CN117795005A - 可水解降解的水凝胶及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了水凝胶，更特别地是含有可裂解的酯部分的可水解降解的水凝胶，以及其在如组织工程和治疗性递送等应用中的用途。

Description

可水解降解的水凝胶及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年5月26日提交美国临时申请号63/193,211的优先权的权益，该申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开涉及水凝胶，并且更特别地涉及可水解降解的水凝胶，其可用于诸如组织工程和治疗性递送等应用。

背景技术

细胞相容性生物材料和封装方法的研究已经向前推进了运载分子和细胞释放的治疗性递送机制的进步。合成水凝胶是由交联聚合物结构制成的网络，已被用来封装生物活性材料，如生长因子和细胞产品，生成可以支持和调节细胞行为的3D结构，对活力和生物活性运载功效的影响有限(Guan,X.,Avci-Adali,M.,E.,Cheng,H.,Kashaf,S.S.,Li,Y.,Chawla,A.,Jang,H.L.，和Khademhosseini,A.(2017).Development of hydrogelsfor regenerative engineering.Biotechnology Journal,12(5),1600394)。这些水凝胶系统的机械特性(诸如刚度和基质完整性)的可调节性，为在各种微环境中的使用提供了灵活性(Saxena,S.,Hansen,C.E.，和Lyon,L.A.(2014).Microgel Mechanics inBiomaterial Design.Accounts of Chemical Research,47(8),2426–2434和Guan,X.,Avci-Adali,M.,/>E.,Cheng,H.,Kashaf,S.S.,Li,Y.,Chawla,A.,Jang,H.L.，和Khademhosseini,A.(2017).Development of hydrogels for regenerativeengineering.Biotechnology Journal,12(5),1600394)。此外，采用可降解化学物质进行制造的能力构成了无创再生医学应用的主要优势，因为降解后，分解成分可以通过肾脏过滤排出体外(Saxena,S.,Hansen,C.E.，和Lyon,L.A.(2014).Microgel Mechanics inBiomaterial Design.Accounts of Chemical Research,47(8),2426–2434和Ulbrich,K.(1995).Synthesis of novel hydrolytically degradable hydrogels for controlleddrug release.Journal of Controlled Release,34(2),155–165)。

水凝胶微粒(微凝胶)，无论是悬浮状态还是作为颗粒状散装水凝胶的构建块，由于其高度可调节的机械特性、可注射性和高度的组织整合性，近年来已成为生物医学应用中有吸引力的平台(Daly,A.C.；Riley,L.；Segura,T.；Burdick,J.A.HydrogelMicroparticles for Biomedical Applications.Nat Rev Mater 2020,5(1),20–43)。与微凝胶物理特性(例如刚度、网格尺寸等)直接相关的设计参数之一是降解速率。聚合物的可降解交联机制可大致分为酶促、光降解、水解或这些机制的组合，这些机制对降解速率进行不同程度的控制(Koh,J.；Griffin,D.R.；Archang,M.M.；Feng,A.-C.；Horn,T.；Margolis,M.；Zalazar,D.；Segura,T.；Scumpia,P.O.；Di Carlo,D.Enhanced In VivoDelivery of Stem Cells Using Microporous Annealed Particle Scaffolds.Small2019,15(39),1903147,Griffin,D.R.；Weaver,W.M.；Scumpia,P.O.；Di Carlo,D.；Segura,T.Accelerated Wound Healing by Injectable Microporous Gel Scaffolds Assembledfrom Annealed Building Blocks.Nature Mater 2015,14(7),737–744,Muir,V.G.；Qazi,T.H.；Shan,J.；Groll,J.；Burdick,J.A.Influence of Microgel Fabrication Techniqueon Granular Hydrogel Properties.ACS Biomater.Sci.Eng.2021,7(9),4269–4281,Foster,G.A.；Headen,D.M.；González-García,C.；Salmerón-Sánchez,M.；Shirwan,H.；García,A.J.Protease-Degradable Microgels for Protein Delivery forVascularization.Biomaterials 2017,113,170–175,Photodegradable Hydrogels forDynamic Tuning of Physical and Chemical Properties https://www.science.org/doi/10.1126/science.1169494(2021年10月25日访问)，以及Carleton,M.M.；Sefton,M.V.Injectable and Degradable Methacrylic Acid Hydrogel Alters MacrophageResponse in Skeletal Muscle.Biomaterials 2019,223,119477)。这些方法中的大多数取决于在空间或时间上都不容易控制的刺激(Jo,Y.S.；Gantz,J.；Hubbell,J.A.；Lutolf,M.P.Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring AminoAcid Controlled Ester Hydrolysis.Soft Matter 2009,5(2),440–446)。

各种聚合物网络和交联结构可用于调节水凝胶的降解性和扩散性，从而允许对该平台的降解速率和释放谱进行复杂的控制(Jain,E.,Hill,L.,Canning,E.,Sell,S.A.，和Zustiak,S.P.(2017)).Control of gelation,degradation and physical propertiesof polyethylene glycol hydrogels through the chemical and physical identityof the crosslinker.Journal of Materials Chemistry B,5(14),2679–2691)。已经探索了以对降解速率进行不同程度控制的用于水凝胶的可降解交联的几种机制，包括酶促、光降解、酯基水解或这些方法的组合(Sung,B.,Kim,C.，和Kim,M.-H.(2015).Biodegradablecolloidal microgels with tunable thermosensitive volume phase transitions forcontrollabledrug delivery.Journal of Colloid and Interface Science,450,26–33，Stukel,J.,Thompson,S.,Simon,L.，和Willits,R.(2015).Polyethlyene glycolmicrogels to deliver bioactive nerve growth factor:Microgels to DeliverBioactive NGF.Journal of Biomedical Materials Research Part A,103(2),604–613，以及Kloxin,A.M.,Kasko,A.M.,Salinas,C.N.，和Anseth,K.S.(2009).PhotodegradableHydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.Science,324(5923),59–63)。越来越流行的降解技术集中于序列特异性酶促降解，其中释放取决于细胞进行的蛋白水解凝胶降解和内源酶促释放(Kroger,S.M.,Hill,L.,Jain,E.,Stock,A.,Bracher,P.J.,He,F.，和Zustiak,S.P.(2020).Design of Hydrolytically DegradablePolyethylene Glycol Crosslinkers for Facile Control of HydrogelDegradation.Macromolecular Bioscience,20(10),2000085以及Lueckgen,A.,Garske,D.S.,Ellinghaus,A.,Mooney,D.J.,Duda,G.N.，和Cipitria,A.(2019).Enzymatically-degradable alginate hydrogels promote cell spreading and in vivo tissueinfiltration.Biomaterials,217,119294)。通过改变肽交联剂的氨基酸序列，可以根据封装细胞的类型以及预期的移植环境调整降解。尽管这种方法已显示出希望，但降解取决于空间或时间上不易控制的外部刺激(Jo,Y.S.,Gantz,J.,Hubbell,J.A.，和Lutolf,M.P.(2009).Tailoring hydrogel degradation and drug release via neighboring aminoacid-controlled ester hydrolysis.Soft Matter,5(2),440–446)。另外，在制造期间使用的大量酶促裂解肽接头使得这种方法成为扩大到临床相关尺寸的昂贵方法，并且由于可降解肽序列可以被宿主免疫系统识别，因此具有免疫原性的潜力(Griffin,D.R.,Archang,M.M.,Kuan,C.H.,Weaver,W.M.,Weinstein,J.S.,Feng,A.C.,Ruccia,A.,Sideris,E.,Ragkousis,V.,Koh,J.,Plikus,M.V.,Di Carlo,D.,Segura,T.，和Scumpia,P.O.(2020).Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold impartsregenerative wound healing[Preprint].Bioengineering)。另一种得到大力开发的化学方法是水凝胶接头的光解裂解。这种降解方法通过在制造期间使用光可裂解化合物作为交联剂来依赖外部光源(Ji,H.,Xi,K.,Zhang,Q.，和Jia,X.(2017).Photodegradablehydrogels for external manipulation of cellular microenvironments with real-time monitoring.RSC Advances,7(39),24331–24337,Villiou,M.,Paez,J.I.，和delCampo,A.(2020).Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and TissueAdhesion.ACS Applied Materials&Interfaces,12(34),37862–37872，以及Kloxin,A.M.,Kasko,A.M.,Salinas,C.N.，和Anseth,K.S.(2009).Photodegradable Hydrogels forDynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.Science,324(5923),59–63)。可光降解水凝胶已用于不同的应用，诸如组织粘附，其中含有细胞的水凝胶经由受控光源解聚，从而允许细胞立即释放并从组织上脱离(Villiou,M.,Paez,J.I.，和del Campo,A.(2020).Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and TissueAdhesion.ACS Applied Materials&Interfaces,12(34),37862–37872)。这有利于诸如伤口敷料和受控细胞疗法治疗等应用，其中释放速率可控制(Villiou,M.,Paez,J.I.，和delCampo,A.(2020).Photodegradable Hydrogels for Cell Encapsulation and TissueAdhesion.ACS Applied Materials&Interfaces,12(34),37862–37872)。然而，考虑到患者依从性和组织深度限制的需要，光降解很可能不是长期运载释放的最佳选择。

显然需要能够在体内受控降解的水凝胶，这可用于组织工程和治疗性递送应用。本公开解决了这个需求以及其他需求。

发明内容

本公开提供了可水解降解并且能够在体内受控降解的水凝胶。所公开的水凝胶可以证明可用于组织工程、药物递送和再生医学的应用。与先前公开的可降解水凝胶(诸如使用PEG基的可降解交联剂的那些)相比，目前公开的水凝胶由于其增加的疏水性和更紧凑的尺寸在制造中显示出优势。

