하이드로겔을 둘러싸고 있는 내인성 세포의 기능 및/또는 특성을 조절하여 이러한 세포를 상기 결함으로 안내할 수 있다. 적어도 하나의 생물활성제는, 예를 들어 전사 인자, 분화 인자, 성장 인자, 또는 이들의 조합을 암호화하거나 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 생물활성제는 조직 형성, 파괴를 촉진하고/하거나 특정 질병 상태 (예를 들어, 암)를 표적으로 삼을 수 있는 임의의 제제도 포함할 수 있다. 이러한 생물활성제의 대표적인 예에는, 이에 제한되지는 않지만, 화학주성 제제, 다양한 단백질 (예: 단기 펩타이드, 골형성 단백질, 콜라겐, 당단백질 및 지질단백질), 세포 부착 매개체, 생물학적 활성 리간드, 인테그린 결합 서열, 다양한 성장 및/또는 분화 제제 및 이들의 단편 (예: 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 섬유아세포 성장 인자 (예: bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장 인자 (예: IGF-1, IGF-II) 및 형질전환 성장 인자 (예: TGF-β I-III), 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩타이드, 골형성 단백질 (예: BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-12, BMP-13, BMP-14), 전사 인자, 예컨대 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog), 성장 분화 인자 (예: GDF5, GDF6, GDF8), 재조합 인간 성장 인자 (예: MP52 및 MP-52 변이체 rhGDF-5), 연골 유래 형태형성 단백질 (CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3), 특정 성장 인자의 상향 조절에 영향을 미치는 저분자, 테나신-C, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 피브로넥틴, 데코린, 트롬보엘라스틴, 트롬빈 유래 펩타이드, 헤파린 결합 도메인, 헤파린, 헤파란 설페이트, 폴리뉴클레오타이드, DNA 단편, DNA 플라스미드, MMP, TIMP, 간섭성 RNA 분자, 예컨대 siRNA, 올리고뉴클레오타이드, 프로테오글리칸, 당단백질, 글리코사미노글리칸 및 shRNA를 암호화하는 DNA가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 하이드로겔은 치료가 필요한 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 치료제를 함유할 수 있다. "치료제"라는 용어는 유기체 (인간 또는 인간이 아닌 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 임의의 합성 또는 자연발생적 생체 활성 화합물 또는 물질의 조성물을 포함한다. 따라서, 이 용어는 단백질, 펩타이드, 호르몬, 핵산, 유전자 작제물 등과 같은 분자를 비롯하여 통상적으로 약물, 백신 및 생물약제로 간주되는 화합물 또는 화학물질을 망라한다. 치료제의 예는 익히 알려져 있는 참고 문헌, 예컨대 Merk Index (14th Edition), the Physician's Desk Reference (64th Edition), 및 The Pharmacological Basis of Therapeutics (12th Edition)에 설명되어 있으며, 치료제에는 제한없이, 약제; 비타민; 미네랄 보충제, 질병이나 질환의 치료, 예방, 진단, 치유 또는 완화에 사용되는 물질; 신체의 구조나 기능에 영향을 미치는 물질, 또는 생리학적 환경에 놓인 후에 생물학적으로 활성화되거나 보다 활성화되는 전구약물이 포함된다. 예를 들어, "치료제"라는 용어에는, 모든 주요 치료 부위에 사용하기 위한 화합물 또는 조성물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 보조제; 항감염제, 예컨대 항생제 및 항바이러스제; 진통제 및 진통제 조합물, 식욕부진제, 항염증제, 항간질제, 국소 및 전신 마취제, 수면제, 진정제, 항정신질환제, 신경이완제, 항우울제, 항불안제, 길항제, 신경 차단제, 항콜린제 및 콜린유사제, 항무스카린제 및 무스카린제, 항아드레날린제, 항부정맥제, 항고혈압제, 호르몬 및 영양분, 항관절염제, 항천식제, 항경련제, 항히스타민제, 항구토제, 항종양제, 항소양제, 해열제, 진경제, 심혈관 제제 (칼슘 채널 차단제, 베타 차단제 및 베타 작용제 포함), 항고혈압제, 이뇨제, 혈관확장제, 중추신경계 자극제, 기침약 및 감기약, 충혈 제거제, 진단제, 뼈 성장 촉진제 및 뼈 흡수 억제제, 면역억제제, 근육 이완제, 정신자극제, 진정제, 신경안정제, 단백질, 펩타이드 및 이들의 단편 (이들이 자연 발생형이냐, 화학적으로 합성된 것이냐, 또는 재조합적으로 제조된 것이냐의 여부와 관계 없음), 및 핵산 분자 (이중 가닥과 단일 가닥 분자를 모두 포함하는 리보뉴클레오타이드 (RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 중 하나인 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 유전자 작제물, 발현 벡터, 안티센스 분자 등), 저분자 및 기타 생체 활성 거대분자, 예컨대 단백질 및 효소가 포함된다. 상기 제제는 수의학을 포함한 의료 분야, 농업 (예: 식물) 및 기타 분야에 사용되는 생물학적 활성 제제일 수 있다.
하이드로겔은 주사가능 및/또는 이식가능할 수 있거나, 또는 막, 스펀지, 겔, 고체 스캐폴드, 방사 섬유, 직조형 또는 부직포형 메쉬, 나노입자, 또는 미세입자, 또는 임의의 다른 바람직한 구성의 형태일 수 있다.
다른 측면에서, 하이드로겔은 해당 하이드로겔 상에 또는 내부에 분산된 적어도 하나의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하이드로겔 내에서 전부 또는 부분적으로 캡슐화될 수 있다. 세포는, 예를 들어 임의의 전구체 세포, 예컨대 만능 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 또는 다능성 줄기 세포 뿐만 아니라, 보다 분화된 세포들을 포함하는 이들의 임의의 계통 후손 세포도 포함할 수 있다. 세포는 자가유래성, 이종성, 동종이계성 및/또는 동계성일 수 있다. 세포가 자가유래성이 아닌 경우, 면역거부를 최소화하기 위해서 면역억제제를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 사용되는 세포는 1차 세포, 증식된 세포 또는 세포주일 수 있으며, 분열하는 세포이거나 분열하지 않는 세포일 수도 있다. 세포는 하이드로겔에 도입되기 전에 생체 외에서 증식될 수 있다. 예를 들어, 숙주 대상체로부터 충분한 수의 생존 세포를 수확할 수 없는 경우라면, 자가유래성 세포를 이러한 방식으로 증식시킬 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 세포는 어떤 내부 구조를 갖는 조직을 포함하는, 조직의 조각들일 수도 있다. 세포는 1차 조직 체외 외식편 및 이의 제제, 세포주 (형질전환 세포 포함), 또는 숙주 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 임의의 전구체 세포, 예컨대 만능 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 및 다능성 줄기 세포 뿐만 아니라, 보다 분화된 세포들을 포함하는 이들의 임의의 계통 후손 세포도 의미할 수 있다. "줄기 세포" 및 "전구체 세포"라는 용어는 본 명세서에서 서로 교환하여 사용된다. 세포는 배아, 태아 또는 성체 조직에서 유래될 수 있다. 전구체 세포의 예로는 전능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC), 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 신경관 줄기 세포, 신장 줄기 세포, 간 줄기 세포, 폐 줄기 세포, 혈관모세포, 내피 전구 세포를 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 전구체 세포로는 역분화 연골형성 세포, 연골형성 세포, 제대혈 줄기 세포, 다능성 성체 전구체 세포, 근원 세포, 골형성 세포, 힘줄형성 세포, 인대형성 세포, 지방형성 세포 및 피부형성 세포를 포함할 수 있다.
하이드로겔은 적어도 하나의 세포 및/또는 생물활성제로 형성될 수 있다. 예를 들어, 다수의 세포들을 하이드로겔 상에 또는 내부에 실질적으로 균일한 방식으로 분산시킬 수 있거나, 또는 다르게는, 서로 다른 밀도 및/또는 공간적 분포의 서로 다르거나 동일한 세포들이 하이드로겔의 서로 다른 부분 안에 분산되도록 분산시킬 수도 있다. 세포는 중합체 백본의 가교결합 전 또는 후에 씨딩될 수도 있다. 다르게는, 하이드로겔은 중합체 백본의 가교결합 후 적어도 하나의 생물활성제의 용액 중에서 항온배양될 수 있다.
일반적으로, 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 하이드로겔에 도입될 수 있다. 세포를 하이드로겔과 혼합하여 적절한 성장 (또는 보관) 배지에서 배양하면 세포 생존력을 보장할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔을 시험관 내 씨딩 후 생체 내 사용을 위해 이식해야 하는 경우라면, 생체 내 적용에 앞서 시험관 배양 동안 세포 생존력을 보장하기 위해 충분한 성장 배지를 공급할 수 있다. 일단 하이드로겔이 이식되면, 세포의 영양 요건은 숙주 대상체의 순환 체액에 의해 충족될 수 있다.
세포를 하이드로겔에 도입하는데에는 임의의 이용가능한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 (예컨대, 성장 배지와 병용하여) 하이드로겔에 주입할 수 있거나, 또는 압력, 진공, 삼투압 또는 수동 혼합과 같은 다른 수단에 의해 도입될 수도 있다. 다르게는 또는 추가로, 세포는 하이드로겔 상의 층일 수 있거나, 또는 세포는 하이드로겔을 세포 현탁액에 침지시켜 해당 세포가 하이드로겔 내에 통합되거나 부착되기에 충분한 조건과 시간 동안 유지될 수 있도록 한다. 일반적으로, 함침 과정 동안에 세포 사멸을 최소화하기 위해서 세포들을 과도하게 수동으로 조작하는 것을 피하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 어떤 상황에서는 세포를 하이드로겔과 수동으로 혼합 또는 혼련하는 것이 바람직하지 않을 수 있으나; 이러한 접근법은 충분한 수의 세포들이 해당 절차에서 생존하는 경우에 유용할 수 있다. 또한, 원하는 세포의 공급원에 인접한 대상체에 하이드로겔을 단순히 배치함으로써 세포를 생체 내에서 하이드로겔에 도입할 수도 있다. 생물활성제는, 하이드로겔에 함유되어 있는 경우에 그로부터 방출될 수 있는데, 이 역시 국소 세포, 순환계 세포, 또는 이식 또는 주사 부위로부터 멀리 떨어진 세포들을 동원할 수 있다.
하이드로겔에 도입되는 세포의 수는 의도한 하이드로겔의 사용과 사용되는 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 분열 중인 자가유래성 세포를 주사 또는 혼합에 의해 하이드로겔에 도입하는 경우, 더 적은 수의 세포를 사용할 수 있다. 다르게는, 분열하지 않는 세포들을 주사 또는 혼합에 의해 하이드로겔에 도입되는 경우, 더 많은 수의 세포들이 필요할 수도 있다. 하이드로겔은 세포를 첨가하기 전에 수화 또는 동결건조된 상태일 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔은 세포들을 첨가하여 재수화하고 세포들로 하이드로겔을 채우기 전에 동결건조된 상태일 수 있다.
본 명세서에 기술된 하이드로겔은 조직 공학, 약물 전달 분야 및 재생 의료를 비롯한 다양한 생물의학 분야에 사용될 수 있다. 한 예에서, 본원에 기술된 하이드로겔은 대상체의 조직 성장을 촉진하는 데 사용될 수도 있다. 상기 방법의 한 단계로 표적 부위를 식별하는 것이 포함될 수 있다. 상기 표적 부위는 새로운 조직의 촉진이 필요한 조직 결함을 포함할 수 있다. 표적 부위는 질병 위치 (예컨대, 종양)도 포함할 수 있다. 조직 결함과 질병 위치를 식별하는 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 CT, MRI 및 X-선과 같은 다양한 영상 기법을 포함할 수 있다. 표적 부위를 확인한 후, 하이드로겔을 해당 표적 부위에 투여할 수 있다. 다음으로, 하이드로겔을 주사기나 기타 그와 유사한 장치에 로딩하여 조직 결함에 주사하거나 이식할 수 있다. 조직 결함 부위에 주사 또는 이식 시에, 촉각 수단을 이용하여 하이드로겔을 조직 결함의 형태로 형성시킬 수도 있다. 다르게는, 하이드로겔은 대상체에 이식하기 전에 특정 형태로 형성시킬 수 있다. 이식 후, 세포들은 하이드로겔에서 조직 결함으로 이동하기 시작하여, 성장 및/또는 분화 인자를 발현하고/하거나, 세포 증식과 분화를 촉진할 수 있다. 또한, 조직 결함에 하이드로겔이 존재하면 해당 조직 결함을 둘러싸고 있는 내인성 세포들이 하이드로겔로 이동하는 것을 촉진할 수도 있다. 일단 이식되면, 화학식 I의 모이어티가 가수분해될 수 있다. 이 모이어티의 가수분해는 제어된 속도로 이루어질 수 있어서 하이드로겔의 제어된 분해로 이어질 수 있다. 이러한 분해는 세포 성장 및 하이드로겔을 대체할 새로운 세포외 기질의 침착을 위한 공간을 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "조직"이라는 용어는 다세포 유기체에서 실질적으로 동일한 기능 및/또는 형태를 갖는 세포들의 응집체를 의미할 수 있다. "조직"은 일반적으로 동일한 기원의 세포들 응집체이지만, 다른 기원의 세포들의 응집체일 수도 있다. 세포는 실질적으로 동일하거나 실질적으로 서로 다른 기능을 가질 수 있으며, 동일하거나 서로 다른 유형일 수도 있다. "조직"에는, 이에 제한되지는 않지만, 장기, 장기의 일부, 뼈, 연골, 피부, 뉴런, 축삭, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 췌장, 소장, 혈액, 간, 고환, 난소, 자궁경부, 결장, 위, 식도, 비장, 림프절, 골수, 신장, 말초 혈액, 배아 또는 복수 조직을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법을 실행하기 위한 키트가 추가로 제공된다. "키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들어 본 명세서에 기술된 조성물 중 어느 하나를 포함하는 임의의 제품 (예컨대, 패키지 또는 용기)을 의도한 것이다. 키트는 본 명세서에 설명된 방법을 수행하기 위한 장치로서 홍보, 유통 또는 판매될 수 있다. 추가로, 키트에는 키트와 그 사용 방법을 설명하는 포장 삽지가 포함될 수 있다. 키트 시약의 일부 또는 전부는 이러한 시약을 외부 환경으로부터 보호하는 용기, 예컨대 밀봉된 용기 또는 파우치 내에 제공될 수 있다.