在一个方面，提供了一种水凝胶，其包含与含有至少一个式I部分的第一交联剂交联的聚合物主链：

其中所有变量如本文所定义。

另一方面，用于合成如本文所述的水凝胶的方法包括使聚合物与包含至少一个式I部分的第一交联剂反应。

还提供了包含本文所述的水凝胶和一种或多种治疗剂的治疗性递送组合物。还提供了一种向受试者的靶位点递送治疗剂的方法，该方法包括向靶位点施用治疗有效量的本文所述的治疗性递送组合物。

进一步提供了包含本文所述的水凝胶的细胞培养基、组织支架、生物反应器和伤口敷料。

提供了一种促进有此需要的受试者的组织生长的方法，该方法包括：

识别靶位点；以及

向靶位点施用治疗有效量的本文所述的水凝胶。

在附图和以下描述中阐述本公开的一个或多个实施例的细节。根据描述和附图以及根据权利要求，本公开的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1A至1K示出可水解降解的微凝胶可以通过添加含酯的二硫醇交联剂来制备。图1A)PEG-4MAL大分子单体用线性PEG FITC修饰，并通过流动聚焦微流控芯片进行分段，其中连续相含有小二硫醇分子、DTT和EGBMA。这产生了可以进行荧光追踪的单分散微凝胶。比例尺1mm。图1B至1E)基于油相中EGBMA浓度的微凝胶的尺寸分布。插图表示单个微凝胶制造后的强度，证明了使用线性PEG-FITC追踪器对大分子单体主链的类似修饰，最少n＝36，从3个独立的微流控运行中汇集。图1F至1G)微凝胶在水性缓冲液中的溶胀与交联相中EGBMA接头的摩尔浓度成正比，每个样品最少n＝6。图1H)溶液中释放的PEG-FITC的追踪取决于微凝胶中的EGBMA浓度。图1I)在锥形微毛细管中通过施加的压力而变形的微凝胶的第3天图像。图1J)在水性缓冲液中孵育3天后，用不同浓度的EGBMA制造的受限微凝胶的剪切应力与应变，n＝6，总计>60点。1K)暴露于水性缓冲液不同时间后所有微凝胶制剂的剪切模量的定量，n＝6。所有数据均以平均值±s.e.m.呈现。除非另有说明，否则使用混合效应模型分析溶胀数据，并使用Tukey校正进行多重比较；使用双向方差分析和Tukey校正对剪切模量进行分析，以进行多重比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.0001。

图2A至2D示出，在不存在粘附线索和炎症信号的情况下，微凝胶与单核细胞的共培养物不会诱导活化。孵育后48小时的细胞存活未显示出由于共培养物中微粒的存在而引起的任何变化。标记物CD45、F4/80、CD206的表达在所有测试组中是等效的。d-插图表示共培养物中CD206相对于所有细胞表达F4/80的倍数表达。最少n＝6，所有数据均以平均值±s.e.m.呈现。使用单向方差分析和Tukey校正对数据进行分析，以进行多重比较。

图3A至3E示出皮下微凝胶植入物的降解与EGBMA接头的浓度成正比。图3A)使用近红外PEG接头制造微凝胶并注射在背部皮下袋中的方案。注射后和外植体后不同时间点处的植入物袋的代表性图像。图3B)在整整一个月进程内和外植体后所有制剂的平均归一化辐射效率(垂直虚线后面的点)。图3C至3E)植入后第0、9和25天归一化辐射效率的定量。所有数据均以DTT的n＝5名接受者、所有其他组的n＝10名接受者的平均值±s.d.最小值呈现。使用Dunnett多重比较分析的单向方差分析计算P值，**p<0.05，***p<0.0005，****p<0.0001。

图4A至4G示出骨髓细胞募集和极化是通过注射后7天时合成微凝胶植入物的降解调节的。对来自含有不可降解和可降解微凝胶的不同制剂的皮下植入物袋的骨髓标记物CD11b、F4/80、MHCII和CD206进行流式细胞术分析和定量。所有数据均以n＝4名接受者的平均值±s.e.m.最小值呈现。P值是使用单向方差分析计算的，通过控制错误发现率来校正多重比较。

图5A至5H示出淋巴细胞募集是由注射后7天合成微凝胶植入物的降解控制的。对来自含有不可降解和可降解微凝胶的不同制剂的皮下植入物袋的淋巴细胞标记物CD3、CD4、CD8、CD25和PD-1进行流式细胞术分析和定量。所有数据均以n＝4名接受者的平均值±s.e.m.最小值呈现。P值是使用单向方差分析计算的，通过控制错误发现率来校正多重比较。

图6A至6F示出细胞因子对可植入合成微凝胶的反应是动态的并且由IFN-γ反应主导，该IFN-γ反应可通过可植入材料的降解潜力而改变。图6A)在接受不同合成微凝胶制剂的动物的植入物组织中测量的32种细胞因子的主成分分析。箭头颜色和方向指示对PCA的每个维度的贡献。图6B)使用皮尔逊相关系数评定所有测量的细胞因子的细胞因子相关性。图6C)左：基于皮尔逊相关性的细胞因子层次聚类、树状图和细胞因子名称表示模块成员。图6D)所有细胞因子与IFN-γ的相关性图。图6E至6F)箱线图示出GM-CSF和IL-4的细胞因子浓度，其中原始值以log10标度绘制。每个接受者最少n＝6。呈现的P值来自估计的边际平均值(EMM)比较。

图7示出易水解的乙烯接头用于微粒交联以制造用于治疗性递送的可降解液滴微流控基微凝胶。体内酯基降解所赋予的可调节性和降解性调节免疫细胞对植入位点的浸润和宿主免疫极化。

图8是制备后的PEG-4MAL大分子单体和微凝胶的¹H NMR谱。

图9A至9C示出毛细管微观力学的实验设置。图9A)锥形玻璃微量移液器(Fivephoton Biochemicals)具有以下尺寸：尖端内径＝50μm；底座外径＝1.5mm；长度＝5.5cm；锥形样式＝长。高精度压力调节器(Elveflow)向含有微凝胶的微量移液器施加压力。将微量移液器浸入1％ BSA中以促进最佳的流动动力学。当外部施加的压力与内部弹性应力平衡时，微凝胶会变形直至它达到平衡。微量移液器尖端下的显微镜(EVOS)采集图像(10X)，随后在ImageJ中分析图像。图9B)锥形区域中的微凝胶几何形状。微凝胶与具有平均半径Rband和平均长度Lband的壁接触。锥角为θ。随着压力p增加，Lband增加而Rband减少。如前所述(Wyss等人，Soft Matter,2010)，根据这些测量值计算弹性特性。图9C)微凝胶响应压力增加而变形的图像系列。

图10示出用所有微凝胶制剂(可降解的和不可降解的)处理的RAW 264.7巨噬细胞的体外细胞毒性。该图表示通过Alamar Blue测定确定的7天共培养期间的细胞活力。数据表示平均值的平均标准差(n＝4)。单向方差分析未发现统计差异。

图11A至11D示出，在不存在粘附线索和炎症信号的情况下，微凝胶与单核细胞的共培养物不会诱导活化。图11A至11D)孵育后96小时的细胞存活未显示出由于共培养物中微粒的存在而引起的任何变化。标记物CD45、F4/80、CD206的表达在所有测试组中都是一致的。11D-插图表示共培养物中CD206相对于所有细胞表达F4/80的倍数表达。所有数据均以平均值±s.e.m呈现，n＝3。使用单向方差分析和Tukey校正对数据进行分析，以进行多重比较。

图12A至12F提供了示出细胞因子浓度与以log10标度绘制的原始值以及所有时间点的估计的边际平均值(EMM)比较的箱线图。每组n＝6。

图13A至13D提供了示出细胞因子浓度与以log10标度绘制的原始值以及所有时间点的估计的边际平均值(EMM)比较的箱线图。每组n＝6。

图14是注射在背部皮下空间中的微凝胶植入后第30天的H&E染色。

图15示出注射后30天后背部微凝胶植入物的免疫组织化学评定。样品进行泛巨噬细胞标记物CD68(红色)和核标记物DAPI(蓝色)染色。微凝胶区域由白色虚线表示。插图表示微凝胶周围区域的20X代表性图像。插图比例尺20μm，10X图像50μm。

图16A和16B示出体外和体内可降解水凝胶特性。图16A)移植到小鼠皮下空间的水凝胶的体内追踪。图16B)IVIS成像证明了微凝胶的定位以及荧光强度随时间的变化。

各个图式中的相同参考符号指示相同元件。

具体实施方式

提供本公开的以下描述以作为本公开在其最佳的、当前已知的实施例中的有效教导。得益于在前述描述和相关附图中呈现的教导，所公开的组合物和方法所属领域的技术人员将想到本文所公开的许多修改和其他实施例。因此，应当理解，本公开不限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。技术人员将认识到本文描述的方面的许多变体和适应性修改。这些变体和适应性修改旨在被包括在本公开的教导中并且为本文的权利要求所涵盖。

尽管本文使用了特定的术语，但是它们仅用于一般的和描述性的意义，而不是为了限制的目的。

本领域技术人员在阅读本公开后可明白，本文描述和图示的每个单独实施例具有离散的组分和特征，该组分和特征可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合而不背离本公开的范围或精神。

任何记载的方法都可以按照记载的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。也就是说，除非另做明确陈述，否则不旨在将本文中所阐述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求在权利要求书或说明书中未具体陈述步骤被限制为特定顺序的情况下，在任何方面，绝不旨在推断顺序。这适用于任何可能的用于解释的非表达基础，包含关于步骤安排或操作流程的逻辑的事项、从语法组织或标点得到的普通含义或在说明书中描述的方面的数量或类型。

在此提及的所有公开是通过引用结合在此，以结合所引用的这些公开来公开和描述这些方法和/或材料。本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应被视为承认本发明因现有发明而无权先于此类出版物。进一步，本文提供的公开的日期可以不同于实际的公开日期，这可能需要独立的确认。

还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不旨在是限制性的。除非另做定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与所公开的组合物和方法所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。可进一步理解，术语诸如在常用词典中定义的那些术语应被解释为具有与其在说明书和相关领域的背景下的含义一致的含义，并且除非本文中明确地定义，否则将不应在理想化的或过度正式的意义上进行解释。

在描述本公开的各个方面之前，提供以下定义并且除非另做指示，否则应当使用以下定义。其他术语可以在本公开的其他地方定义。

如本文所用，“包含/包括”应解释为指定所提及的所陈述特征、整体、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个特征、整体、步骤或组件或它们的组的存在或添加。此外，术语“由”、“包含”、“由…组成”、“包括”、“涉及”和“诸如”以其开放的、非限制性的含义使用并且可以互换使用。此外，术语“包含/包括”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”所涵盖的实例和方面。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”所涵盖的实例。

如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文中另有明确规定。因此，例如，提及“细胞”、“组织”或“水凝胶”包括但不限于两个或更多个此类细胞、组织或水凝胶等。

应当注意的是，比率、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式表达。可进一步理解，每个范围的端点相对于另一端点，以及独立于另一端点都是显著的。还应理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中还被公开为“约”为除了所述值本身之外的所述特定值。例如，如果公开值“10”，则还公开“约10”。在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，可以理解，特定值形成另一方面。例如，如果公开了值“约10”，则也公开了“10”。

当表达范围时，另一方面包含从一个特定值和/或至另一个特定值。例如，当所陈述的范围包括一个或两个限制时，排除这些所包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中，例如短语“x至y”包括从‘x’至‘y’的范围以及大于‘x’且小于‘y’的范围。该范围也可以表示为上限，例如‘约x、y、z或更少’并且应当被解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的具体范围以及‘小于x’、‘小于y’和‘小于z’的范围。同样，短语‘约x、y、z或更大’应解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的具体范围以及‘大于x’、‘大于y’和‘大于z’的范围。另外，短语“大约‘x’至‘y’”，其中‘x’和‘y’为数值，包括“大约‘x’至大约‘y’”。

应当理解，此类范围格式是为了方便和简洁而使用的，并且因此，应当以灵活的方式解释为不仅包括作为范围界限而明确列举的数值，而且包括该范围内涵盖的所有单个数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确列举一样。为了说明，“约0.1％至5％”的数值范围应当解释为不仅包括明确列举的约0.1％至约5％的值，而且还包括所指示范围内的单独的值(例如，约1％、约2％、约3％和约4％)和子范围(例如，约0.5％至约1.1％；约5％至约2.4％；约0.5％至约3.2％，和约0.5％至约4.4％，以及其他可能的子范围)。

如本文所用，术语“约”、“大约”、“等于或约”和“基本上”意指所讨论的量或值可以是精确值或提供如权利要求或本文教导中所引用的等效结果或效应的值。也就是说，应当理解，量、大小、调配物、参数和其它数量和特性不是并且不必是精确的，而是根据需要可以是近似的和/或更大或更小，从而反映公差、转换因子、舍入、测量误差等，以及本领域的技术人员已知的其它因素，从而获得等效结果或效应。在一些情况下，无法合理地确定提供等效结果或效应的值。在此类情况下，一般应理解，如本文所用，除非另做指示或推断，否则“约”和“等于或约”意为所指示的标称值±10％变化。一般而言，量、尺寸、制剂、参数或其他数量或特征为“约”、“近似”或“等于或约”，无论是否明确如此陈述。应当理解，在定量值之前使用“约”、“大约”或“处于或大约”的情况下，除非另做具体陈述，参数还包括特定的定量值本身。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗结果或对不期望的症状具有效应，但一般不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包含所治疗的疾患和疾患的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用的具体组合物的施用时间、施用途径、排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体组合物组合或同时使用的药物以及处于健康护理人员的知识和专业知识范围内且可能在医学领域中熟知的类似因素。在治疗特定疾病或病症的情况下，在一些情况下，期望的应答可以是抑制疾病或病症的进展。这可能涉及仅暂时减缓疾病的进展。然而，在其他情况下，可能需要永久停止疾病的进展。这可以通过本领域普通技术人员已知的针对任何特定疾病的常规诊断方法来监测。对疾病或病症治疗的期望应答还可以是延迟疾病或病症的发作或者甚至预防疾病或病症的发作。

例如，以比实现期望治疗效果所需的剂量水平低的剂量水平开始使用组合物并且逐渐增加剂量直到期望效果得以实现完全处于本领域的技术范围内。如果需要，出于施用的目的，有效日剂量可以分成多个剂量。因此，单剂量组合物可以含有此类量或其约数以构成日剂量。在有任何禁忌症的情况下，可以由个别医师调整剂量。一般优选使用本发明药理学试剂(单独或与其他治疗剂组合)的最大剂量，即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员应当理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可能坚持较低剂量或可耐受剂量。

对所公开的组合物的治疗有效剂量的应答可以通过确定治疗或药物的生理效应来测量，诸如施用治疗或药剂后疾病症状的减少或缺乏。其他测定对于本领域普通技术人员来说是已知的并且可以用于测量应答水平。治疗的量可以例如通过增加或减少所公开的组合物的量、通过改变施用的所公开的组合物、通过改变施用途径、通过改变剂量时间等来改变。剂量可以变化，并且可以以每天一次或多次剂量施用来进行施用，持续一天或数天。可以在文献中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。

如本文所用，术语“预防有效量”是指有效预防疾病或病症的发作或启动的量。

如本文所使用的，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指妨碍、防止、避免、预先阻止、停止或阻碍某些事情发生，尤其是通过提前动作。应当理解，在本文使用降低、抑制或预防的情况下，除非另外明确指明，否则还明确公开了其它两个词语的使用。

如本文所使用的，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可以或可以不发生，并且所述描述包含所述事件或情形发生的情况以及所述事件或情形不发生的情况。

如本文中可互换使用的，“受试者”、“个体”或“患者”可以指脊椎动物生物体，诸如哺乳动物(例如人)。“受试者”还可以指细胞、细胞群、组织、器官或生物体，优选指人及其成分。

如本文所用，术语“治疗”及“处理”一般可以指获得期望的药理学和/或生理学效应。该效应可以是但不一定必须是预防性的，即预防或部分地预防疾病、其症状或病症，诸如组织缺损。该效应可以是治疗性的，即部分或完全地治愈疾病、病症、症状或归因于该疾病、疾患或病症的副作用。如本文所用，术语“治疗”可包括对受试者(特别是人)的疾患的任何治疗，并且可包括以下中的任一项或多项：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻滞其发展；以及(c)缓解疾病，即减轻或改善疾病和/或其症状或病症。如本文所用，术语“治疗”可以指单独的治疗性治疗、单独的预防性治疗、或治疗性治疗和预防性治疗两者。需要治疗的那些(有此需要的受试者)可以包括已经患有该病症的那些和/或其中待预防该病症的那些。如本文所用，术语“治疗”可包括抑制疾病、疾患或病症，例如，阻止其进展；以及缓解疾病、疾患或病症，例如，引起疾病、疾患和/或病症的消退。治疗疾病、疾患或病症可包括改善特定疾病、疾患或病症的至少一种症状，即使潜在的病理生理学不受影响，例如，诸如通过施用镇痛剂来治疗受试者的疼痛，即使这种药物不能治疗疼痛的原因。

如本文所用，“剂量(dose)”、“单位剂量”或“剂量(dosage)”可以指适合在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位含有预定数量的所公开的化合物和/或其药物组合物，该数量经计算以产生与其施用相关的一种或多种期望的应答。

如本文所用，“治疗性”可以指治疗、治愈和/或改善疾病、疾患、病症或副作用，或者指降低疾病、疾患、病症或副作用的进展速率。

使用标准命名法描述化合物。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与该发明所属领域中的技术人员通常所理解相同的含义。

本文所述的化合物包括对映异构体、对映异构体的混合物、非对映异构体、互变异构体、外消旋体和其他异构体，诸如旋转异构体，如同各自被具体描述一样，除非另做指示或另外被上下文排除。应当理解，本文提供的化合物可以含有手性中心。此类手性中心可以是(R-)或(S-)构型。本文提供的化合物可以是对映异构体纯的，或者是非对映异构体或对映异构体混合物。应当理解，本文提供的化合物的手性中心可以在体内经历差向异构化。因此，本领域技术人员将认识到，对于体内经历差向异构化的化合物，施用(R-)形式的化合物与施用(S-)形式的化合物是等效的。除非有相反陈述，否则具有仅示出为实线而不是楔形或虚线的化学键的式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物，以及异构体的混合物，诸如外消旋混合物或比例混合物。

没有处于两个字母或者符号之间的破折号(“-”)用于指示取代基的附接点。例如，-(C＝O)NH₂通过酮基(C＝O)基团的碳连接。

本文所用的术语“取代的”意指指定原子或基团上的任何一个或多个氢被选自指示基团的部分替换，只要不超过指定原子的正常价并且所得化合物是稳定的。例如，当取代基是氧代(即＝O)时，则原子上的两个氢被替换。例如，被氧代取代的吡啶基是吡啶。取代基和/或变量的组合仅当此类组合产生稳定的化合物或有用的合成中间体时，才被允许。稳定的活性化合物是指可以分离并可以配制成具有至少一个月保质期的剂型的化合物。如果活性化合物的稳定制造中间体或前体在反应或其他用途所需的时间内不降解，则其是稳定的。稳定的部分或取代基是在使用所需的时间内不会降解、反应或分解的部分或取代基。不稳定的部分的非限制性实例是以不稳定的排列组合杂原子的那些，如本领域技术人员通常已知和可识别的。