또한, 하나 이상의 용기에 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 키트도 개시된다. 개시된 키트는 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 다른 성분, 부속물 또는 보조제를 포함한다. 한 실시형태에서, 키트는 해당 키트의 조성물을 투여하는 방법을 설명하는 설명서 또는 포장지를 포함한다. 키트의 용기는 유리, 플라스틱, 금속 등과 같은 임의의 적절한 재료와 임의의 적절한 크기, 모양 또는 구성일 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 제제는 고체로서 키트에 제공된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 액체 또는 용액으로서 키트에 제공된다. 한 실시형태에서, 키트는 액체 또는 용액 형태로 본원에 기술된 조성물을 함유하는 앰플 또는 주사기를 포함한다.
본 발명은 본원에 제공된 본 발명의 하기의 실시형태들도 제공한다:
실시형태 1.적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 함유하는 제1 가교결합제로 가교결합된 중합체 백본을 포함하는 하이드로겔:
상기 식에서,
m과 n은 독립적으로 1 또는 2이고;
A는 C2-C10 알킬이며;
는 상기 제1 가교결합제 내의 모이어티에 대한 부착 지점이다.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, m이 1인 것인, 하이드로겔.
실시형태 3. 실시형태 1에 있어서, m이 2인 것인, 하이드로겔.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, n이 1인 것인, 하이드로겔.
실시형태 5. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, n이 2인 것인, 하이드로겔.
실시형태 6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, A가 C2-C8 알킬, C2-C6 알킬 및 C2-C4 알킬로부터 선택되는 것인, 하이드로겔.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, A가 C2 알킬인 것인, 하이드로겔.
실시형태 8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 중합체 백본이 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이의 작용화된 유도체를 포함하는 것인, 하이드로겔.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 중합체 백본이 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-아크릴레이트 (PEG-DA), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-아크릴레이트 (PEG-Ac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디티올 (PEG-diSH), 폴리(에틸렌 글리콜)디비닐 설폰 (PEG-diVS), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)비닐 설폰 (PEG-VS), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-메타크릴레이트 (PEG-DMA), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-메타크릴레이트 (PEG-Mac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-알릴 에테르 (PEG-diAE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-알릴 에테르 (PE-AD), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-비닐 에테르 (PEG-diVE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 에테르 (PEG-VE), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-말레이미드 (PEG-diMI), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드 (PEG-MI), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-노보렌, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)노보렌, 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 및 폴리에틸렌 글리콜 올리고푸마레이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것인, 하이드로겔.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 중합체 백본이 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드를 포함하는 것인, 하이드로겔.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가교결합제가 중합체 백본과 반응할 수 있는 m + n 모이어티를 포함하고, 이때 m과 n은 실시형태 1에서 정의된 바와 같은 것인, 하이드로겔.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가교결합제가 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 것인, 하이드로겔:
상기 식에서,
X1과 X2는 각각 중합체 백본과 반응할 수 있는 모이어티로부터 독립적으로 선택되고;
L1과 L2는 각각 연결 모이어티로부터 독립적으로 선택되며;
m, n 및 A는 실시형태 1에서와 같이 정의된다.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, X1과 X2가 각각 -SH인 것인, 하이드로겔.
실시형태 14. 실시형태 12 또는 실시형태 13에 있어서, L1과 L2가 각각 C1-C10 알킬로부터 독립적으로 선택되는 것인, 하이드로겔.
실시형태 15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제1 가교결합제가 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트)를 포함하는 것인, 하이드로겔.
실시형태 16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제1 가교결합제가 가수분해성인 것인, 하이드로겔.
실시형태 17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 중합체 백본이 제2 가교결합제로 추가로 가교결합되는 것인, 하이드로겔.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 가수분해적으로 안정한 것인, 하이드로겔.
실시형태 19. 실시형태 17 또는 실시형태 18에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 것인, 하이드로겔.
실시형태 20. 실시형태 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔의 분해가 제1 가교결합제와 제2 가교결합제의 몰비를 변화시켜 조정가능한 것인, 하이드로겔.
실시형태 21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔이 주사용 및/또는 이식용인 것인, 하이드로겔.
실시형태 22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔이 막, 스펀지, 겔, 고체 스캐폴드, 방사 섬유, 직조형 또는 부직포형 메쉬, 나노입자, 또는 미세입자의 형태인 것인, 하이드로겔.
실시형태 23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 세포를 추가로 포함하는, 하이드로겔.
실시형태 24. 중합체를 적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 포함하는 제1 가교결합제와 반응시키는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 합성하는 방법:
상기 식에서, 모든 변수들은 실시형태 1에서 정의된 바와 같다.
실시형태 25. 실시형태 24에 있어서, 제1 가교결합제가 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 것인, 방법:
상기 식에서,
X1과 X2는 각각 중합체 백본과 반응할 수 있는 모이어티로부터 독립적으로 선택되고;
L1과 L2는 각각 연결 모이어티로부터 독립적으로 선택되며;
m, n 및 A는 실시형태 1에서와 같이 정의된다.
실시형태 26. 실시형태 24 또는 실시형태 25에 있어서, 제1 가교결합제가 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트)를 포함하는 것인, 방법.
실시형태 27. 실시형태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔을 제2 가교결합제와 반응시키는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 제2 가교결합제는 가수분해적으로 안정한 것인, 방법.
실시형태 28. 실시형태 27에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 것인, 방법.
실시형태 29. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료제 전달 조성물.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제가 세포, 단백질, 항체, 핵산, 성장 인자 또는 약물로부터 선택될 수 있는 것인, 치료제 전달 조성물.
실시형태 31. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 포함하는 세포 배양 배지.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 포함하는 조직 스캐폴드.
실시형태 33. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 포함하는 생물반응기.
실시형태 34. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 포함하는 상처 드레싱.
실시형태 35. 조직 성장의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 조직 성장을 촉진하는 방법으로서,
표적 부위를 확인하는 단계; 및
치료적 유효량의 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나의 하이드로겔을 상기 표적 부위에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 상기 표적 부위가 새로운 조직의 촉진이 필요한 조직 결함을 포함하는 것인, 방법.
실시형태 37. 실시형태 35 또는 실시형태 36에 있어서, 상기 표적 부위가 영상화 기법 (imaging modality)을 사용하여 확인되는 것인, 방법.
실시형태 38. 실시형태 37에 있어서, 상기 영상화 기법이 CT, MRI, 또는 X-선으로부터 선택되는 것인, 방법.
실시형태 39. 실시형태 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔이 표적 부위에 주사되거나 이식되는 것인, 방법.
실시형태 40. 대상체의 표적 부위에 치료제를 전달하는 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의 실시형태 29 또는 실시형태 30의 치료제 전달 조성물을 상기 표적 부위에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
실시형태 41. 실시형태 40에 있어서, 상기 표적 부위가 질병 상태 또는 병태와 관련이 있는 것인, 방법.
실시형태 42. 실시형태 40 또는 실시형태 41에 있어서, 상기 표적 부위가 종양인 것인, 방법.
실시형태 43. 실시형태 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 부위가 영상화 기법을 사용하여 확인되는 것인, 방법.
실시형태 44. 실시형태 43에 있어서, 상기 영상화 기법이 CT, MRI, 또는 X-선으로부터 선택되는 것인, 방법.
실시형태 45. 실시형태 40 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 하이드로겔이 표적 부위에 주사되거나 이식되는 것인, 방법.
본 발명의 다수의 실시형태들을 설명하였다. 그렇지만, 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형을 줄 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태들은 하기 청구항들의 범위 내에 있다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 특정 실시형태들의 예를 아래에 제공한다.
실시예
하기 실시예들은 본원에 청구된 조성물, 물품 및/또는 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지에 대한 완전한 개시내용과 설명을 당업자계의 숙련자에게 제공하기 위해 제시하는 것으로, 순수하게 본 발명을 예시하려는 것이지, 본 발명자들이 본 발명으로 간주하는 범위 자체를 한정하려는 것은 아니다. 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 기하기 위해 노력하였으나, 일부 오차와 편차들이 고려되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 섭씨 또는 주변 온도 이며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예 1. 조정가능한 기계적 특성을 지닌 가수분해성 마이크로겔은 숙주 면역 반응을 조절한다
에스테르 함유 링커의 적용으로 에스테르 결합의 가수분해 절단을 기반으로 하는 분해 메커니즘이 제공된다. 분해는 중합체 함량, 마크로머 분자량, 가교결합 밀도 및 에스테르 불안정성 링커의 소수성에 의해 제어될 수 있다 (Jo, Y. S.; Gantz, J.; Hubbell, J. A.; Lutolf, M. P. Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis. Soft Matter 2009, 5 (2), 440-446 and Zustiak, S. P.; Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules 2010, 11 (5), 1348-1357). 효소적 분해를 이용한 하이드로겔과 달리, 이 접근법을 통해 개발된 하이드로겔은 가수분해를 통해 분해가능하므로, 하이드로겔의 조정가능한 물리적, 기계적 및 화학적 특성에만 의존하는 일관된 분해 프로파일이 가능하다 (Jo, Y. S.; Gantz, J.; Hubbell, J. A.; Lutolf, M. P. Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis. Soft Matter 2009, 5 (2), 440-446). 벌크 겔은 과거에는 가수분해성 가교결합제를 사용하여 조작하여 왔었는데 (Jo, Y. S.; Gantz, J.; Hubbell, J. A.; Lutolf, M. P. Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis. Soft Matter 2009, 5 (2), 440-446 and Hunckler, M. D.; Medina, J. D.; Coronel, M. M.; Weaver, J. D.; Stabler, C. L.; Garcia, A. J. Linkage Groups within Thiol-Ene Photoclickable PEG Hydrogels Control In Vivo Stability. Advanced Healthcare Materials 2019, 8 (14), 1900371), 이 기법은 아직 미세유체 기반 중합을 통해 제조된 마이크로겔에는 적용되지 않았다.
하이드로겔 망상구조에 분해성을 도입하는 능력은, 재료의 지속성과 기계적 특성이 해당 이식물에 대한 조직 반응을 조절할 것이기 때문에, 재생 의료 및 면역공학 분야에 있어서 주된 이점을 구성한다. 이식된 재료가 국소 조직에 통합되거나 이물질 반응 (FBR)에 의해 벽으로 막히는지의 여부에 따라, 생체재료에 대한 면역 반응이 궁극적으로 이식된 재료의 운명을 결정할 것이다. 처음에는, 생체재료 이식 후에, 염증유발성 매개체 IFNγ 및 TNFα에 의해 염증성 제1형 손상 반응이 해당 재료 부근에서 발생할 것이다. 그 후, 재생촉진성 생체재료는 제2형 면역 반응으로의 전환을 구동하여 M2 (CD206+) 대식세포 분극화 및 IL-4 신호전달을 통한 T 헬퍼 2 세포 침윤을 촉진한다 (재생촉진성 생체재료 스캐폴드 미세 환경의 개발은 T 헬퍼 2 세포가 필요하다. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aad9272 (2022-02-11 접속) 반면, 합성 이식물에 대한 숙주 반응은 일반적으로 단핵 식세포(Sussman, E. M.; Halpin, M. C.; Muster, J.; Moon, R. T.; Ratner, B. D. Porous Implants Modulate Healing and Induce Shifts in Local Macrophage Polarization in the Foreign Body Reaction. Ann Biomed Eng 2014, 42 (7), 1508-1516 and Mikos, A.G., et al. Host response to tissue engineered devices Adv Drug Deliv Rev 1998, 33(1-2):111-139) 및 제3형 면역 반응 수행과 관련된 기타 세포들 (Chung, L.; Maestas, D. R.; Lebid, A.; Mageau, A.; Rosson, G. D.; Wu, X.; Wolf, M. T.; Tam, A. J.; Vanderzee, I.; Wang, X.; Andorko, J. I.; Zhang, H.; Narain, R.; Sadtler, K.; Fan, H.; Cihakova, D.; Le Saux, C. J.; Housseau, F.; Pardoll, D. M.; Elisseeff, J. H. Interleukin 17 and Senescent Cells Regulate the Foreign Body Response to Synthetic Material Implants in Mice and Humans. Sci Transl Med 2020, 12 (539), eaax3799)를 주로 활성화시키는 이물질 반응을 특징으로 한다. 활성화된 대식세포와 Th17 세포는 TGF-β와, 섬유아세포를 동원하고 근섬유아세포로의 분화를 촉진하며 이식물 표면에서 섬유증을 유발하는 기타 인자들을 분비한다. 최근 보고에 따르면, 다양한 표현형의 서로 다른 면역 세포군 간의 보다 복잡한 상호작용들이 생체재료에 대한 반응과 관련되어 있다 (Doloff, J. C.; Veiseh, O.; de Mezerville, R.; Sforza, M.; Perry, T. A.; Haupt, J.; Jamiel, M.; Chambers, C.; Nash, A.; Aghlara-Fotovat, S.; Stelzel, J. L.; Bauer, S. J.; Neshat, S. Y.; Hancock, J.; Romero, N. A.; Hidalgo, Y. E.; Leiva, I. M.; Munhoz, A. M.; Bayat, A.; Kinney, B. M.; Hodges, H. C.; Miranda, R. N.; Clemens, M. W.; Langer, R. The Surface Topography of Silicone Breast Implants Mediates the Foreign Body Response in Mice, Rabbits and Humans. Nat Biomed Eng 2021, 5 (10), 1115-1130 and Witherel, C. E.; Sao, K.; Brisson, B. K.; Han, B.; Volk, S. W.; Petrie, R. J.; Han, L.; Spiller, K. L. Regulation of Extracellular Matrix Assembly and Structure by Hybrid M1/M2 Macrophages. Biomaterials 2021, 269, 120667). 그러나, 이러한 특성분석은 대개 국소 조직 반응에 대한 마이크로겔 이식과 분해의 영향에 대한 연구가 비교적 거의 없는 벌크 하이드로겔 이식물과 관련이 있다.