任何合适的基团可以存在于形成稳定分子并满足本发明所需目的的“取代的”或“任选取代的”位置上，并且包括但不限于：烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤代、羟基、酮基、硝基、氰基、叠氮基、氧代、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜、磺酰基氨基或硫醇。

“烷基”是直链或支链饱和脂族烃基团。在某些实施例中，烷基是C₁-C₂、C₁-C₃或C₁-C₆(即烷基链长度可以是1、2、3、4、5或6个碳)。本文所用的指定范围指示烷基，该范围的每个成员的长度被描述为独立种类。例如，本文所用的C₁-C₆烷基指示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基，并且旨在意指这些中的每一个被描述为独立的种类并且本文所用的C₁-C₄烷基指示具有1、2、3或4个碳原子的烷基并且旨在意指这些中的每一个被描述为独立的种类。当C₀-C_n烷基在本文中与另一基团例如(C₃-C₇环烷基)C₀-C₄烷基或-C₀-C₄(C₃-C₇环烷基)结合使用时，所指示的基团(在这种情况下是环烷基)直接通过单个共价键(C₀烷基)结合，或通过烷基链(在这种情况下是1、2、3或4个碳原子)连接。烷基还可以经由其他基团诸如杂原子连接，如在-O-C₀-C₄烷基(C₃-C₇环烷基)中。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷和2,3-二甲基丁烷。在一个实施例中，烷基任选地如本文所述被取代。

“环烷基”是饱和单环或多环烃环系统。当由两个或更多个环组成时，这些环可以以稠合或桥接的方式连接在一起。典型环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。在一个实施例中，环烷基任选地如本文所述被取代。

“烯基”是具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链脂族烃基团，碳-碳双键中的每一个独立地为顺式或反式，其可出现在沿链的稳定点处。非限制性实例包括C₂-C₄烯基和C₂-C₆烯基(即，具有2、3、4、5或6个碳)。如本文所用的指定范围指示具有作为独立种类描述的范围的每个成员的烯基，如上文针对烷基部分所述。烯基的实例包括但不限于乙烯基和丙烯基。在一个实施例中，烯基任选地如本文所述被取代。

“炔基”是具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链脂族烃基团，该碳-碳三键可出现在沿链的任何稳定点处，例如C₂-C₄炔基或C₂-C₆炔基(即，具有2、3、4、5或6个碳)。如本文所用的指定范围指示具有作为独立种类描述的范围的每个成员的炔基，如上文针对烷基部分所述。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。在一个实施例中，炔基任选地如本文所述被取代。

“烷氧基”是通过氧桥(-O-)共价结合的如上所定义的烷基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、正己氧基、2-己氧基、3-己氧基和3-甲基戊氧基。类似地，“烷硫基”或“硫代烷基”基团是通过硫桥(-S-)共价结合的具有指示数量的碳原子的如上所定义的烷基。在一个实施例中，烷氧基任选地如本文所述被取代。

“烷酰基”是通过羰基(C＝O)桥共价结合的如上所定义的烷基。羰基碳包括在碳数中，例如C₂烷酰基是CH₃(C＝O)-基团。在一个实施例中，烷酰基任选地如本文所述被取代。

“卤代”或“卤素”独立地指示氟、氯、溴或碘中的任一者。

“芳基”指示在一个或多个芳香环中仅含有碳的芳香族基团。在一个实施例中，芳基含有1至3个单独的或稠合的环并且为6至14或18个环原子，没有杂原子作为环成员。当指示时，此类芳基可进一步被碳或非碳原子或基团取代。此类取代可包括与4元至7元或5元至7元饱和或部分不饱和环状基团稠合，该环状基团任选地含有1、2或3个独立地选自N、O、B、P、Si和S的杂原子，以形成例如3,4-亚甲基二氧基苯基。芳基包括例如苯基和萘基，包括1-萘基和2-萘基。在一个实施例中，芳基是侧基。侧环的实例是被苯基取代的苯基。在一个实施例中，芳基任选地如本文所述被取代。

术语“杂环”是指饱和和部分饱和的含杂原子的环基团，其中杂原子可选自N、O和S。术语杂环包括单环3-12元环，以及双环5-16元环系统(它可包括稠合、桥接或螺双环系统)。它不包括含有-O-O-、-O-S-和-S-S-部分的环。饱和杂环基团的实例包括含有1至4个氮原子的饱和4元至7元单环基团[例如,吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯啉基、氮杂环丁烷基、哌嗪基和吡唑烷基]；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和4元至6元单环基团[例如,吗啉基]；以及含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和3元至6元杂单环基团[例如，噻唑烷基]。部分饱和杂环基团的实例包括但不限于二氢噻吩基、二氢吡喃基、二氢呋喃基和二氢噻唑基。部分饱和和饱和杂环基团的实例包括但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、吡咯啉基、吡唑烷基、哌嗪基、吗啉基、四氢吡喃基、噻唑烷基、二氢噻吩基、2,3-二氢-苯并[1,4]二噁烷基、吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、1,2-二氢喹啉基、1,2,3,4-四氢-异喹啉基、1,2,3,4-四氢-喹啉基、2,3,4,4a,9,9a-六氢-1H-3-氮杂-芴基、5,6,7-三氢-1,2,4-三唑并[3,4-a]异喹啉基、3,4-二氢-2H-苯并[1,4]噁嗪基、苯并[1,4]二噁烷基、2,3,-二氢-1H-苯并[d]异噻唑-6-基、二氢吡喃基、二氢呋喃基和二氢噻唑基。双环杂环包括其中杂环基团与芳基稠合的基团，其中连接点是杂环。双环杂环还包括与碳环基团稠合的杂环基团。代表性实例包括但不限于含有1至5个氮原子的部分不饱和稠合杂环基团，例如吲哚啉和异吲哚啉，含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的部分不饱和稠合杂环基团，含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的部分不饱和稠合杂环基团，以及含有1至2个氧或硫原子的饱和稠合杂环基团。

“杂芳基”是指稳定的单环、双环或多环芳香环，该芳香环含有1至4个、或在一些实施例中1、2或3个选自N、O、S、B和P(并且通常选自N、O和S)的杂原子，其中剩余环原子为碳，或含有至少一个5元、6元或7元芳香环的稳定双环或三环系统，该芳香环含有1至4个、或在一些实施例中1至3个或1至2个选自N、O、S、B或P的杂原子，其中剩余环原子为碳。在一个实施例中，唯一的杂原子是氮。在一个实施例中，唯一的杂原子是氧。在一个实施例中，唯一的杂原子是硫。单环杂芳基通常具有5至6个环原子。在一些实施例中，双环杂芳基是8元至10元杂芳基，即含有8或10个环原子的基团，其中一个5元、6元或7元芳香环稠合至第二芳香环或非芳香环，其中连接点是芳香环。当杂芳基中S和O原子的总数超过1时，这些杂原子彼此不相邻。在一个实施例中，杂芳基中S和O原子的总数不超过2。在另一个实施例中，杂芳基中S和O原子的总数不超过1。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、三唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃吡啶基。

在一个方面，提供了一种水凝胶，其包含与含有至少一个式I部分的第一交联剂交联的聚合物主链：

其中：

m和n独立地为1或2；

A为C₂-C₁₀烷基；并且

为用于第一交联剂内的部分的连接点。

在式I的一些实施例中，m为1。在式I的一些实施例中，m为2。在式I的一些实施例中，n为1。在式I的一些实施例中，n为2。

在式I的一些实施例中，A选自C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基、C₇烷基、C₈烷基、C₉烷基或C₁₀烷基。在式I的一些实施例中，A选自乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。

在一些实施例中，式I部分可选自：

聚合物主链可以由可用于制备水凝胶的任何聚合物或聚合物的组合组成。如本领域已知的，水凝胶是通过交联一种或多种多官能分子或聚合物形成的聚合物网络。所得聚合物网络是亲水性的并且在水性环境中溶胀，因此形成凝胶状材料，即水凝胶。通常，水凝胶包含与交联剂(诸如本文所述的第一交联剂)键合的主链。

水凝胶的特征在于其不溶于水、亲水性、高吸水性和可溶胀特性。水凝胶的分子组分、单元或片段的特征在于亲水性组分、单元或片段的显著部分，诸如能够形成氢键或具有离子物质或可解离物质的片段，诸如酸(例如，羧酸、膦酸、磺酸、亚磺酸、次膦酸等)、碱(例如胺基、质子接受基团等)或其他在浸入水中时产生离子特性的基团(例如磺酰胺)。丙烯酰基(以及较小程度的甲基丙烯酰基)和含有氧化烯单元或以氧化烯单元封端的丙烯酸类聚合物或聚合物链(诸如聚氧乙烯链和聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物链)也被公认为是可以存在于亲水性聚合物内的亲水片段。下面提供了代表性的水不溶性聚合物组合物，尽管可以不同程度地使用本领域已知的整个类别的水凝胶材料。作为选择，下文阐述的且含有酸性基团的聚合物可以用单体或聚合物或两者中的碱金属碱部分或完全中和。

可包含聚合物主链的一些代表性聚合物包括但不限于：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、它们的共聚物、以及它们的碱金属盐和铵盐；淀粉和丙烯酸、淀粉和皂化丙烯腈、淀粉和皂化丙烯酸乙酯的接枝共聚物、以及皂化丙烯酸酯-乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基烷基醚、聚氧化乙烯、聚丙烯酰胺以及它们的共聚物；马来酸酐和烷基乙烯基醚的共聚物；以及丙烯腈、丙烯酸酯、乙酸乙烯酯的皂化淀粉接枝共聚物，以及丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸的淀粉接枝共聚物。