본원에서는, 불안정성 에틸렌 링커인 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트) (EGBMA)의 도입에 의존하는, 모듈식 기계적 및 분해 프로파일을 갖춘 단분산 가수분해가능한 마이크로겔을 생성하는 흐름 집속형 액적 생성을 기반으로 한 제조 접근법이 제공된다. 연속 흐름 단계에서 비분해성 링커에 다양한 몰 농도의 EGBMA를 첨가함으로써 하이드로겔 미세입자의 에스테르 농도를 조정함으로써, 제어된 하이드로겔 분해 프로파일을 달성할 수 있음이 입증되었다. EGBMA의 첨가는 생체 내에서 분해를 촉진하는 한편, 시험관 내에서는 대식세포 분극에는 영향을 미치지 않았다. 추가로, 조직 반응에 대한 분해성의 효과는 마이크로겔 현탁 이식물에 대하여 특징적이다. 마이크로겔 현탁액의 분해 프로파일을 제어하면 이식물에 대한 제1형 면역 반응을 조절할 수 있음이 입증되었다.
에스테르 함유 디티올 분자를 첨가하면 가수분해가능한 마이크로겔이 생성된다.
과거에 보고된 바와 같이, 흐름 집속형 미세유체 장치를 사용하여 액적 분할에 의해 가수분해성 미세입자 (즉, 마이크로겔)를 제조하였다 (Headen, D. M.; Aubry, G.; Lu, H.; Garcia, A. J. Microfluidic-Based Generation of Size-Controlled, Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgels for Cell Encapsulation. Advanced Materials 2014, 26 (19), 3003-3008). PEG-4MAL 마크로머는 미세유체 장치에서 분할하기 전에 입자 추적을 위해 마이클 유형 첨가를 통해 선형 PEG-FITC를 사용하여 작용화되었다. (작용화된 마크로머를 포함하는) 수성상을 미세유체 장치에서 생성된 액적에 펌핑한 후, 이를 작은 디티올 분자: 디티오트레이톨 (DTT) 및 에틸렌글리콜 비스(머캅토아세테이트) (EGBMA)를 함유하는 오일의 연속상과 공유 가교결합시켰다. EGBMA의 첨가로 인해 가수분해적으로 불안정한 에스테르 링커를 포함할 수 있었다 (도 1a 및 표 1). EGBMA의 농도는 가교결합 연속상에서 0.25에서부터 0.5 내지 1.0 mM로 다양하게 하였고, DTT의 농도를 15 mM로 일정하게 유지하였다. 마이크로겔의 1H 분자 확산 핵자기 공명 (NMR)을 통해 가교결합된 PEG-4MAL 마크로머에 말레이미드기가 없는 것으로 나타났는데, 이는 마이크로겔 액적의 말레이미드기가 온-칩 가교결합 후 효율적으로 반응함을 의미한다 (도 8).
200 ㎛ 노즐을 갖춘 장치의 모든 조건에서 유속을 일정하게 유지하면 가교결합 단계에서 DTT를 구현하는 경우에만 직경이 평균 208 ㎛ (CV 8%)인 단분산 마이크로겔 입자가 생성된다 (도 1b). 가교결합 용액에 EGBMA를 첨가하여 단분산 마이크로겔 군을 생성하였는데 (도 1c-1e, 모든 그룹에서 CV <10%), 마이크로겔의 크기는 직경 219 내지 270 ㎛ 범위였다. EGBMA 가교결합된 마이크로겔은 제조 후 4시간째에 직경이 DTT 단독 마이크로겔보다 4, 10 및 33% 더 컸으며, DTT 대조군에 비해 최고 농도의 EGBMA 그룹에서 상당한 팽윤이 있었다 (도 1f 및 1g, p<0.0001 DTT vs 1.0 mM EGBMA). PEG-FITC를 사용한 마크로머 작용화는 마이크로겔의 제조 후 평균 형광 강도 측정에서 알 수 있듯이 그룹 전반에서 동일하였는데 (도 1b-1e), 이는 팽윤에서의 차이가 가교결합을 위한 말레이미드기의 가용성이 아니라 EGBMA 링커의 존재에 기인할 수 있음을 의미한다. 30일째까지, DTT 가교결합된 마이크로겔은 초기 마이크로겔 크기보다 6% 더 큰 평형 크기에 도달했던 반면, 불안정성 가교결합제의 농도가 중간 및 최고 농도인 EGBMA/DTT 마이크로겔은 이들의 초기 크기보다 각각 26% 및 46% 더 크게 팽윤하였다 (도 1g, p=0.01 DTT vs 0.5 mM EGBMA, p<0.001 DTT vs 1.0 mM EGBMA). PEG-FITC는 PEG-4MAL 마크로머에 공유결합으로 연결되어 있어 EGBMA의 가수분해에 의해서만 하이드로겔 망상구조로부터 방출될 수 있기 때문에, 마이크로겔 분해도 용액으로 방출된 PEG-FITC의 양을 추적하여 평가하였다. PEG-FITC 방출 결과는 팽윤 실험과 일치하는데, 그에 따르면 1.0 mM EGBMA 가교결합된 마이크로겔은 더 낮은 EGBMA 농도보다 더 빠른 속도로 PEG-FITC를 방출했던 반면, 완전히 비분해성인 대조군은 포집된 PEG FITC가 적게 방출되었고, 예상대로 용액 중에 PEG-FITC가 없는 경우가 그 뒤를 따랐다.
마지막으로, 생성된 마이크로겔의 기계적 특성에 대한 EGBMA의 효과를, 테이퍼형 미세모세관을 통한 압력으로 유발된 변형을 통해 측정하였다 (Wyss, H. M.; Franke, T.; Mele, E.; Weitz, D. A. Capillary Micromechanics: Measuring the Elasticity of Microscopic Soft Objects. Soft Matter 2010, 6 (18), 4550-4555) (도 9a-9c). 마이크로겔은 미세모세관 말단에 있는 마이크로겔에 대한 압력 차이에 의해 변형된다. 압력차가 증가함에 따라, 마이크로겔은 방사형 압축 변형과 축방향 신장을 겪게 된다 (도 1i). 마이크로겔이 평형 상태에 있을 때 테이퍼 각도, 모서리 접촉 길이 및 평균 직경을 이용하여 전단 응력 및 변형을 측정할 수 있다 (도 1j). 이 평형 상태에서 전단 모듈러스 G의 계산을 통해 제조하고 4시간 후에 마이크로겔의 탄성에 차이가 없음이 입증되었으며, 값은 시험된 모든 그룹에서 20-22 kPa 범위였다. 용액 중에서 72시간 후, 전단 모듈러스는 마이크로겔 내 EGBMA 농도가 증가함에 따라 감소했으며, 분해성이 가장 높았던 링커 그룹에서는 모듈러스가 20 kPa에서 14 kPa로 감소하였고 (28% 감소) (도 1k, p<0.0001 vs DTT); 7일째까지, 탄성 모듈러스는 분해성이 가장 높은 링커 그룹에서 61% (8 kPa) 감소했는데, 이러한 거동은 에스테르 링커의 가수분해로 인해 가교결합 밀도가 감소한 것으로 설명된다. 종합하면, 이러한 데이터는 제조 직후 유효 가교결합 밀도에 차이가 없고, 마이크로겔의 탄성 특성은 EGBMA 가수분해 및 망상구조 가교결합의 손실을 바탕으로 시간에 따른 감소를 나타냄을 입증하는 것이다. 또한, 상기 결과들은 물리적 및 기계적으로 균질한 마이크로겔을 제조하는데 있어서 흐름 집속형 미세유체 플랫폼의 일관성에 대한 증거이기도 하다.
마이크로겔 분해 및 부산물은 시험관 내에서 단핵구 활성화를 유도하지 않는다
EGBMA/DTT 가교결합된 하이드로겔의 가수분해 생성물이 세포 생존력과 활성화에 미치는 영향을 평가하기 위해, RAW 264.7 마우스 대식세포 세포주를 다양한 마이크로겔 제제의 존재 하에 7일 이상 성장시켰다. 마이크로겔 및 제조 부산물 (예: 임의의 캡슐화된 DTT 또는 가수분해의 부산물)은 이 세포주에 독성이 없었다 (도 10). 이러한 결과들은 캡슐화된 세포 또는 완전히 가교결합된 마이크로겔과의 세포 공동 배양물에 대한 DTT 가교결합과 관련된 독성이 없음을 입증하는 과거의 연구와 일치한다 (Headen, D. M.; Aubry, G.; Lu, H.; Garcia, A. J. Microfluidic-Based Generation of Size-Controlled, Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgels for Cell Encapsulation. Advanced Materials 2014, 26 (19), 3003-3008, Coronel, M. M.; Martin, K. E.; Hunckler, M. D.; Barber, G.; O'Neill, E. B.; Medina, J. D.; Opri, E.; McClain, C. A.; Batra, L.; Weaver, J. D.; Lim, H. S.; Qiu, P.; Botchwey, E. A.; Yolcu, E. S.; Shirwan, H.; Garcia, A. J. Immunotherapy via PD-L1-Presenting Biomaterials Leads to Long-Term Islet Graft Survival. Science Advances 2020, and Headen, D. M.; Woodward, K. B.; Coronel, M. M.; Shrestha, P.; Weaver, J. D.; Zhao, H.; Tan, M.; Hunckler, M. D.; Bowen, W. S.; Johnson, C. T.; Shea, L.; Yolcu, E. S.; Garcia, A. J.; Shirwan, H. Local Immunomodulation with Fas Ligand-Engineered Biomaterials Achieves Allogeneic Islet Graft Acceptance. Nature Materials 2018, 17 (8), 732-739).
시험관 내 면역 세포 분극화에 대한 마이크로겔의 효과를 평가하기 위해, 가교결합된 마이크로겔의 다양한 제제와 함께 C57BL/6J 마우스의 골수에서 유래된 1차 단핵구를 포함하는 공동 배양 시스템을 확립하였다. 유사한 크기 (200 ㎛)와 웰당 동일한 농도의 폴리스티렌 비드 (PS)는 세포 활성화를 유도하지 않는 것으로 나타났으므로 음성 대조군으로 포함시켰다 (Moore, M. W.; Cruz, A. R.; LaVake, C. J.; Marzo, A. L.; Eggers, C. H.; Salazar, J. C.; Radolf, J. D. Phagocytosis of Borrelia Burgdorferi and Treponema Pallidum Potentiates Innate Immune Activation and Induces Gamma Interferon Production. Infection and Immunity 2007, 75 (4), 2046-2062). 또한, 벌크 PEG 하이드로겔에 대한 대식세포의 노출이 부착 신호 및 염증 신호가 없을 때에 세포 분극을 조절 표현형 쪽으로 이동시키는 것으로 나타났기 때문에, IL-4 분극화된 M2 조절 표현형은 양성 대조군으로 포함시켰다 (Lynn, A. D.; Bryant, S. J. Phenotypic Changes in Bone Marrow Derived Murine Macrophages Cultured on PEG-Based Hydrogels and Activated by Lipopolysaccharide. Acta Biomater 2011, 7 (1), 123-132). 미세입자를 함유하는 그룹은 모든 마이크로겔 제제 또는 PS와 함께 48시간의 공동 배양 후에 유사한 세포 생존력을 나타냈던 반면 (도 2a), IL-4를 첨가하면 공동 배양에서 세포 수가 증가하였다. 2일간의 공동 배양 후에 PS 또는 PEG계 마이크로겔의 존재 하에 CD45, F4/80 및 조절 마커 CD206의 발현에서의 변화는 관찰되지 않았다 (도 2b-2d). 또한, 이들 마커의 전반적인 발현은 4일간의 공동배양 후에도 동일하였다 (도 11a-d). 이러한 결과들은 마이크로겔 탄성 특성과 크기 또는 분해 생성물에서의 변화가 시험관 내 비염증성 조건 하에 대식세포 마커 발현에서의 어떠한 표현형 변화도 유도하지 않음을 입증하는 것이다.