在一些实施例中，聚合物主链可包含生物聚合物。在一些实施例中，生物聚合物可以以提供能够与第一交联剂交联的官能性的方式被官能化或改性。可以使用的生物聚合物的代表性实例包括但不限于胶原、明胶、纤维蛋白、透明质酸、弹性蛋白、果胶、琼脂糖、糖胺聚糖、藻酸盐、纤维素、DNA、RNA或它们的官能化衍生物。

在一些实施例中，聚合物主链包含聚(乙二醇)或其官能化衍生物。此类聚合物主链的代表性实例可以由聚合物形成，包括但不限于聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙二醇)-二丙烯酸酯(PEG-DA)、多臂聚(乙二醇)-丙烯酸酯(PEG-Ac)、聚(乙二醇)-二硫醇(PEG-diSH)、聚(乙二醇)二乙烯基砜(PEG-diVS)、多臂聚(乙二醇)乙烯基砜(PEG-VS)、聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、多臂聚(乙二醇)-甲基丙烯酸酯(PEG-Mac)、聚(乙二醇)-二烯丙基醚(PEG-diAE)、多臂聚(乙二醇)-烯丙基醚(PE-AD)、聚(乙二醇)-二乙烯基醚(PEG-diVE)、多臂聚(乙二醇)-乙烯基醚(PEG-VE)、聚(乙二醇)-二马来酰亚胺(PEG-diMI)、多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺(PEG-MI)、聚(乙二醇)-二降冰片烯、多臂聚(乙二醇)降冰片烯、聚(乙二醇-碳酸乙烯酯)、多臂聚(乙二醇)-碳酸乙烯酯和聚乙二醇低聚富马酸酯。

在一些特定实施例中，聚合物主链可由多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺形成。

上述示例性聚合物可以在聚合期间或聚合之后使用本文所述的第一交联剂和任选地一种或多种另外的交联剂进行交联。交联可以使用本领域技术人员已知的方法进行，诸如例如在经由自由基引发剂的辐射的存在下经由引发而进行。

第一交联剂包含至少两个能够与聚合物主链反应的部分。聚合物主链本身具有可与第一交联的至少两个部分反应以形成共价键的活性基团。一般理解，第一交联剂内存在的式I部分一旦交联，就会导致观察到的本文提供的水凝胶的水解降解特性。

在一些实施例中，第一交联剂包含一种式II化合物：

其中：

X¹和X²在每次出现时独立地选自能够与聚合物主链反应的部分；

L¹和L²在每次出现时独立地选自连接部分；并且

m、n和A如权利要求1中所定义。

在式II的一些实施例中，m为1。在式II的一些实施例中，m为2。在式II的一些实施例中，n为1。在式II的一些实施例中，n为2。

在式II的一些实施例中，A选自C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基、C₇烷基、C₈烷基、C₉烷基或C₁₀烷基。在式II的一些实施例中，A选自乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。

在一些实施例中，式II化合物选自：

X¹和X²可以各自独立地是能够与聚合物主链中发现的活性基团或部分反应的任何合适的官能化部分。此类基团的代表性实例包括但不限于卤代、羟基、氨基、硫醇、羧酸、酯等。在一些实施例中，基团X¹和X²可各自独立地包含可聚合的基团，诸如环氧乙烷基、丙烯酰基或甲基丙烯酰基等。在特定实施例中，X¹和X²各自是-SH。

L¹和L²可以各自独立地包含键或任何其他合适的连接部分，该连接部分将部分X¹和X²共价连接至其所连接的相应羰基。在一些实施例中，L¹和L²可以独立地选自C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、C₁-C₆卤代烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₃-C₆环烷基、3元至8元单环或双环杂环、6元至10元单环或双环芳基、5元至10元单环或双环杂芳基、或它们的任何合适的组合，它们各自可任选地如本文所述被取代。

在一些实施例中，L¹和L²各自独立地选自C₁-C₁₀烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。在特定实施例中，L¹和L²各自是亚甲基。

在特定实施例中，第一交联剂包含乙二醇双(巯基乙酸酯)。

在一些实施例中，聚合物主链进一步与第二交联剂交联。在此类实施例中，第二交联剂通常是水解稳定的，即，不含有如第一交联剂内发现的式I部分或在水凝胶预期使用的条件下可水解裂解的任何其他部分。在特定实施例中，第二交联剂可包含二硫苏糖醇(DTT)。

在含有第二交联剂的实施例中，水凝胶的降解可以是通过改变第一交联剂与第二交联剂的摩尔比可调节的。在一些实施例中，第一交联剂与第二交联剂的摩尔比范围可以为约100:1至约1:100，例如约90:1、约80:1、约70:1、约60:1、约50:1、约40:1、约30:1、约25:1、约20:1、约15:1、约10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:10、约1:15、约1:20、约1:25、约1:30、约1:40、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。本领域技术人员可以容易地理解，第一交联剂与第二交联剂的较高摩尔比将导致水解降解增加和降解时间缩短，而第一交联剂与第二交联剂的较低摩尔比将导致较低的水解降解和较长的降解时间。

水凝胶的降解产物应当基本上是生物相容的，即，不会对活体受试者的身体、组织或细胞或其他方面产生显著不利影响，无论是在放置水凝胶的位点还是在活体受试者的任何其他部分。用于评定材料的生物相容性的方法是众所周知的。

在一些实施例中，本文所述的水凝胶可含有能够调节细胞的功能和/或特征的生物活性剂。例如，生物活性剂可以能够调节分散在水凝胶上或水凝胶内的细胞的功能和/或特征。替代性地或另外地，生物活性剂可以能够调节例如植入组织缺损中的水凝胶周围的内源细胞的功能和/或特征，并引导细胞进入缺损中。至少一种生物活性剂可包括编码或包含例如转录因子、分化因子、生长因子或它们的组合的多核苷酸和/或多肽。至少一种生物活性剂还可包括能够促进组织形成、破坏和/或靶向具体疾病状态(例如癌症)的任何药剂。此类生物活性剂的代表性实例包括但不限于趋化剂、各种蛋白质(诸如短期肽、骨形态发生蛋白、胶原、糖蛋白和脂蛋白)、细胞附着介质、生物活性配体、整联蛋白结合序列、各种生长和/或分化剂以及它们的片段(诸如表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(例如bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(例如IGF-1、IGF-II)和转化生长因子(例如TGF-βI-III))、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽、骨形态发生蛋白(例如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-12、BMP-13、BMP-14)、转录因子(诸如音猬因子(sonic hedgehog))、生长分化因子(例如GDF5、GDF6、GDF8)、重组人类生长因子(诸如MP52和MP-52变体rhGDF-5)、软骨衍生的形态发生蛋白(CDMP-1、CDMP-2、CDMP-3)、影响特定生长因子上调的小分子、腱生蛋白-C、透明质酸、硫酸软骨素、纤连蛋白、核心蛋白聚糖、血栓弹性蛋白、凝血酶衍生肽、肝素结合结构域、肝素、硫酸乙酰肝素、多核苷酸、DNA片段、DNA质粒、MMP、TIMP、干扰RNA分子(诸如siRNA)、寡核苷酸、蛋白聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖和编码shRNA的DNA。

在一些实施例中，本文所述的水凝胶可含有可用于治疗需要此类治疗的受试者的病症或疾患的治疗剂。术语“治疗剂”包括任何合成或天然存在的生物活性化合物或物质组合物，当向生物体(人或非人动物)施用时，该生物活性化合物或物质组合物通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学、免疫原性和/或生理效应。该术语因此涵盖传统上被视为包含诸如蛋白质、肽、激素、核酸、基因构建体等分子的药物、疫苗和生物药物的那些化合物或化学品。治疗剂的实例描述于熟知的参考文献中，诸如Merk Index(第14版)、Physician'sDesk Reference(第64版)和The Pharmacological Basis of Therapeutics(第12版)，并且它们包括但不限于药物；维生素类；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或疾患的物质；影响身体结构或功能的物质，或前药，其在被置于生理环境后变得具有生物活性或更具活性。例如，术语“治疗剂”包括用于所有主要治疗领域的化合物或组合物，包括但不限于佐剂；抗感染剂，诸如抗生素和抗病毒剂；镇痛药和镇痛药组合、厌食药、抗炎剂、抗癫痫药、局部和全身麻醉药、安眠药、镇静药、抗精神病药、精神安定药、抗抑郁药、抗焦虑药、拮抗剂、神经元阻断剂、抗胆碱能药和类胆碱药、抗毒蕈碱药和蕈毒碱药，抗肾上腺素能药、抗心律不齐药、抗高血压药、激素和营养素、抗关节炎药、抗哮喘药、抗惊厥药、抗组胺药、止恶心药、抗肿瘤药、止痒药、退热药、止痉挛药、心血管制剂(包括钙通道阻断剂、β-阻断剂和β-激动剂)、抗高血压药、利尿剂、血管扩张剂、中枢神经系统刺激剂、咳嗽和感冒制剂、减充血剂、诊断、骨生长刺激剂和骨吸收抑制剂、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、精神兴奋剂、镇静剂、镇定剂、蛋白质、肽以及它们的片段(无论是天然存在的、化学合成的还是重组产生的)、和核酸分子(两种或更多种核苷酸的聚合形式、核糖核苷酸(RNA)或脱氧核苷酸(DNA)，包括双链和单链分子、基因构建体、表达载体、反义分子等)、小分子和其它生物活性大分子，诸如例如蛋白质和酶。药剂可以是用于医疗(包含兽医)应用和农业(如植物)以及其它领域的生物活性剂。

水凝胶可以是可注射的和/或可植入的，或者可以呈膜、海绵、凝胶、固体支架、纺成纤维、编织或非编织网、纳米颗粒、微粒或任何其他所需构造的形式。

另一方面，水凝胶可包括至少一个分散在水凝胶上或水凝胶内的细胞。例如，细胞可以完全或部分封装在水凝胶内。细胞可包括例如任何祖细胞，诸如全能干细胞、多能干细胞或专能干细胞，以及它们的任何谱系后代细胞，包括更多种分化的细胞。细胞可以是自体的、异种的、同种异体的和/或同基因的。当细胞不是自体的时，可能需要施用免疫抑制剂以最小化免疫排斥。所采用的细胞可以是原代细胞、扩增细胞或细胞系，并且可以是分裂或非分裂细胞。细胞可以在引入水凝胶中或引入水凝胶上之前离体扩增。例如，如果不能从宿主受试者收获足够数量的活细胞，则可以以这种方式扩增自体细胞。替代性地或另外地，细胞可以是组织块，包括具有某种内部结构的组织。细胞可以是原代组织外植体及其制备物、细胞系(包括转化细胞)或宿主细胞。

在一些实施例中，细胞可以指任何祖细胞，诸如全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞，以及它们的任何谱系后代细胞，包括更多种分化的细胞。术语“干细胞”和“祖细胞”在本文中可互换使用。细胞可以衍生自胚胎、胎儿或成人组织。祖细胞的实例可包括全能干细胞、专能干细胞、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、神经元干细胞、胰腺干细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经嵴干细胞、肾干细胞、肝干细胞、肺干细胞、成血管细胞和内皮祖细胞。另外的示例性祖细胞可以包括去分化的软骨形成细胞、软骨形成细胞、脐带血干细胞、专能成体祖细胞、肌原细胞、成骨细胞、肌腱细胞、韧带形成细胞、脂肪形成细胞和皮肤形成细胞。

水凝胶可以由至少一种细胞和/或生物活性剂形成。例如，多个细胞可以以基本均匀的方式分散在水凝胶上或水凝胶内，或者替代性地，分散使得不同或相同细胞的不同密度和/或空间分布分散在水凝胶的不同部分内。可以在聚合物主链交联之前或之后接种细胞。替代性地，在聚合物主链交联后，可以将水凝胶在至少一种生物活性剂的溶液中孵育。

一般地，将细胞在体外或体内引入水凝胶中。细胞可以与水凝胶混合并在足够的生长(或储存)培养基中培养以确保细胞活力。例如，如果在体外接种后将水凝胶植入体内使用，则可以提供足够的生长培养基以确保在体内应用之前的体外培养期间的细胞活力。一旦水凝胶被植入，细胞的营养需求就可以通过宿主受试者的循环液来满足。

可以采用任何可用的方法将细胞引入水凝胶中。例如，可以将细胞注射到水凝胶中(诸如与生长培养基组合)或可以通过其他方式(诸如压力、真空、渗透或手动混合)引入。替代性地或另外地，细胞可以是水凝胶上的层，或者可以将水凝胶浸入细胞悬浮液中并使其在一定条件下并且持续足以使细胞掺入水凝胶内或附着至水凝胶的时间来保持。一般地，希望避免对细胞进行过度的手动操作，以尽量减少浸渍期间的细胞死亡。例如，在一些情况下，可能不需要手动将细胞与水凝胶混合或揉捏；然而，在其中有足够数量的细胞在程序中存活下来的那些情况下，此类方法可能是有用的。还可以简单地通过将水凝胶放置在邻近所需细胞源的受试者中，将细胞引入体内水凝胶中。生物活性剂可以从水凝胶中释放(如果包含在其中)，其也可以募集局部细胞、循环中的细胞或距植入或注射位点一定距离的细胞。

引入水凝胶中的细胞数量将基于水凝胶的预期应用和所使用的细胞类型而变化。例如，当通过注射或混合将分裂的自体细胞引入水凝胶时，可以使用较少数量的细胞。替代性地，当通过注射或混合将非分裂细胞引入水凝胶时，可能需要较多数量的细胞。在添加细胞之前，水凝胶可以处于水合状态或冻干状态。例如，在添加细胞以再水化并用细胞填充水凝胶之前，水凝胶可以处于冻干状态。

本文所述的水凝胶可用于多种生物医学应用，包括组织工程、药物递送应用和再生医学。在一个实例中，本文所述的水凝胶可用于促进受试者的组织生长。该方法的一个步骤可以包括识别靶位点。靶位点可包括期望在其中促进新组织的组织缺损。靶位点还可以包括疾病位置(例如，肿瘤)。用于识别组织缺损和疾病位置的方法是本领域已知的并且可以包括例如各种成像模态，诸如CT、MRI和X射线。识别靶位点后，可以将水凝胶施用到靶位点。接下来，可以将水凝胶装入注射器或其他类似装置中并注射或植入组织缺损中。在注射或植入组织缺损后，可以使用触觉方式将水凝胶形成组织缺损的形状。替代性地，水凝胶可以在植入受试者之前形成特定的形状。植入后，细胞可以开始从水凝胶迁移到组织缺损中，表达生长和/或分化因子，和/或促进细胞扩增和分化。另外，组织缺损中水凝胶的存在可以促进组织缺损周围的内源细胞迁移到水凝胶中。一旦植入，式I部分可被水解。该部分的水解可以以受控的速率发生并导致水凝胶的受控降解。这种降解可以为细胞生长和沉积新的细胞外基质以替换水凝胶创造空间。

如本文所用，术语“组织”可以指在多细胞生物体中具有基本上相同的功能和/或形式的细胞的聚集体。“组织”通常是相同来源的细胞的聚集体，但也可以是不同起源的细胞的聚集体。细胞可以具有基本上相同或基本上不同的功能，并且可以是相同或不同的类型。“组织”可以包括但不限于器官、器官的一部分、骨、软骨、皮肤、神经元、轴突、血管、角膜、肌肉、筋膜、脑、前列腺、乳房、子宫内膜、肺、胰腺、小肠、血液、肝、睾丸、卵巢、子宫颈、结肠、胃、食道、脾、淋巴结、骨髓、肾、外周血、胚胎或腹水组织。

进一步提供了用于实践本文所述的方法的试剂盒。“试剂盒”意指包含至少一种试剂(例如本文所述的任何一种组合物)的任何制品(例如包装或容器)。试剂盒可以作为用于执行本文所述的方法的单元进行推广、分发或销售。另外，试剂盒可包含描述试剂盒及其使用方法的包装说明书。任何或所有的试剂盒试剂可以提供在保护它们免受外部环境影响的容器内，诸如密封容器或袋中。

还公开了在一个或多个容器中包含本文公开的组合物的试剂盒。所公开的试剂盒可以任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施例中，试剂盒包括一种或多种如本文所述的其他组分、辅助剂或佐剂。在一个实施例中，试剂盒包括描述如何施用试剂盒的组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何合适的尺寸、形状或构造。在一个实施例中，本文公开的组合物药剂以固体形式提供在试剂盒中。在另一个实施例中，本文公开的组合物以液体或溶液的形式提供在试剂盒中。在一个实施例中，试剂盒包括含有液体或溶液形式的本文所述的组合物的安瓿或注射器。

本公开还提供了本文提供的本发明的以下实施例：

实施例1.一种水凝胶，其包含与含有至少一个式I部分的第一交联剂交联的聚合物主链：

其中：

m和n独立地为1或2；

A为C₂-C₁₀烷基；并且

为用于第一交联剂内的部分的连接点。

实施例2.根据实施例1所述的水凝胶，其中m为1。

实施例3.根据实施例1所述的水凝胶，其中m为2。

实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的水凝胶，其中n为1。

实施例5.根据实施例1至3中任一项所述的水凝胶，其中n为2。

实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的水凝胶，其中A选自C₂-C₈烷基、C₂-C₆烷基和C₂-C₄烷基。

实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的水凝胶，其中A为C₂烷基。

实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的水凝胶，其中聚合物主链包含聚(乙二醇)或其官能化衍生物。

实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的水凝胶，其中聚合物主链包含选自以下的聚合物：聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙二醇)-二丙烯酸酯(PEG-DA)、多臂聚(乙二醇)-丙烯酸酯(PEG-Ac)、聚(乙二醇)-二硫醇(PEG-diSH)、聚(乙二醇)二乙烯基砜(PEG-diVS)、多臂聚(乙二醇)乙烯基砜(PEG-VS)、聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、多臂聚(乙二醇)-甲基丙烯酸酯(PEG-Mac)、聚(乙二醇)-二烯丙基醚(PEG-diAE)、多臂聚(乙二醇)-烯丙基醚(PE-AD)、聚(乙二醇)-二乙烯基醚(PEG-diVE)、多臂聚(乙二醇)-乙烯基醚(PEG-VE)、聚(乙二醇)-二马来酰亚胺(PEG-diMI)、多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺(PEG-MI)、聚(乙二醇)-二降冰片烯、多臂聚(乙二醇)降冰片烯、聚(乙二醇-碳酸乙烯酯)、多臂聚(乙二醇)-碳酸乙烯酯和聚乙二醇低聚富马酸酯，或它们的组合。

实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的水凝胶，其中聚合物主链包含多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺。

实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的水凝胶，其中第一交联剂包含能够与聚合物主链反应的m+n部分，其中m和n如实施例1中所定义。