피하 마이크로겔 이식으로 생체 내 분해를 제어한다
EGBMA/DTT 가교결합된 하이드로겔이 생체 내에서 분해되는 능력을 시험하기 위해, 위에서 설명한 대로 마이크로겔을 제조하되, PEG-FITC 추적기를, 생체 내 추적을 위해 근적외선 염료를 함유하는 동일한 분자량의 선형 PEG로 대체하였다. 멜라닌 색소침착에 의한 신호 검출의 감쇠를 피하기 위해 (Curtis, A.; Calabro, K.; Galarneau, J.-R.; Bigio, I. J.; Krucker, T. Temporal Variations of Skin Pigmentation in C57Bl/6 Mice Affect Optical Bioluminescence Quantitation. Mol Imaging Biol 2011, 13 (6), 1114-1123)) 마이크로겔을 알비노 마우스의 등쪽 피하 주머니에 주사하였다. 마이크로겔의 분해는 생체내 형광 이미징 (IVIS)을 통해 추적하였다 (도 3a). 시간 경과에 따른 정규화된 방사 효율 추적은 EGBMA 농도에 따라 형광 신호가 감소함을 보여준다 (도 3b). 특히, DTT-가교결합 그룹에서는 신호 강도의 감소가 있었던 반면, 체외이식 후 강도 값은 1일차 값과 유사하여, 예상대로 이 그룹에서는 분해가 없음을 입증한다 (도 3b, 점선 이후는 체외이식 후의 값, p=0.44). 주사 후 1일째에는 마이크로겔 제제들 간에 형광 신호에서 차이가 관찰되지 않았지만 (도 3c), 9일째까지, 중간 및 최고 농도의 EGBMA 가교결합제를 함유하는 마이크로겔 제제에서 형광 신호는 상당히 낮았다 (도 3d, 각각 p= 0.008, p= 0.0001 vs DTT). 25일째에, 신호 강도는 원래 신호의 26%, 17%, 12%였으며, 이는 EGBMA 링커 농도에 정비례하여 감소한 것이다 (도 3e, p=0.0004, p<0.0001, p<0.0001 vs DTT). 따라서, IVIS 이미징을 통해, EGBMA와 가교결합된 마이크로겔이 생체 내에서 분해되고, 이러한 분해는 몇주간에 걸쳐 발생된다는 것을 확인하였다.
분해 특성은 생체 내 마이크로겔에 대한 면역 반응을 조절한다
에스테르 함유 링커의 팽윤과 가수분해로 인한 마이크로겔의 분해와 기계적 특성에서의 변화가 이식물에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠다. 4개의 서로 다른 마이크로겔 제제들을 모두 BALB/cJ 마우스의 등쪽 피하 주머니에 주입하고 다중 매개변수 흐름 분석을 위해 7일째에 해당 조직을 회수하였다. 이 시점에서 시험 대상 재료들 간의 기계적 특성과 분해 프로파일의 차이가 입증되었기 때문에 선택하였다. 또한, 분해성 및 기계적 특성의 동적 변화가 세포 환경에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하기 위해, 해당 분석에서는 비분해성 제제 (DTT)와 3개의 서로 다른 분해성 제제들 간의 비교에 중점을 두었다. 1.0 mM EGBMA를 함유하는 분해성 마이크로겔과 비교하였을 때 DTT로 가교결합된 마이크로겔의 주사 부위에서 골수 세포군 (CD45+CD11b+)이 우세하였다 (도 4a-4b, p=0.018). 골수 구획 내의 하위군에 대한 표현형 분석을 통해 마이크로겔 가교결합제 제제의 함수로서 F4/80+ 대식세포의 존재에서 차이가 나타났음을 알 수 있었다 (도 4c-4d, p=0.008). 주요 조직적합성 복합체 클래스 II (MHCII)의 세포 발현을 기반으로 상기 세포군의 활성화를 측정하였더니 마이크로겔 제제들 간에 차이가 없는 것으로 나타났으나 (도 4e-4f), 이 마커의 발현 강도는 분해성이 가장 높은 마이크로겔 제제와 비교했을 때 DTT 가교결합된 그룹에서 가장 컸다 (도 4f, p=0.03 DTT vs 1.0 mM EGBMA). M1- 및 M2-관련 마커인 CD86과 CD206을 사용한 대식세포 분극화에 대한 추가의 분석에서, 다른 모든 분해성 제제들과 비교하였을 때 비분해성 DTT 그룹에서 M2 분극화된 F4/80-발현 대식세포의 존재가 증가한 것으로 나타났는데 (도 4g), 이는 비분해성의 비식세포성 마이크로겔에 대한 조직 반응이 이 시점에서 M2 유사 표현형이 우세하며, 이러한 분극도 물질 분해 프로파일에 의해 조절될 수 있음을 보여주는 것이다. 다음으로, T 세포를 주사 부위로 동원하는 것에 대한 마이크로겔 제제의 효과를 조사하였다. DTT-가교결합된 마이크로겔은 분해성 마이크로겔에 비해 더 많은 수의 CD3+ 세포를 이식물 주머니에 동원하였다 (도 5a-5b). 이러한 림프구 반응은 CD4 헬퍼 세포가 주도하였는데, 이것은 비분해성 마이크로겔의 존재 하에 상승하였다 (도 5c-5d). 활성화 마커 CD25 및 PD-1의 발현 (도 5e-5h)도 마이크로겔 제제에 의해 영향을 받았는데, 분해성 마이크로겔과 비교하여 비분해성 그룹에서 관찰된 이들 마커의 표면 발현에서 상향조절이 증가되었음이 관찰되었다. 전반적으로, DTT 그룹에서 M2 유사 세포 표현형의 증가와 함께 CD4 세포의 존재의 향상은, 비분해성 PEG계 마이크로겔에 대한 조직 반응에서 이들 두 세포군 간의 상호작용을 입증하는 것이다. 더욱이, 기계적 특성의 변화를 포함하는 마이크로겔 분해 프로파일은, 생체재료 이식물에 대한 숙주 조직 반응을 변화시키는 특수 세포 하위군의 동원과 표현형을 조절할 수 있다.
마이크로겔에 의해 유도된 사이토카인 환경은 역동적이며 IFN-γ 발현에 의해 좌우된다
면역 환경과 마이크로겔 분해 프로파일의 상호작용을 더 잘 이해하기 위해, 다중화 기법을 시행하여 마이크로겔 주입 후 T 세포 동원과 대식세포 분극을 조절하는 사이토카인 및 케모카인 (여기서는 사이토카인이라 칭함) 환경을 조사하였다. 추가로, 사이토카인들 간의 높은 수준의 상관관계와 사이토카인 방출에 대한 마우스 연령의 잠재적 교란 요인 (분석된 첫 시점과 마지막 시점 사이에 4주 차이)을 고려하여, 서로 다른 시점에서 각 사이토카인을 평가하는 것이 아니라, 모듈형 사이토카인 분석 방법인 CytoMod를 수행하여 사이토카인 군집분석과 관찰된 세포 표현형 간의 일부 상황을 제공하였다 (Cohen, L.; Fiore-Gartland, A.; Randolph, A. G.; Panoskaltsis-Mortari, A.; Wong, S.-S.; Ralston, J.; Wood, T.; Seeds, R.; Huang, Q. S.; Webby, R. J.; Thomas, P. G.; Hertz, T. A Modular Cytokine Analysis Method Reveals Novel Associations With Clinical Phenotypes and Identifies Sets of Co-Signaling Cytokines Across Influenza Natural Infection Cohorts and Healthy Controls. Frontiers in Immunology 2019, 10, 1338 and Distinct inflammatory profiles distinguish COVID-19 from influenza with limited contributions from cytokine storm https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe3024 (2021-10-25 접속)). 그룹화된 사이토카인의 주성분 분석 (PCA)을 통해 사이토카인 프로파일에서 두 방향을 확인했는데, 사이토카인 수준의 대부분의 변화는 한 방향의 사이토카인 IFN-γ 및 IL-2와 직교 방향의 G-CSF에 의해 결정된다 (도 6a, 벡터 방향과 색상은 PCA에 대한 기여도를 나타냄). 모든 대상체에 있어서 사이토카인 유사성은 피어슨 상관 계수로 정의되었는데 (도 6b), 여기서는 비감독형 계층적 군집분석을 사용하여 5개의 사이토카인 모듈을 확인하였다 (도 6c). 염증 및 Th 분극화 반응에 관여하는 사이토카인과 케모카인 (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-17, IL-10, IL-6, MIG, RANTES, M-CSF, LIX)으로 구성된 모듈 1에서 통계적으로 유의미한 상관관계가 나타났다. 사이토카인 특이적 점수는 모든 대상체의 사이토카인 수준과 평균 사이토카인 매트릭스 사이에서 계산하였는데, 이로써 이전 PCA 분석과 일치하는 구동형 사이토카인으로 IFN-γ가 결정되었다. 이 모듈 내의 상관관계 플롯은 대부분의 사이토카인 (IL-2, IL-10, IL-6, LIX, M-CSF)과 IFN-γ 사이에 통계적으로 유의미한 양의 상관관계가 있음을 시사한다. 따라서, IFN-γ의 발현이 높은 조건은 이러한 다른 사이토카인들의 농도가 비교적 높은 것으로 나타났다 (도 6d).
평가된 모든 시점의 모든 조건에 있어서 원래의 사이토카인 값에 대한 직접 비교는, EGBMA 함유 제제가 평가된 대부분의 사이토카인에 대해 더 낮은 평균 사이토카인 수준을 보이는 동적 프로파일을 나타냈다 (도 6e-6f, 도 12a-12f, 도 13a-13d). 비분해성 마이크로겔은 초기 주입 후 GM-CSF 및 G-CSF의 발현을 증가시켰다 (도 6e, 도 12a-12f). 7일째까지, 면역 세포 동원에 관여하는 다른 케모카인, 예컨대 M-CSF, 및 IFN-γ에 의해 유도된 모노카인 (MIG)의 발현은 비분해성 대조군과 비교하였을 때 분해성이 가장 높은 EGBMA 링커 그룹에서 감소되었다 (도 12a-12f 및 13a-13d). 제1형 관련 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ 유도원인 IL-2의 발현도 분해성 마이크로겔에 노출된 조직에서 감소하였다 (도 12a-12f 및 13a-13d). 중요한 점은, 중요한 제2형 사이토카인 IL-4의 발현이 마이크로겔 제제에 좌우되었고, 모든 분해성 제제들과 비교하였을 때, 비분해성 마이크로겔의 경우 모든 시점에서 더 높은 수준의 IL-4가 관찰되었다는 것이다 (도 6f). 추가로, 연구한 시점에서 제제들 간에 혈관신생 인자 VEGF의 발현에 있어서는 차이가 관찰되지 않았다 (도 12a-12f). 주사 부위에서의 세포 표현형에 대한 다중 매개변수 흐름 분석과 함께 이러한 결과들은, PEG계 비분해성 마이크로겔에 대한 반응이 제1형 면역에 의해 구동되며 제2형 구동형 사이토카인 IL-4에 의해 어느 정도 교차-조절됨을 시사하는 것이다. 중요한 점은, 이 반응은 생체 내에서 가수분해되는 불안정성 에스테르기의 도입에 의해 조절될 수 있다는 것이다. 알비노 마우스 등쪽의 마이크로겔 주사에 대한 조직 반응은 전반적으로 경미하였고, 세포들이 이식물 주변부를 둘러싸며 침윤하였다 (도 14). 주목할 만한 점은, 그 어떤 이식물도 캡슐화나 낭종 형성의 징후를 보이지 않았다는 것이다. 이식 후 4주째에 숙주 이식물 경계에서 주변 마이크로겔 이식물 주위의 세포 침착이 명백하게 나타났다 (도 15). 이미지의 정성 평가에서, 모든 분해성 마이크로겔 제제들과 비교하였을 때, 비분해성 마이크로겔 (DTT)을 포함하는 이식물의 이식물 주변부 부근에서 세포 밀도가 더 높게 나타났다. 범 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학 분석은, 최고 농도의 EGBMA (1.0 mM EGBMA)를 함유하는 조건에 비해서 DTT와 0.25 및 0.5 mM EGBMA 조건에서 CD68 발현의 존재가 증가하였음을 입증하였다. 이러한 결과들은 골수 집단에 대한 유세포 분석 평가와 일치한다 (도 4a-4g).
논의 및 결론
마이크로겔에 분해성을 부여하는 전략은 가수분해, 효소 반응 또는 용해를 통한 절단이 가능하도록 중합체 백본 또는 불안정성 가교결합제 단위의 분해성 사슬을 활용해 왔다. 과거에는, 혈관신생 인자의 전달을 위해 프로테아제 분해성 마이크로겔을 제조하였다 (Foster, G. A.; Headen, D. M.; Gonzalez-Garcia, C.; Salmeron-Sanchez, M.; Shirwan, H.; Garcia, A. J. Protease-Degradable Microgels for Protein Delivery for Vascularization. Biomaterials 2017, 113, 170-175). 이러한 마이크로겔을 형성하여 액적 미세유체를 구현하였지만, 연속 상에서 가교결합 펩타이드의 제한된 용해도를 고려하면, 맞춤형 미세유체 장치의 설계가 필요하였다. 여기서는, 가교결합된 PEG-4MAL 마이크로겔의 분해를 조절하기 위해 에스테르 가수분해를 활용하는 제조 전략이 제시된다. 이전 접근법들과 달리, 이 전략은 불안정성 가교결합제 단위가 오일 가교결합 단계에 추가될 수 있기 때문에, 비분해성 마이크로겔의 제조를 위해 설계된 동일한 미세유체 장치에서 시행될 수 있다. 따라서, 이 전략은 단순히 가교결합 공급물을 조정하여 마이크로겔 생성물의 분해 특성을 조정할 수 있다.
팽윤, PEG-FITC 태그의 방출 및 탄성 모듈러스를 비롯한 물리적 및 기계적 특성의 변화를 평가하여 하이드로겔 분해를 모니터링하였다. 이러한 매개변수들의 변화는 EGBMA 가교결합제 함량 및 그에 따른 가수분해성기의 수와 직접적으로 관련되어 있다. 제조 직후, 가장 높은 농도의 불안정성 에스테르 접합으로 합성된 마이크로겔은 비분해성 마이크로겔 대조군 크기의 ~140%까지 팽윤하였으나; 이 시점에 탄성 모듈러스에 있어서는 눈에 띄는 차이가 관찰되지 않았다. 이는 PEG-4MAL 마크로머를 완전히 방출하려면, 다중 에스테르 결합을 절단해야 한다는 사실로 설명된다. 실제로, 탄성 모듈러스의 측정가능한 변화는, 충분한 가교결합이 절단되고 PEG-4MAL 마크로머가 수성 매질에 용해되었을 때, 수성 완충액에서 72시간 후에 처음 관찰되었다. 시간이 지남에 따라 차이는 더욱 분명해져 EGBMA 함량에 정비례하였는데, 이것은 상기 접근법의 조정가능성을 입증한 것이다. 본 실시예에서는 시험되지는 않았지만, 에스테르와 티올 사이의 소수성 및 탄소 단위의 존재가 에스테르 가수분해 속도에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다 (Zustiak, S. P.; Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly (Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules 2010, 11 (5), 1348-1357, Jo, Y. S.; Gantz, J.; Hubbell, J. A.; Lutolf, M. P. Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis. Soft Matter 2009, 5 (2), 440-446, and Schoenmakers, R. G.; van de Wetering, P.; Elbert, D. L.; Hubbell, J. A. The Effect of the Linker on the Hydrolysis Rate of Drug-Linked Ester Bonds. Journal of Controlled Release 2004, 95 (2), 291-300). 따라서, 에스테르와 티올기 사이에 소수성 분자 단위가 있는 링커를 구현하거나 중합체 밀도를 변경하면 제조 기술에 뚜렷한 영향을 주지 않고도 상기 접근법으로 합성된 하이드로겔의 분해를 추가로 제어할 수 있다.
재료 분해성은 생체재료 플랫폼에는 매우 바람직하지만, 원치않는 독성과 면역 활성화 반응을 유발하여 임상에서의 이들의 적용가능성을 방해할 수 있다. 본 실시예에서, 시험한 임의의 마이크로겔 제제들에서는 세포 생존력에 대한 눈에 띄는 효과가 관찰되지 않았는데, 이는 마이크로겔의 존재 또는 이들의 분해 부산물이 최대 약 3 마이크로겔/μL의 용량까지 독성으로 인한 세포 사멸을 초래하지 않음을 입증하는 것이다. 추가로, 본 실시예에서 구현된 마이크로겔의 크기 (>200 ㎛)는 대식세포에 의한 식세포작용을 방지해야 하나 (Champion, J. A.; Mitragotri, S. Role of Target Geometry in Phagocytosis. PNAS 2006, 103 (13), 4930-4934); 분해 부산물과 부분적인 내재화는 대식세포 분극화를 초래한다. 기계적 신호에서의 변화가 M1 유사 대식세포 활성화에 영향을 미치는 것으로 입증되었으나 (Patel, N. R.; Bole, M.; Chen, C.; Hardin, C. C.; Kho, A. T.; Mih, J.; Deng, L.; Butler, J.; Tschumperlin, D.; Fredberg, J. J.; Krishnan, R.; Koziel, H. Cell Elasticity Determines Macrophage Function. PLOS ONE 2012, 7 (9), e41024 and Fereol, S.; Fodil, R.; Labat, B.; Galiacy, S.; Laurent, V. M.; Louis, B.; Isabey, D.; Planus, E. Sensitivity of Alveolar Macrophages to Substrate Mechanical and Adhesive Properties. Cell Motility 2006, 63 (6), 321-340), 표면 화학에서의 변화는 M2 유사 분극화에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Thiols Decrease Human Interleukin (IL) 4 Production and IL-4-Induced Immunoglobulin Synthesis. J Exp Med 1995, 182 (6), 1785-1792 and Li, Z.; Bratlie, K. M. How Cross-Linking Mechanisms of Methacrylated Gellan Gum Hydrogels Alter Macrophage Phenotype. ACS Appl. Bio Mater. 2019, 2 (1), 217-225). 본 실시예에서는, EGBMA 가교결합 단위의 존재나 기계적 특성의 변화 그 어느 것도 시험관 내 M2 관련 CD206 마커 발현에는 영향을 미치지 않았다. 반응하지 않은 가교결합 분자의 대부분은 원심분리/세척 단계를 통해 마이크로겔 현탁액에서 제거되었다. 또한, 구현된 마이크로겔 : 세포 비율에서, 가수분해로 인해 용액 중링커 분자의 농도는 이 마커 발현에 영향을 미치지 않았다.
분해성 PEG계 하이드로겔에 대해 보고된 여러 전략들에도 불구하고, 생체 내 분해 속도가 시험관 내 분해 속도와 10배 다를 수 있다고 보고한 연구는 거의 없다 (Hunckler, M. D.; Medina, J. D.; Coronel, M. M.; Weaver, J. D.; Stabler, C. L.; Garcia, A. J. Linkage Groups within Thiol-Ene Photoclickable PEG Hydrogels Control In Vivo Stability. Advanced Healthcare Materials 2019, 8 (14), 1900371, Amer, L. D.; Bryant, S. J. The in Vitro and in Vivo Response to MMP-Sensitive Poly (Ethylene Glycol) Hydrogels. Ann Biomed Eng 2016, 44 (6), 1959-1969, and Browning, M. B.; Cereceres, S. N.; Luong, P. T.; Cosgriff-Hernandez, E. M. Determination of the in Vivo Degradation Mechanism of PEGDA Hydrogels. J Biomed Mater Res A 2014, 102 (12), 4244-4251). 실제로, 배양 중에 빠르게 분해되는 것으로 밝혀진 프로테아제 절단성 제제는 이식 후에 분해되지 않는다 (Amer, L. D., Bryant, S. J. The in Vitro and in Vivo Response to MMP-Sensitive Poly (Ethylene Glycol) Hydrogels. Ann Biomed Eng 2016, 44 (6), 1959-1969). 마찬가지로, 시험관 내 점진적 가수분해 속도가 생체 내에서 관찰된 신속한 분해와 일치하지 않았던 바, 이와 같이 분해 속도에서의 차이도 가수분해에서 관찰되었다 (Hunckler, M. D.; Medina, J. D.; Coronel, M. M.; Weaver, J. D.; Stabler, C. L.; Garcia, A. J. Linkage Groups within Thiol-Ene Photoclickable PEG Hydrogels Control In Vivo Stability. Advanced Healthcare Materials 2019, 8 (14), 1900371). 본원에서는, 근적외선 염료로 표지된 마이크로겔을 사용하여, DTT/EGBMA 가교결합 마이크로겔이 생체 내에서 수주간에 걸쳐 분해됨을 입증하였다. 이는 시험관 내 연구에서 관찰된 분해 속도와 다른 에스테르 함유 벌크 PEG 하이드로겔과도 일치한다 (Zustiak, S. P.; Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly (Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules 2010, 11 (5), 1348-1357). 후속 연구에서는, 생물학적 요인 (예컨대, 접착 리간드, 캡슐화된 세포 또는 치료제)의 추가가 이러한 마이크로겔의 에스테르 가수분해 속도를 어떻게 변화시키는지를 평가하는 것이 중요할 것이다.
마지막으로, 분해성의 함수로서 조직 반응을 등쪽 피하 모델에서 평가하였다. 이 부위는 상당한 마이크로겔 이식량을 수용할 수 있는 쉽게 접근할 수 있는 위치를 제공한다. 게다가, 다수의 독립적인 마이크로겔 현탁액을 등쪽의 서로 다른 사분면에 주입할 수 있으므로, 동일한 동물을 자체의 내부 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 다중 매개변수 흐름 분석을 통해, 비분해성 제제에서 골수 및 T 세포, 특히 CD4+ 세포의 존재의 강화로 분해 의존성 면역 반응이 입증되었는데, 이는 합성 이식 재료에 대한 반응을 유도하는 T 헬퍼 세포를 보여주는 다른 연구들과 일치한다 (Chung, L.; Maestas, D. R.; Lebid, A.; Mageau, A.; Rosson, G. D.; Wu, X.; Wolf, M. T.; Tam, A. J.; Vanderzee, I.; Wang, X.; Andorko, J. I.; Zhang, H.; Narain, R.; Sadtler, K.; Fan, H.; Cihakova, D.; Le Saux, C. J.; Housseau, F.; Pardoll, D. M.; Elisseeff, J. H. Interleukin 17 and Senescent Cells Regulate the Foreign Body Response to Synthetic Material Implants in Mice and Humans. Sci Transl Med 2020, 12 (539), eaax3799 and Chan, T.; Pek, E. A.; Huth, K.; Ashkar, A. A. CD4+ T-Cells Are Important in Regulating Macrophage Polarization in C57BL/6 Wild-Type Mice. Cellular Immunology 2011, 266 (2), 180-186). 사이토카인 환경에 대한 추가적인 평가는 면역 반응의 다양성과 정교함에 대한 추가의 통찰력을 제공하였다. 합성 벌크 이식물에 대해 IL-17로 유발된 면역 반응의 보고 (Chung, L.; Maestas, D. R.; Lebid, A.; Mageau, A.; Rosson, G. D.; Wu, X.; Wolf, M. T.; Tam, A. J.; Vanderzee, I.; Wang, X.; Andorko, J. I.; Zhang, H.; Narain, R.; Sadtler, K.; Fan, H.; Cihakova, D.; Le Saux, C. J.; Housseau, F.; Pardoll, D. M.; Elisseeff, J. H. Interleukin 17 and Senescent Cells Regulate the Foreign Body Response to Synthetic Material Implants in Mice and Humans. Sci Transl Med 2020, 12 (539), eaax3799)에서와는 대조적으로, 합성 마이크로겔 현탁액을 주사하면 IFN-γ가 현저하게 발현되어 최대 4주간은 상승된 상태로 유지되는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 비감독형 사이토카인 상관관계의 군집분석을 통해 IFN-γ가 사이토카인 연통을 주도하는 우세한 반응임이 확인되었다. IFN-γ는 제1형 면역 반응을 유도하는 표준 사이토카인 중 하나이고 (Tuzlak, S.; Dejean, A. S.; Iannacone, M.; Quintana, F. J.; Waisman, A.; Ginhoux, F.; Korn, T.; Becher, B. Repositioning TH Cell Polarization from Single Cytokines to Complex Help. Nat Immunol 2021, 22 (10), 1210-1217), 이는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생성되어 STAT1 인산화에 의해 M1 분극화를 촉진한다 (Kak, G.; Raza, M.; Tiwari, B. K. Interferon-Gamma (IFN-γ): Exploring Its Implications in Infectious Diseases. Biomolecular Concepts 2018, 9 (1), 64-79). 마이크로겔 현탁액의 이식 직후 대식세포의 세포성 반응의 평가를 통해, M2와 유사한 표현형 (즉, CD206 발현)보다 더 유사한 표현형 특성이 드러났다. 이러한 표현형의 유연성은 IFN-γ 활성화된 대식세포의 재분극으로 이어지는 미세환경의 변화를 보여주고 있다. 향후 연구에서는, M1 분극이 IL-4에 반응하여 뚜렷한 M2 표현형으로의 전환을 촉진할 수 있다는 점을 고려하여, 실제로 이러한 재분극이 면역 반응에서의 다른 사이토카인의 존재 (즉, IL-4의 지속성)로 인한 것인지의 여부를 조사해야 한다 (O'Brien, E. M.; Spiller, K. L. Pro-Inflammatory Polarization Primes Macrophages to Transition into a Distinct M2-like Phenotype in Response to IL-4. Journal of Leukocyte Biology n/a (n/a)). 추가로, 이러한 연구들은 M2 분극화에 대한 유전적 소인이 있는 것으로 밝혀진 BALB/cJ 마우스에서 수행하였다. 따라서, 마이크로겔에 의해 유도된 M2 표현형은 다른 균주에서 시험될 때까지는 일반화될 수 없다 (Chan, T.; Pek, E. A.; Huth, K.; Ashkar, A. A. CD4+ T-Cells Are Important in Regulating Macrophage Polarization in C57BL/6 Wild-Type Mice. Cellular Immunology 2011, 266 (2), 180-186).