实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的水凝胶，其中第一交联剂包含式II化合物：

其中：

X¹和X²在每次出现时独立地选自能够与聚合物主链反应的部分；

L¹和L²在每次出现时独立地选自连接部分；并且

m、n和A如实施例1中所定义。

实施例13.根据实施例12所述的水凝胶，其中X¹和X²各自为-SH。

实施例14.根据实施例12或实施例13所述的水凝胶，其中L¹和L²在每次出现时独立地选自C₁-C₁₀烷基。

实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的水凝胶，其中第一交联剂包括乙二醇双(巯基乙酸酯)。

实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的水凝胶，其中第一交联剂是可水解降解的。

实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的水凝胶，其中聚合物主链进一步与第二交联剂交联。

实施例18.根据实施例17所述的水凝胶，其中第二交联剂是水解稳定的。

实施例19.根据实施例17或实施例18所述的水凝胶，其中第二交联剂包括二硫苏糖醇(DTT)。

实施例20.根据实施例17至19中任一项所述的水凝胶，其中该水凝胶的降解可通过改变第一交联剂与第二交联剂的摩尔比来调节。

实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的水凝胶，其中该水凝胶是可注射的和/或可植入的。

实施例22.根据实施例1至21中任一项所述的水凝胶，其中该水凝胶呈膜、海绵、凝胶、固体支架、纺成纤维、编织或非编织网、纳米颗粒或微粒的形式。

实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的水凝胶，其进一步包含至少一种细胞。

实施例24.一种用于合成根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶的方法，其包括使聚合物与包含至少一个式I部分的第一交联剂反应：

其中所有变量如实施例1中所定义。

实施例25.根据实施例24所述的方法，其中第一交联剂包含式II化合物：

其中：

X¹和X²在每次出现时独立地选自能够与聚合物主链反应的部分；

L¹和L²在每次出现时独立地选自连接部分；并且

m、n和A如实施例1中所定义。

实施例26.根据实施例24或实施例25所述的方法，其中第一交联剂包括乙二醇双(巯基乙酸酯)。

实施例27.根据实施例24至26中任一项所述的方法，其进一步包括使水凝胶与第二交联剂反应，其中第二交联剂是水解稳定的。

实施例28.根据实施例27所述的方法，其中第二交联剂包括二硫苏糖醇(DTT)。

实施例29.一种治疗性递送组合物，其包含根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶以及一种或多种治疗剂。

实施例30.根据实施例29所述的治疗性递送组合物，其中该一种或多种治疗剂可选自细胞、蛋白质、抗体、核酸、生长因子或药物。

实施例31.一种细胞培养基，其包含根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶。

实施例32.一种组织支架，其包含根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶。

实施例33.一种生物反应器，其包含根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶。

实施例34.一种伤口敷料，其包含根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶。

实施例35.一种促进有此需要的受试者的组织生长的方法，其包括：

识别靶位点；以及

向靶位点施用治疗有效量的根据实施例1至23中任一项所述的水凝胶。

实施例36.根据实施例35所述的方法，其中靶位点包括期望在其中促进新组织的组织缺损。

实施例37.根据实施例35或实施例36所述的方法，其中使用成像模态来识别靶位点。实施例38.根据实施例37所述的方法，其中成像模态选自CT、MRI或X射线。

实施例39.根据实施例35至38中任一项所述的方法，其中水凝胶被注射或植入到靶位点中。

实施例40.一种向受试者的靶位点递送治疗剂的方法，该方法包括向该靶位点施用治疗有效量的根据实施例29或实施例30所述的治疗性递送组合物。

实施例41.根据实施例40所述的方法，其中靶位点与疾病状态或病症相关。

实施例42.根据实施例40或实施例41所述的方法，其中靶位点为肿瘤。

实施例43.根据实施例40至42中任一项所述的方法，其中使用成像模态来识别靶位点。

实施例44.根据实施例43所述的方法，其中成像模态选自CT、MRI或X射线。

实施例45.根据实施例40至44中任一项所述的方法，其中水凝胶被注射或植入到靶位点中。

已经描述了本公开的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其它实施例在所附权利要求的范围内。

作为非限制性说明，下面给出本公开的某些实施例的实例。

实例

提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文要求保护的组合物、制品和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹是本发明的实例，而不旨在限制发明人视为其发明的范围。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。除非另做指示，否则份是重量份，温度以摄氏度或者处于环境温度，并且压力是处于大气压或接近大气压。

实例1.具有可调节机械特性的可水解降解的微凝胶调节宿主免疫反应

含酯接头的应用提供了基于酯键的水解裂解的降解机制。降解可以通过酯不稳定接头的聚合物含量、大分子单体分子量、交联密度和疏水性来控制(Jo,Y.S.；Gantz,J.；Hubbell,J.A.；Lutolf,M.P.Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release viaNeighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis.Soft Matter 2009,5(2),440–446以及Zustiak,S.P.；Leach,J.B.Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol)Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and MechanicalProperties.Biomacromolecules 2010,11(5),1348–1357)。与用酶促降解的水凝胶相比，通过这种方法开发的水凝胶是通过水解可降解的，从而允许仅取决于水凝胶的可调节的物理、机械和化学特性的一致的降解谱(Jo,Y.S.；Gantz,J.；Hubbell,J.A.；Lutolf,M.P.Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring AminoAcid Controlled Ester Hydrolysis.Soft Matter 2009,5(2),440–446)。然而散装凝胶以前是用可水解降解的交联剂工程改造的(Jo,Y.S.；Gantz,J.；Hubbell,J.A.；Lutolf,M.P.Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release via Neighboring AminoAcid Controlled Ester Hydrolysis.Soft Matter 2009,5(2),440–446以及Hunckler,M.D.；Medina,J.D.；Coronel,M.M.；Weaver,J.D.；Stabler,C.L.；García,A.J.LinkageGroups within Thiol–Ene Photoclickable PEG Hydrogels Control In VivoStability.Advanced Healthcare Materials 2019,8(14),1900371)，这种模态尚未转化为通过微流控基的聚合制造的微凝胶。

将可降解性掺入水凝胶网络的能力构成了再生医学和免疫工程应用的主要优势，因为材料持久性和机械特性将调节对植入物的组织反应。对生物材料的免疫反应将最终决定植入材料的命运，无论它是整合到局部组织中还是被异物反应(FBR)隔离。最初，生物材料植入后，在促炎介质IFNγ和TNFα的驱动下，材料附近将出现1型炎症损伤反应。然后，促再生生物材料驱动向2型免疫反应的转变，经由IL-4信号传导促进M2(CD206⁺)巨噬细胞极化和T辅助2细胞浸润(Developing a pro-regenerative biomaterial scaffoldmicroenvironment requires T helper 2cells https://www.science.org/doi/10.1126/science.aad9272(2022年2月11日访问))。另一方面，对合成植入物的宿主反应，其特征通常在于主要活化单核吞噬细胞的异物反应(Sussman,E.M.；Halpin,M.C.；Muster,J.；Moon,R.T.；Ratner,B.D.Porous Implants Modulate Healing and Induce Shifts inLocal Macrophage Polarization in the Foreign Body Reaction.Ann Biomed Eng2014,42(7),1508–1516以及Mikos,A.G.,等人Host response to tissue engineereddevices Adv Drug Deliv Rev 1998,33(1-2):111-139)和参与执行3型免疫反应的其他细胞(Chung,L.；Maestas,D.R.；Lebid,A.；Mageau,A.；Rosson,G.D.；Wu,X.；Wolf,M.T.；Tam,A.J.；Vanderzee,I.；Wang,X.；Andorko,J.I.；Zhang,H.；Narain,R.；Sadtler,K.；Fan,H.；D.；Le Saux,C.J.；Housseau,F.；Pardoll,D.M.；Elisseeff,J.H.Interleukin17and Senescent Cells Regulate the Foreign Body Response to SyntheticMaterial Implants in Mice and Humans.Sci Transl Med 2020,12(539),eaax3799)。活化的巨噬细胞和Th17细胞分泌TGFβ和其他因子，该其他因子募集成纤维细胞，促进其分化为肌成纤维细胞，并驱动植入物表面的纤维化。最近，不同表型的不同免疫群体之间更复杂的相互作用与对生物材料的反应有关(Doloff,J.C.；Veiseh,O.；de Mezerville,R.；Sforza,M.；Perry,T.A.；Haupt,J.；Jamiel,M.；Chambers,C.；Nash,A.；Aghlara-Fotovat,S.；Stelzel,J.L.；Bauer,S.J.；Neshat,S.Y.；Hancock,J.；Romero,N.A.；Hidalgo,Y.E.；Leiva,I.M.；Munhoz,A.M.；Bayat,A.；Kinney,B.M.；Hodges,H.C.；Miranda,R.N.；Clemens,M.W.；Langer,R.The Surface Topography of Silicone Breast Implants Mediates theForeign Body Response in Mice,Rabbits and Humans.Nat Biomed Eng 2021,5(10),1115–1130以及Witherel,C.E.；Sao,K.；Brisson,B.K.；Han,B.；Volk,S.W.；Petrie,R.J.；Han,L.；Spiller,K.L.Regulation of Extracellular Matrix Assembly and Structureby Hybrid M1/M2Macrophages.Biomaterials 2021,269,120667)。然而，这种表征主要涉及散装水凝胶植入物，而关于微凝胶植入和降解对局部组织反应的影响的研究相对较少。

本文提出了一种基于流动聚焦液滴生成的制造方法，该方法产生具有模块化机械和降解谱的单分散的可水解降解的微凝胶，该微凝胶取决于不稳定的乙烯接头、乙二醇双(巯基乙酸酯)(EGBMA)的引入。研究证明，通过在连续流动相中经由向不可降解的接头中添加不同摩尔浓度的EGBMA来调节水凝胶微粒中的酯浓度，可以实现受控的水凝胶降解谱。EGBMA的添加不影响体外巨噬细胞极化，但它促进体内降解。另外，可降解性对组织反应的影响被表征为微凝胶悬浮植入物。研究证明，控制微凝胶悬浮液的降解谱可以调节对植入物的1型免疫反应。