제1형 사이토카인이 국소 조직 반응의 주요 동인인 것처럼 보였지만, 본 실시예는 추가로 연구되어야 할 상호간 IL-4 유도된 반응을 보여주고 있다. 비분해성 이식물에서는 주사 후 30일 후에도 IL-4 분비에 있어서 관찰가능한 변화가 없었음이 명백하였다. 특히, 이 면역 반응의 조절은, 가수분해성 마이크로겔이 비분해성 마이크로겔에 비해서 IL-4 분비의 감소와 CD206+ 대식세포 존재에 잇어서 상응하는 감소를 보였다는 점에서, 마이크로겔 플랫폼에 어느 정도의 분해가능성을 부여함으로써 가능하였다. 시험된 시간대에서 완전한 분해로 이어지지 않는, 불안정성 에스테르 가교결합제를 최소한으로 포함하여도 (즉, 0.25 mM EGBMA), 세포 및 사이토카인 프로파일의 차이가 나타났는데, 이는 해당 물질의 분해 프로파일이 조직 반응에 크게 영향을 미친다는 것을 보여주는 것이다.
본 실시예에서는 연구되지 않았지만, 물질의 기하학적 구조, 크기, 표면 질감, 강성도 및 전하와 같은 다양한 매개변수들이 숙주-이식물 상호 작용과 후속 면역 인식 및 FBR의 발생에 영향을 미칠 수 있다 (Doloff, J. C.; Veiseh, O.; de Mezerville, R.; Sforza, M.; Perry, T. A.; Haupt, J.; Jamiel, M.; Chambers, C.; Nash, A.; Aghlara-Fotovat, S.; Stelzel, J. L.; Bauer, S. J.; Neshat, S. Y.; Hancock, J.; Romero, N. A.; Hidalgo, Y. E.; Leiva, I. M.; Munhoz, A. M.; Bayat, A.; Kinney, B. M.; Hodges, H. C.; Miranda, R. N.; Clemens, M. W.; Langer, R. The Surface Topography of Silicone Breast Implants Mediates the Foreign Body Response in Mice, Rabbits and Humans. Nat Biomed Eng 2021, 5 (10), 1115-1130, Veiseh, O.; Doloff, J. C.; Ma, M.; Vegas, A. J.; Tam, H. H.; Bader, A. R.; Li, J.; Langan, E.; Wyckoff, J.; Loo, W. S.; Jhunjhunwala, S.; Chiu, A.; Siebert, S.; Tang, K.; Hollister-Lock, J.; Aresta-Dasilva, S.; Bochenek, M.; Mendoza-Elias, J.; Wang, Y.; Qi, M.; Lavin, D. M.; Chen, M.; Dholakia, N.; Thakrar, R.; Lacik, I.; Weir, G. C.; Oberholzer, J.; Greiner, D. L.; Langer, R.; Anderson, D. G. Size- and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response to Materials Implanted in Rodents and Non-Human Primates. Nature Mater 2015, 14 (6), 643-651, and Blakney, A. K.; Swartzlander, M. D.; Bryant, S. J. The Effects of Substrate Stiffness on the in Vitro Activation of Macrophages and in Vivo Host Response to Poly (Ethylene Glycol)-Based Hydrogels. J Biomed Mater Res A 2012, 100 (6), 1375-1386). 예를 들어, 구형 아가로스 마이크로겔에 대한 FBR은 이식물의 기하학적 구조와 크기에 따라 조절되며, 더 큰 구형 이식물은 작은 이식물에 비해 더 낮은 FBR을 활성화한다 (Veiseh, O.; Doloff, J. C.; Ma, M.; Vegas, A. J.; Tam, H. H.; Bader, A. R.; Li, J.; Langan, E.; Wyckoff, J.; Loo, W. S.; Jhunjhunwala, S.; Chiu, A.; Siebert, S.; Tang, K.; Hollister-Lock, J.; Aresta-Dasilva, S.; Bochenek, M.; Mendoza-Elias, J.; Wang, Y.; Qi, M.; Lavin, D. M.; Chen, M.; Dholakia, N.; Thakrar, R.; Lacik, I.; Weir, G. C.; Oberholzer, J.; Greiner, D. L.; Langer, R.; Anderson, D. G. Size- and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response to Materials Implanted in Rodents and Non-Human Primates. Nature Mater 2015, 14 (6), 643-651). 이와 마찬가지로, 친수성 물질을 사용한 PEG 하이드로겔의 화학적 변형은 단백질 흡수와 세포 부착을 감소시켜서 FBR을 조절할 수 있다 (Jansen, L. E.; Amer, L. D.; Chen, E. Y.-T.; Nguyen, T. V.; Saleh, L. S.; Emrick, T.; Liu, W. F.; Bryant, S. J.; Peyton, S. R. Zwitterionic PEG-PC Hydrogels Modulate the Foreign Body Response in a Modulus-Dependent Manner. Biomacromolecules 2018, 19 (7), 2880-2888). 강성도와 같은 중요한 물질의 특성은 세포 거동을 유도하는 데 큰 영향을 미치는 것으로 점점 더 인식되고 있다 (Blakney, A. K.; Swartzlander, M. D.; Bryant, S. J. The Effects of Substrate Stiffness on the in Vitro Activation of Macrophages and in Vivo Host Response to Poly (Ethylene Glycol)-Based Hydrogels. J Biomed Mater Res A 2012, 100 (6), 1375-1386 and Irwin, E. F.; Saha, K.; Rosenbluth, M.; Gamble, L. J.; Castner, D. G.; Healy, K. E. Modulus-Dependent Macrophage Adhesion and Behavior. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 2008, 19 (10), 1363-1382). PEG 하이드로겔에 대한 강성도로 유발된 염증성 반응은 과거에 보고된 바 있으며, 보다 강성인 표면에 대한 면역 세포 부착의 증가와 관련이 있는 것으로 생각된다 (Blakney, A. K.; Swartzlander, M. D.; Bryant, S. J. The Effects of Substrate Stiffness on the in Vitro Activation of Macrophages and in Vivo Host Response to Poly (Ethylene Glycol)-Based Hydrogels. J Biomed Mater Res A 2012, 100 (6), 1375-1386). 이러한 반응은 다른 생화학적 신호들과는 독립적으로 기계적 반응에 감응하는 일시적 수용체 전위 바닐로이드 4 (TRPV4)에 기인하는 것으로 최근 밝혀졌다 (Goswami, R.; Arya, R. K.; Sharma, S.; Dutta, B.; Stamov, D. R.; Zhu, X.; Rahaman, S. O. Mechanosensing by TRPV4 Mediates Stiffness-Induced Foreign Body Response and Giant Cell Formation. Science Signaling 14 (707), eabd4077). 본 연구에 사용된 마이크로겔 이식물은 가수분해 매개성 분해 도중에 크게 팽창하므로, 이식 후 크기의 이러한 동적 변화와 강성도 감소가 본 실시예에서 관찰된 세포 침윤의 조절로 이어진다는 점을 배제할 수는 없다. 비분해성 이식물에서 이 2가지의 매개변수를 분리하여 FBR에 대한 DTT 가교결합된 마이크로겔 크기의 단일 효과를 평가하는 것이 흥미로울 것이다.
요약하면, 본 실시예는 액적 미세유체를 통해 분할된 PEG-4MAL 마크로머의 분해가능한 특징을 마이크로겔에 부여하는 비용 효율적인 접근 방식을 제시한다. 에스테르 불안정성 가교결합 접합부를 가진 마이크로겔은 시험관 내 및 생체 내에서 쉽게 분해된다. 또한, 분해 프로파일은 이식물에 대한 면역 반응에 영향을 미치는데, 분해성 마이크로겔이 전달될 때 존재하는 제1형 관련 사이토카인과 세포들이 감소한다. 이 전략의 단순성과 생성된 마이크로겔 군집의 가수분해 효율성 때문에, 이 접근 방식은 재생 의료와 약물 전달 분야에 있어서 매력적이다.
실험
미세유체 장치 제작: PDMS 미세유체 장치는 과거 보고된 바와 같이 제조하였다 (Headen, D. M.; Aubry, G.; Lu, H.; Garcia, A. J. Microfluidic-Based Generation of Size-Controlled, Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgels for Cell Encapsulation. Advanced Materials 2014, 26 (19), 3003-3008). 간단히 설명하면, PDMS는 소프트 리소그래피와 미세유체 장치 패턴이 있는 SU8 마스터를 사용하여 주조하였고, 20분간 110℃로 가열하였다. 생성된 PDMS 미세유체 장치를 웨이퍼에서 제거하고 유리 슬라이드에 부착한 후 밤새 70℃로 가열하였다.
PEG-4MAL 마이크로겔 제조: 200 ㎛ 노즐이 있는 흐름 집속 미세유체 장치를 사용하여 중합체 액적을 형성하였다. 수성상은 이전에 티올-PEG-FITC (1 kDa, Nanocs)와 반응시킨 5% w/v PEG-4Mal (20 KDa, Laysan Bio)로 구성되었다. 병류 (co-flowing) 차폐 상은 미네랄 오일 (Sigma)과 2% SPAN80 (Sigma)으로 구성되었다. 가교결합제 상은 15 mM 농도의 DTT (Thermo)와 미네랄 오일/SPAN80의 에멀젼을 함유하였다. 마이크로겔을 분해성으로 만들기 위해, 다양한 양의 EGBMA (Sigma)를 이 가교결합제 상에 0.25, 0.5 및 1.0 mM 농도로 첨가하였다. 제조 후, 원심분리를 통해 오일상에서 마이크로겔을 추출하고, 2% 소혈청 알부민 (Sigma)/PBS (corning) 용액으로 세척하였다.
마이크로겔 크기 조정 및 팽윤: Biotek Cytation 분광광도계를 사용하여 제조 후에 마이크로겔 크기에 대한 가교결합상의 특성 분석을 수행하였다. 50 μL의 샘플 (3차례)을 유리 바닥 6-웰 플레이트에 넣었다. 각 마이크로겔의 정량적 형광 강도를 모든 샘플에 대해 기록하였다. Cytation Gen 소프트웨어의 세포 분석 플러그-인을 사용하여 액적 직경을 측정하였다. 팽윤 연구를 위해, 1000개의 마이크로겔을 1 mL의 PBS에 넣고 항온배양기에 두었다. 매일 50 μL의 샘플을 채취하여 상술한 바와 같이 측정하였다. FITC 추적 연구를 위해, 1000개의 마이크로겔을 1 mL의 PBS에 넣고 용액을 매일 교체하였다. 수집된 상청액 형광을 Cytation 3 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
미세모세관 기계적 시험: 마이크로겔 탄성 특성은 압력 구동형 모세관 마이크로역학을 사용하여 측정하였다 (Wyss, H. M.; Franke, T.; Mele, E.; Weitz, D. A. Capillary Micromechanics: Measuring the Elasticity of Microscopic Soft Objects. Soft Matter 2010, 6 (18), 4550-4555). 다양한 시점 (0일, 3일, 7일째)에서, PBS 중 1% (w/v) BSA로 사전 코팅된 테이퍼형 유리 마이크로피펫 (Fivephoton Biochemicals)의 말단에 마이크로겔을 삽입하였다. 마이크로피펫 말단에는 고정밀 압력 조절기 (Elveflow)를 부착하고, 다양한 간격을 두어 (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 kPa) 압력을 가했다. 마이크로겔이 평형 (외부 인가 압력이 내부 탄성 응력과 균형을 이루는 경우 더 이상 마이크로피펫에서 움직이지 않는 상태)에 도달하면, 현미경 (10X; EVOS)으로 이미지를 얻어서 ImageJ를 사용하여 매개변수를 측정하였다.
생존력 평가: RAW 264.7 세포를 10,000개의 마이크로겔과 함께 7일간 공동배양하였다. 세포 대사 활성은 AlamarBlue (Invitrogen)를 통해 측정하였다. 분석은 다양한 시점 (1, 2, 4 및 7일)에서 수행하였다. 4시간 동안 항온배양한 후, 100 μL의 상층액을 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 Cytation 3 이미징 판독기 (Biotek)를 사용하여 570 nm 및 600 nm 파장에서 OD를 측정하였다.
골수 유래 대식세포 공동배양: 골수는 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스의 대퇴골과 경골에서 분리하였다. 뼈에서 연조직을 닦아내고, 한쪽 면을 잘라 골수를 노출시킨 다음, 1.5 mL의 에펜도르프 튜브에 맞게 잘라낸 200 μL의 피펫 팁에 뒤집어 놓았다. 그 후, 뼈를 10,000×g에서 15초간 원심분리하여 에펜도르프 튜브 바닥의 골수를 펠릿화하였다. 뼈를 버린 후, 세포를 RBC 용해 완충액 (Biolegend 420302) 중에 재현탁하여 적혈구를 제거하였다. 그런 다음, 세포를 MACS 완충액 (DPBS pH 7.2, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)에서 세척하고, 단핵구를 단핵구 분리 키트 (BM), 마우스 (Miltenyi Biotec 130-100-629) 및 LS 컬럼 (Miltenyi Biotec 130-042-401)을 사용하여 분리하였다.
저부착성 플레이트에서 10% 열 불활성화된 소태아 혈청, 1% pen/strep 및 20 ng/mL의 쥐과 M-CSF (Biolegend 574804)가 보충된 RPMI 1640 배지 (Gibco 11875-085) 중에서 단핵구를 6일간 배양하였다. 세포를 수확하고 1:10 비율 (웰당 10,000개의 세포/1000개의 마이크로겔)로 미세입자를 씨딩하였다. M2 대조군 대식세포는 20 ng/mL의 쥐과 M-CSF와 20 ng/mL의 쥐과 IL-4 (Biolegend 574304)가 모두 보충된 배지에서 배양하였다. 48시간 및 96시간의 공동배양 후, 세포를 수확하고 하기의 마커들을 사용하여 염색하였다: live dead (Zombie Violet, BioLegend 423113), CD45 (PE-Texas Red, BioLegend 103146), CD11b (PercpCy5.5, BioLegend 101228), F4/80 (FITC, BioLegend 123108), 및 CD206 (PECy7, BioLegend 141720). 샘플들은 FACS-AriaIIIu 유세포 분석기 (BD Biosciences)에서 분석하였다.
마이크로겔의 마우스로의 이식: 모든 동물 절차들은 조지아 공과대학 (Georgia Institute of Technology) IACUC가 승인한 프로토콜 하에 국립 보건원 (National Institutes of Health) 지침 (IACUC 승인 프로토콜 번호 A100326)에 따라 수행되었다. 8-12주령의 BALB/cJ 마우스의 표피 아래에 마이크로겔을 주입하였다. 100 μL의 주입량은 약 3000개의 비분해성 또는 분해성 하이드로겔로 구성되었다. 4가지 조건 모두 독립적인 장소에서 동일한 동물에 적용하여 동물들 간의 고유한 생물학적 차이로 인한 임의의 변동성을 감소시켰다.
생체 내 마이크로겔 추적: 마크로머는 AlexaFluor750 NHS 에스테르 (Thermo Fisher)로 표지된 1 KDa PEG로 작용화하였다. 제조 직후, 3000개의 마이크로겔을 100 μL의 식염수에 용해시켜 표피 아래에 주사하였다. 신호 강도와 분포는 IVIS SpectrumCT 이미징 시스템 (Perkin-Elmer)을 사용하여 장기간 모니터링하였다. 데이터는 Living Image 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 관심 영역 (ROI)을 소정의 주머니 부위에 그려서 방사 효율[p/s/sr]/[μW/cm2]을 사용하여 정량하였다. ROI는 모든 시점에서 각 그룹 주머니에 대해 동일한 크기를 유지시켰고, 각 영역에 대한 형광 신호를 포함하도록 적절한 크기를 지정하여, 개별 기증자들 간의 이미징 데이터를 시간에 따라 비교할 수 있도록 하였다. 강도 측정은 0일 값으로 정규화하였다.
조직 반응의 다중 매개변수 흐름 분석: 조직 샘플을 12 mm 생검 펀치로 채취하고 Accumax 용액 (Sigma)을 사용하여 37℃에서 60분간 소화시켰다. 소화된 조직을 40 ㎛ 거르개에 통과시킨 후, 1X PBS로 2회 세척하였다. 세포를 세척하여 live/dead (Zombie violet, BioLegend 423113) 염색하고 골수성 마커: CD45 (PE-Texas Red, BioLegend 103146), CD11b (PercpCy5.5, BioLegend 101228), F4/80 (FITC, BioLegend 123108), CD11c (BV785, BioLegend 117335), MHCII (APC-Cy7, BioLegend 107652), CD86 (APC, BioLegend 105012), CD206 (PECy7, BioLegend 141720) 뿐만 아니라, 림프 마커: CD45 (BV711, BioLegend), CD3 (BV510, BioLegend 100233), CD4 (APC, BioLegend 100412), CD8 (PercpCy5.5, BioLegend 100732), CD25 (PECy7, BioLegend 102016), PD-1 (PE Texas Red, BioLegend 135227)로 표면 염색하였다. 유세포 분석을 BD Aria로 수행하여 FCS Express에서 분석하였다.
사이토카인 분석: 상술한 바와 같이 마이크로겔을 표피 아래에 피하 주사하였다. 설정된 시점에서, 주변 주사 부위에서 12 mm 생검 펀치를 사용하여 조직을 제거하였다. 이후, 샘플들을 프로테아제 억제제 (Thermo)가 포함된 RIPA 완충액에 넣었다. 샘플들을 초음파 처리하고 10,000×g에서 10분간 4℃에서 원심분리하여 잔해물을 제거하였다. 상청액을 액체 질소에서 냉동시키고 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조업체의 지침에 따라 Magpix 다중화 기계 (Luminex) 상에서 Milliplex MAP 마우스 사이토카인/케모카인 32-플렉스 분석 (Millipore, MCYTMAG)을 사용하여 샘플들을 분석하였다. PCA는 R의 "prcomp" 기능을 사용하여 모든 샘플에 대해 수행하였고, "factoextra" 패키지를 사용하여 시각화하였다. 사이토카인 상관관계는 CytoMod를 사용하여 조사하였다 (Cohen, L.; Fiore-Gartland, A.; Randolph, A. G.; Panoskaltsis-Mortari, A.; Wong, S.-S.; Ralston, J.; Wood, T.; Seeds, R.; Huang, Q. S.; Webby, R. J.; Thomas, P. G.; Hertz, T. A Modular Cytokine Analysis Method Reveals Novel Associations With Clinical Phenotypes and Identifies Sets of Co-Signaling Cytokines Across Influenza Natural Infection Cohorts and Healthy Controls. Frontiers in Immunology 2019, 10, 1338 and Distinct inflammatory profiles distinguish COVID-19 from influenza with limited contributions from cytokine storm https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe3024 (2021-10-25 접속)). 상관관계 분석을 위해, 검출 하한 미만의 값은 검출 하한으로 설정하였다. Log10 농도를 사용한 다변량 선형 회귀를 시간의 함수로 모델링하였다. R의 "emmeans" 패키지를 사용하여 조건들 간의 보정된 주변 평균값의 쌍별 차이를 평가하였고, 터키 (Tukey)의 방법을 사용하여 다중 비교를 조정하였다.
면역조직화학 분석: 30일째에 안락사시킨 후, 주사 부위 주변에 12 mm 생검 펀치를 사용하여 조직을 제거한 후, 이를 밤새 10% 포르말린 용액 중에서 고정시켰다. 이어서, 샘플들을 등급별 에탄올 용액 중에서 탈수 처리하고, 자일렌중에서 투명화하고 파라핀 매립하였다. 섹션들을 10 ㎛로 절단하여 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 대식세포 범 마커 CD68 (abcam, ab125212)를 위한 IHC, 및 핵 염색 (DAPI, Invitrogen D1306)을 사용하여 염색하였다.
통계학적 분석: 모든 실험은 생물학적 반복실험으로 수행되었다. 각 실험 그룹의 샘플 크기, 및 그룹들 간의 유의미한 차이를 측정하는데 사용된 통계 시험 (적절한 경우 사후 검증 시험 포함)을 해당 도면 범례에 기록하였다. 정확한 p 값이나 유의성 기호의 의미를 범례에 나타내었다. 데이터는 Graphpad Prism v9 (GraphPad Inc.)를 사용하여 분석하였다. 사이토카인 분석을 위해, 농도 데이터는 정규화를 위해 로그 변환시켰고; 분석은 hclust, glm 및 lmmeans 패키지를 사용하여 R에서 수행하였다. 실험은 눈가림하지 않았으며, 무작위배정도 사용하지 않았다.
실시예 2. 분해성 마이크로겔
에스테르 함유 링커를 사용한 하이드로겔 가교결합은 에스테르 결합의 가수분해 절단에 중점을 둔 분해 메커니즘을 제공한다. 분해는 중합체 함량, 분자량, 및 에스테르 불안정성 링커의 가교결합 밀도에 의해 제어될 수 있다 (Zustiak, S. P., & Leach, J. B. (2010). Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules, 11(5), 1348-1357). 효소 의존형 하이드로겔과는 대조적으로, 이 접근법을 통해 개발된 하이드로겔은 가수분해를 통해 분해가능하므로, 하이드로겔의 조정가능한 물리적, 기계적 및 화학적 특성에만 의존하는 제어되고 일관된 분해 프로파일을 가질 수 있다 (Sung, B., Kim, C., & Kim, M.-H. (2015). Biodegradable colloidal microgels with tunable thermosensitive volume phase transitions for controllable drug delivery. Journal of Colloid and Interface Science, 450, 26-33 and Stukel, J., Thompson, S., Simon, L., & Willits, R. (2015). Polyethlyene glycol microgels to deliver bioactive nerve growth factor: Microgels to Deliver Bioactive NGF. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 103(2), 604-613). 중요한 점은, 이 분해 방법이 시스테인 말단 접착제 또는 펩타이드의 구현을 방해하지 않는다는 것이다 (Stukel, J., Thompson, S., Simon, L., & Willits, R. (2015). Polyethlyene glycol microgels to deliver bioactive nerve growth factor: Microgels to Deliver Bioactive NGF. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 103(2), 604-613). 약물 전달 및 조직 공학에서 이 하이드로겔의 사용은 장기간에 걸쳐 서방형 프로파일을 제공하는데 있어서 효과적인 방법임이 입증되었다 (Zustiak, S. P., & Leach, J. B. (2010). Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules, 11(5), 1348-1357, Pradal, C., Grøndahl, L., & Cooper-White, J. J. (2015). Hydrolytically Degradable Polyrotaxane Hydrogels for Drug and Cell Delivery Applications. Biomacromolecules, 16(1), 389-403, and Davis, K. A., & Anseth, K. S. (2002). Controlled Release from Crosslinked Degradable Networks; Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 19(4-5), 385-424). 본원에서는, 본 발명자들은 불안정성 에틸렌 링커의 도입에 의존하는 조정가능한 방출 및 분해 프로파일을 사용하여, 흐름 집속형 액적 생성을 기반으로 단분산 가수분해성 하이드로겔을 생성하는 제조 메커니즘을 제시한다. 다양한 양의 에틸렌 링커와 비분해성 티올 링커를 첨가하여 하이드로겔 구조의 불안정성 에스테르 화학을 조정하면, 제어된 하이드로겔 분해 프로파일을 개발할 수 있다. 추가로, 본 발명자들은 시험관 내 및 생체 내에서 세포 표현형에 대한 기계적 특성 및 분해성 부산물에서의 변화에 대한 효과도 특성 분석하였다.
방법
미세유체 장치 제작. PDMS 미세유체 장치는 184 실리콘 엘라스토머와 184 실리콘 엘라스토머 경화제를 첨가하여 구축되었다. 그런 다음, 상기 실리콘 혼합물을 미세유체 장치 패턴으로 이루어진 실리콘 웨이퍼 위에 놓고 20분간 110℃로 가열하였다. 생성된 PDMS 미세유체 장치를 웨이퍼에서 제거하고 유리 슬라이드에 부착한 후 밤새 70℃로 가열하였다.
4-아암형 폴리(에틸렌 글리콜) 마이크로겔 구축. PEG-4Mal (20 KDa 4-아암 폴리에틸렌 글리콜, Laysan Bio), PEG 비오틴 및 DTT (디티오트레이톨)를 적절한 양으로 칭량하였다. 10 mM의 DPBS/HEPES (둘베코의 인산염 완충 식염수/4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) 용액을 제조하여 PEG 비오틴을 현탁시켰다. 그 후, DPBS/HEPES 용액과 Peg 비오틴으로 이루어진 이 새로운 용액을 사용하여 PEG-4Mal을 재현탁시킨 뒤, 이를 라인을 통해 미세유체 장치로 흘려보냈다. 추가로, DTT 및 DPBS/HEPES 용액을 제조하였다. 2% SPAN 80/미네랄 오일 용액도 제조하여 DPBS/HEPES 중에 용해된 DTT 395 ul를 2% SPAN 80/미네랄 오일 용액 5 mL에 첨가하였다. 분해성 마이크로겔의 경우, 계산된 농도의 분해성 티올 링커를 DTT 및 2% SPAN 80/미네랄 오일의 용액에 첨가하였다. 용액을 만든 후, 3개의 주사기 펌프를 설치하고 미세유체 장치를 제작할 수 있도록 프라이밍하였다. 한 펌프는 장치를 통해 오일을 밀어내도록 설정되었고 (1 ul/분), 다른 펌프는 장치를 통해 PEG를 밀어내도록 설정되었으며 (5 ul/분), 마지막 펌프는 장치를 통해 DTT 용액을 밀어내는데 사용하였다 (35 ul/분). 장치의 수집조에서 dPBS 및 1% BSA (소혈청 알부민)가 채워진 수집 튜브까지 수집 라인을 설치하였다. 장치를 프라이밍한 후, 라인을 설치하고 3가지 용액을 미세유체 장치를 통해 흘려보냈다. 약 45분 동안 장치를 통해 펌프와 라인을 작동시킨 후, 수집 튜브를 5분간 원심분리기에 놓고 여러번 세척을 수행하여 수집물에서 DTT와 오일을 제거하여 튜브의 바닥에 마이크로겔을 수집하였다.
마이크로겔 분해. 약 200개의 마이크로겔을 48-웰 플레이트의 각 웰에 넣고 여러 날에 걸쳐 항온배양하였다. 매일, 각 웰의 마이크로겔의 수를 계수하여 LED 현미경을 사용해 팽윤을 분석하였다. 마이크로겔을 분석한 후, DPBS를 각 웰에 첨가하여 다시 항온배양기에 넣었다.
단백질 캡슐화의 준정량적 (Semi-quantitate) 분석. 웨스턴 블롯 트랜스퍼 (Western Blot Transfer)를 수행하여 단백질을 포획하는 하이드로겔의 능력을 분석하였다. 겔 전기영동 및 화학발광 이미징 기술을 통해, 마이크로겔의 준정량적 분석을 수행하여 마이크로겔이 이식을 위한 준비가 되었는지를 판단하였다.
마이크로겔의 마우스로의 이식. 8-12주령의 Balb/C 마우스의 표피 아래에 마이크로겔을 주입하였다. 100 μL의 주입량은 약 3000개의 비분해성 또는 분해성 하이드로겔로 구성되었다. 비분해성 마이크로겔은 DTT 가교결합제로 이루어지고 분해성 티올 링커가 없었던 반면, 분해성 마이크로겔은 DTT 가교결합제와 0.25 mM, 0.5 mM 또는 1 mM 티올 링커의 혼합물로 이루어졌다.
마이크로겔 추적. IVIS 이미징 시스템을 사용하면, 마이크로겔 이미지와 그 형광을 볼 수 있다. 수일에 걸쳐, 마이크로겔 신호전달을 추적하여 분해 속도를 기록하였다.
실시예 3. 치료적 전달을 위한 가수분해성 하이드로겔
하이드로겔은 모듈형으로 생체적합성이며 제어가능한 기계적 특성을 갖도록 조작할 수 있기 때문에, 약물 또는 생물학적 치료제의 전달을 위한 재생 의료 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 가면 갈수록, 분해성 하이드로겔은 하이드로겔에 통합된 펩타이드의 서열 특이적 효소 분해를 사용하여 제조된다. 이 분해 방법은 세포 적합성인 반면에, 오일 내 펩타이드의 낮은 용해도와 다량의 펩타이드 용액에 대한 요건으로 인해 미세유체 장치를 사용한 단분산 분해성 하이드로겔의 합성에 제약이 따른다. 본원에서는, 내인성 자극 (즉, 가수분해)에 반응하는 불안정한 화학을 기반으로 하는 분해를 조정할 수 있는 가수분해성 하이드로겔을 보고하는 것이다.
방법
하이드로겔 입자 (마이크로겔)는 과거 설명된 바와 같이 미세유체 유중수 액적 생성기에서 제조하였다 (Headen et al. Microsystems & Nanoengineering 4.1 (2018): 1-9). 중합체는 시험관 내 추적을 위한 1 kDa SH-PEG-FITC 또는 생체 내 이미징을 위한 SH-PEG-AF750으로 사전 작용화시켰다. 디티오트레이톨 (DTT), 또는 DTT와 분해성 링커인 에틸렌 글리콜 비스-머캅토아세테이트의 다양한 몰비의 혼합물을 함유하는 용액으로 마이크로겔을 가교결합시켰다. 생체 내 추적을 위해 마이크로겔을 마우스의 피부 아래에 주사하였다. 간략히 설명하면, 8-12주령의 Balb/C 마우스에 ~3000개의 비분해성 하이드로겔 (DTT 가교결합됨) 또는 분해성 하이드로겔 (DTT와 0.25 mM, 0.5 mM 또는 1 mM 분해성 링커의 혼합물) 100 uL를 주사하였다.
결과
마이크로겔의 분해는 dPBS 내 37℃의 마이크로겔 배양액 중에 팽윤 비율과 PEG-FITC 링커의 존재를 측정하여 추적하였다. 팽윤 비율은 제조시 분해성 링커의 몰농도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 1f). 분해성이 높은 하이드로겔은, 제조 후 4시간 이내에, 비분해성 하이드로겔에 비해 ~40%까지 팽창하였다 (p<0.0001). 배양 후 1개월까지, 1 mM의 분해성 하이드로겔은 DTT 비분해성 하이드로겔 크기의 60%까지 팽창하였다 (P<0.0039). 처음에는 DTT, 0.25 mM 및 0.5 mM 그룹 간에 크기 차이가 관찰되지 않았는데, 30일째에는 이들의 크기는 비분해성 겔과 비교했을 때 30% 증가하였다 (각각 p<0.0001, p<0.019). 하이드로겔의 분해는 PEG-4MAL 백본으로부터 PEG-FITC 링커의 절단을 유도할 것이다 (도 1b). 이와 같이, 시간의 경과에 따른 배양물의 형광 강도를 추적하여 용액 내 PEG-FITC의 존재를 측정하였다. 팽윤 연구에서 관찰된 바와 같이, 1 mM의 분해성 하이드로겔 그룹에서 더 높은 형광 강도가 나타났다 (p<0.001 vs DTT). 분해성이 가장 낮은 겔과 DTT 가교결합된 하이드로겔을 비교했을 때 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 생체 내 분해를 평가하기 위해, IVIS 이미징 시스템을 사용하여 마이크로겔을 모니터링하였다 (도 16a-b). 주입 직후, 모든 그룹에서 강한 신호가 감지되었다. 1일째에, 신호는 모든 그룹에서 약 38% 감쇠되었는데, 이는 분해로 인한 것이 아닌, 제조 중 유리 염료의 존재에 기인한 것일 수 있다. 3일째에, 1 mM의 하이드로겔 그룹에서는 신호가 33%로 감소한 반면, DTT 주사 부위에서는 일정한 신호가 유지되었다. 10일째에는, 분해성이 높은 그룹에서는 검출가능한 신호가 관찰되지 않았던 반면에, DTT 마이크로겔 그룹에서는 아무런 변화도 관찰되지 않았다.
결론
미세유체 유중수 액적 생성기를 구현하면 단분산 가수분해성 하이드로겔을 제조할 수 있다. 비분해성 티올 링커와 함께 에틸렌 링커를 구현하면, 시험관 내 및 생체 내에서 제어가능한 지속적 물질 분해가 가능하다.
첨부된 청구범위의 조성물과 방법은 본원에 기술된 구체적인 조성물과 방법에 의해서 그 범위가 제한되는 것은 아니며, 이들은 청구범위의 몇 가지 측면들을 예시하기 위한 것이고, 기능적으로 동등한 임의의 조성물과 방법들도 청구범위 내에 포함시키고자 한다. 본원에 도시하여 설명한 것 이외의 조성물과 방법들에 대한 다양한 변형들도 첨부된 청구항의 범위 내에 포함시키고자 한다. 또한, 본 명세서에 개시된 대표적인 특정한 조성물과 방법 단계들에 대해서만 구체적으로 설명하였지만, 구체적으로 언급되어 있지 않더라도, 조성물과 방법 단계들의 다른 조합들도 첨부된 청구항의 범위 내에 포함시키고자 한다. 따라서, 단계, 구성요소, 성분 또는 구성성분의 조합을 본원에서 명시적으로 언급할 수도 있지만, 명시적으로 언급되어 있지 않더라도, 단계, 구성요소, 성분 또는 구성성분의 다른 조합들도 포함된다.
본원에 사용된 용어 "~을 포함하는" 및 이의 변형태는 "~을 함유하는"이라는 용어와 그 변형태와 동의어로 사용되며, 개방형이며 비제한적인 용어이다. 본원에서는 "~을 포함하는" 및 "~을 함유하는"이라는 용어들이 다양한 실시형태들을 설명하는데 사용되었지만, "~을 포함하는" 및 "~을 함유하는"이라는 말 대신에 "~로 필수적으로 이루어지는" 및 "~로 이루어지는"이라는 용어를 사용하여 보다 구체적인 실시형태들을 제시할 수 있고, 이들도 개시된다. 실시예에서나, 혹은 달리 명시한 경우를 제외하고는, 명세서와 청구범위에 사용된 성분들의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자들은 최소한으로 이해되어야 하고, 청구항의 범위에 균등론의 원칙 적용을 제한하려는 시도가 아니며, 유효 자릿수와 일반적인 반올림 접근법을 고려하여 해석되어야 한다.

Claims (45)

  1. 적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 함유하는 제1 가교결합제로 가교결합된 중합체 백본을 포함하는 하이드로겔:
    (I)
    상기 식에서,
    m과 n은 독립적으로 1 또는 2이고;
    A는 C2-C10 알킬이며;
    는 제1 가교결합제 내의 모이어티에 대한 부착 지점이다.
  2. 제1항에 있어서, m이 1인 것인, 하이드로겔.
  3. 제1항에 있어서, m이 2인 것인, 하이드로겔.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인 것인, 하이드로겔.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인 것인, 하이드로겔.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, A가 C2-C8 알킬, C2-C6 알킬 및 C2-C4 알킬로부터 선택되는 것인, 하이드로겔.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, A가 C2 알킬인 것인, 하이드로겔.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 백본이 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이의 작용화된 유도체를 포함하는 것인, 하이드로겔.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 백본이 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-아크릴레이트 (PEG-DA), 다중-아암형 (arm) 폴리(에틸렌 글리콜)-아크릴레이트 (PEG-Ac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디티올 (PEG-diSH), 폴리(에틸렌 글리콜)디비닐 설폰 (PEG-diVS), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)비닐 설폰 (PEG-VS), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-메타크릴레이트 (PEG-DMA), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-메타크릴레이트 (PEG-Mac), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-알릴 에테르 (PEG-diAE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-알릴 에테르 (PE-AD), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-비닐 에테르 (PEG-diVE), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 에테르 (PEG-VE), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-말레이미드 (PEG-diMI), 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드 (PEG-MI), 폴리(에틸렌 글리콜)-디-노보렌, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)노보렌, 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-비닐 카보네이트, 및 폴리에틸렌 글리콜 올리고푸마레이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것인, 하이드로겔.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 백본이 다중-아암형 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드를 포함하는 것인, 하이드로겔.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가교결합제가 중합체 백본과 반응할 수 있는 m + n 모이어티를 포함하고, 이때 m과 n은 제1항에 정의된 바와 같은 것인, 하이드로겔.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가교결합제가 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 것인, 하이드로겔:
    (II)
    상기 식에서,
    X1과 X2는 각각 중합체 백본과 반응할 수 있는 모이어티로부터 독립적으로 선택되고;
    L1과 L2는 각각 연결 모이어티로부터 독립적으로 선택되며;
    m, n 및 A는 제1항에서와 같이 정의된다.
  13. 제12항에 있어서, X1과 X2가 각각 -SH인 것인, 하이드로겔.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, L1과 L2가 각각 C1-C10 알킬로부터 독립적으로 선택되는 것인, 하이드로겔.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가교결합제가 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트)를 포함하는 것인, 하이드로겔.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가교결합제가 가수분해성인 것인, 하이드로겔.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 백본이 제2 가교결합제로 추가로 가교결합되는 것인, 하이드로겔.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 가수분해적으로 안정한 것인, 하이드로겔.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 것인, 하이드로겔.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 분해가 제1 가교결합제와 제2 가교결합제의 몰비를 변화시켜 조정가능한 것인, 하이드로겔.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 주사용 및/또는 이식용인 것인, 하이드로겔.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 막, 스펀지, 겔, 고체 스캐폴드, 방사 섬유, 직조형 또는 부직포형 메쉬, 나노입자, 또는 미세입자의 형태인 것인, 하이드로겔.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포를 추가로 포함하는, 하이드로겔.
  24. 중합체를 적어도 하나의 하기 화학식 I의 모이어티를 포함하는 제1 가교결합제와 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 합성하는 방법:
    (I)
    상기 식에서, 모든 변수들은 실시형태 1에서 정의된 바와 같다.
  25. 제24항에 있어서, 제1 가교결합제가 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 것인, 방법:
    (II)
    상기 식에서,
    X1과 X2는 각각 중합체 백본과 반응할 수 있는 모이어티로부터 독립적으로 선택되고;
    L1과 L2는 각각 연결 모이어티로부터 독립적으로 선택되며;
    m, n 및 A는 제1항에서와 같이 정의된다.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 제1 가교결합제가 에틸렌 글리콜 비스(머캅토아세테이트)를 포함하는 것인, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔을 제2 가교결합제와 반응시키는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 제2 가교결합제는 가수분해적으로 안정한 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 가교결합제가 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 것인, 방법.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료제 전달 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제가 세포, 단백질, 항체, 핵산, 성장 인자 또는 약물로부터 선택될 수 있는 것인, 치료제 전달 조성물.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 세포 배양 배지.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 조직 스캐폴드.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 생물반응기.
  34. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 상처 드레싱.
  35. 조직 성장의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 조직 성장을 촉진하는 방법으로서,
    표적 부위를 확인하는 단계; 및
    치료적 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 상기 표적 부위에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적 부위가 새로운 조직의 촉진이 필요한 조직 결함을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 표적 부위가 영상화 기법 (imaging modality)을 사용하여 확인되는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 영상화 기법이 CT, MRI, 또는 X-선으로부터 선택되는 것인, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 표적 부위에 주사되거나 이식되는 것인, 방법.
  40. 대상체의 표적 부위에 치료제를 전달하는 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의 제29항 또는 제30항의 치료제 전달 조성물을 상기 표적 부위에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 표적 부위가 질병 상태 또는 병태와 관련이 있는 것인, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 표적 부위가 종양인 것인, 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 부위가 영상화 기법을 사용하여 확인되는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 영상화 기법이 CT, MRI, 또는 X-선으로부터 선택되는 것인, 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 표적 부위에 주사되거나 이식되는 것인, 방법.
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