添加含酯的二硫醇分子生成可水解降解的微凝胶

可水解降解的微粒(即微凝胶)是通过使用流动聚焦微流控装置进行液滴分段来制造的，如先前报道的(Headen,D.M.；Aubry,G.；Lu,H.；García,A.J.Microfluidic-BasedGeneration of Size-Controlled,Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgelsfor Cell Encapsulation.Advanced Materials 2014,26(19),3003–3008)。在微流控装置中进行分段之前，经由Michael型添加将PEG-4MAL大分子单体用线性PEG-FITC进行功能化，以进行粒子追踪。将水相(含有功能化大分子单体)泵入微流控装置生成的液滴中，随后与含有小二硫醇分子：二硫苏糖醇(DTT)和乙二醇双(巯基乙酸酯)(EGBMA)的油的连续相共价交联。EGBMA的添加允许掺入水解不稳定的酯接头(图1A和表1)。EGBMA的浓度在连续交联相从0.25、0.5到1.0mM变化，并将DTT的浓度保持恒定在15mM。微凝胶的¹H分子扩散核磁共振(NMR)显示交联的PEG-4MAL大分子单体中不存在马来酰亚胺基团，指示微凝胶液滴中的马来酰亚胺基团在芯片上交联后有效地反应(图8)。

表1.合成的微凝胶样品

当仅在交联相中实施DTT时，对于具有200μm喷嘴的装置，在所有条件下保持流速恒定会导致平均直径为208μm(CV 8％)的单分散微凝胶颗粒(图1B)。将EGBMA添加到交联溶液中产生单分散微凝胶群(图1C至1E，所有组的CV<10％)，微凝胶的尺寸范围为直径219至270μm。制造后4小时处，EGBMA交联微凝胶的直径比仅使用DTT的微凝胶大4％、10％和33％，当与DTT对照相比，最高浓度的EGBMA组显著溶胀(图1F和1G，与1.0mM EGBMA相比，p<0.0001DTT)。通过制造后的微凝胶的平均荧光强度测量可以看出，用PEG-FITC进行的大分子单体功能化在各组中是等效的(图1B至1E)，这指示溶胀的差异可归因于EGBMA接头的存在而不是用于交联的马来酰亚胺基团的可用性。到第30天，DTT交联微凝胶已达到平衡尺寸，该平衡尺寸比初始微凝胶尺寸高6％，然而具有中等浓度和最高浓度的不稳定交联剂的EGBMA/DTT微凝胶已溶胀比其初始尺寸分别大26％和46％(图1G，与0.5mM EGBMA相比，p＝0.01DTT，与1.0mM EGBMA相比，p<0.001DTT)。还通过追踪释放到溶液中的PEG-FITC的量来评定微凝胶降解，因为PEG-FITC与PEG-4MAL大分子单体共价连接，并且只能通过EGBMA的水解从水凝胶网络中释放。PEG-FITC释放结果与溶胀实验一致，由此1.0mM EGBMA交联的微凝胶以比较低EGBMA浓度更快的速率释放PEG-FITC，而完全不可降解的对照则伴随着少量释放被捕获的PEG FITC，最后如预期的那样，溶液中不存在PEG-FITC。

最后，EGBMA对所得微凝胶的机械特性的影响经由通过锥形微毛细管的压力诱导变形来确定(Wyss,H.M.；Franke,T.；Mele,E.；Weitz,D.A.Capillary Micromechanics:Measuring the Elasticity of Microscopic Soft Objects.Soft Matter 2010,6(18),4550–4555)(图9A至9C)。微凝胶由于微毛细管末端处的跨微凝胶的压力差而变形。随着压力差增加，微凝胶经历径向压缩应变和轴向伸长(图1I)。当微凝胶处于平衡时，可以使用锥角、边缘接触长度和平均直径来确定剪切应力和应变(图1J)。在此平衡状态下剪切模量G的计算证明制造后4小时后微凝胶的弹性没有差异，所有测试组的值范围为20-22kPa。在溶液中72小时后，剪切模量随着微凝胶中EGBMA浓度的增加而降低，最高可降解接头基团中的模量从20kPa降低至14kPa(降低28％)(图1K，与DTT相比，p<0.0001)；到第7天，最高可降解接头基团中的弹性模量已下降了61％(8kPa)，这一现象可以通过由于酯接头的水解导致交联密度降低来解释。总的来说，这些数据证明，紧接着制造后的有效交联密度没有差异，而微凝胶的弹性特性则表现出基于EGBMA水解和网络交联损失的时间依赖性下降。此外，结果提供了流动聚焦微流控平台在制造物理和机械均质微凝胶方面的一致性的证据。

微凝胶降解和副产物在体外不会诱导单核细胞活化

为了评定EGBMA/DTT交联水凝胶的水解降解产物对细胞活力和活化的影响，RAW264.7小鼠巨噬细胞系在不同微凝胶制剂的存在下生长7天以上。微凝胶和制造副产物(例如任何封装的DTT或水解副产物)的存在对该细胞系没有毒性(图10)。这些结果与先前的研究一致，证明DTT交联对封装细胞或与完全交联的微凝胶共培养的细胞没有相关毒性(Headen,D.M.；Aubry,G.；Lu,H.；García,A.J.Microfluidic-Based Generation of Size-Controlled,Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgels for CellEncapsulation.Advanced Materials 2014,26(19),3003–3008,Coronel,M.M.；Martin,K.E.；Hunckler,M.D.；Barber,G.；O’Neill,E.B.；Medina,J.D.；Opri,E.；McClain,C.A.；Batra,L.；Weaver,J.D.；Lim,H.S.；Qiu,P.；Botchwey,E.A.；Yolcu,E.S.；Shirwan,H.；García,A.J.Immunotherapy via PD-L1–Presenting Biomaterials Leads to Long-TermIslet Graft Survival.Science Advances 2020，以及Headen,D.M.；Woodward,K.B.；Coronel,M.M.；Shrestha,P.；Weaver,J.D.；Zhao,H.；Tan,M.；Hunckler,M.D.；Bowen,W.S.；Johnson,C.T.；Shea,L.；Yolcu,E.S.；García,A.J.；Shirwan,H.Local Immunomodulationwith Fas Ligand-Engineered Biomaterials Achieves Allogeneic Islet GraftAcceptance.Nature Materials 2018,17(8),732–739)。

为了评定微凝胶对体外免疫细胞极化的影响，建立了涉及衍生自具有交联微凝胶的不同制剂的C57BL/6J小鼠骨髓的原代单核细胞的共培养系统。相似尺寸(200μm)且每孔浓度相同的聚苯乙烯珠(PS)被纳入作为阴性对照，因为它们已被证明不会诱导细胞活化(Moore,M.W.；Cruz,A.R.；LaVake,C.J.；Marzo,A.L.；Eggers,C.H.；Salazar,J.C.；Radolf,J.D.Phagocytosis of Borrelia Burgdorferi and Treponema Pallidum PotentiatesInnate Immune Activation and Induces Gamma Interferon Production.Infectionand Immunity2007,75(4),2046–2062)。此外，IL-4极化的M2调节表型被纳入作为阳性对照，因为巨噬细胞暴露于散装PEG水凝胶已被证明可以在不存在粘附线索和炎症信号的情况下将细胞极化转向调节表型(Lynn,A.D.；Bryant,S.J.Phenotypic Changes in BoneMarrow Derived Murine Macrophages Cultured on PEG-Based Hydrogels andActivated by Lipopolysaccharide.Acta Biomater 2011,7(1),123–132)。与所有微凝胶制剂或PS共培养48小时后，含有微粒的组表现出相似的细胞活力(图2A)，而IL-4的添加导致共培养物中细胞数量的增加。在共培养两天后，在PS或PEG基微凝胶的存在下，没有观察到CD45、F4/80和调节标记物CD206的表达的变化(图2B至2D)。此外，这些标记物的总体表达在共培养4天后是等效的(图11A至11D)。这些发现证明，在体外非炎症条件下，微凝胶弹性特性和尺寸或降解产物的变化不会引起巨噬细胞标记物表达的任何表型变化。

皮下微凝胶植入导致体内可控降解

为了测试EGBMA/DTT交联水凝胶在体内降解的能力，如上所述制备微凝胶，但PEG-FITC追踪器被替换为用于体内追踪的含有近红外染料的相同分子量的线性PEG。将微凝胶注射到白化小鼠背部的皮下袋中(以避免黑色素沉着导致信号检测减弱(Curtis,A.；Calabro,K.；Galarneau,J.-R.；Bigio,I.J.；Krucker,T.Temporal Variations of SkinPigmentation in C57Bl/6Mice Affect Optical Bioluminescence Quantitation.MolImaging Biol 2011,13(6),1114–1123))。经由体内荧光成像(IVIS)追踪微凝胶的降解(图3A)。随着时间的推移归一化辐射效率追踪证明荧光信号的减少取决于EGBMA浓度(图3B)。值得注意的是，虽然DTT交联组中的信号强度有所下降，但外植后的强度值与第1天的值相当，证明该组中没有如预期的降解(图3B，虚线后的外植后值，p＝0.44)。在注射后第1天观察到微凝胶制剂当中的荧光信号没有差异(图3C)，然而到第9天，含有中间和最高浓度的EGBMA交联剂的微凝胶制剂中的荧光信号显著较低(图3D，分别与DTT相比，p＝0.008，p＝0.0001)。在第25天，信号强度为原始信号的26％、17％和12％，下降与EGBMA接头浓度成正比(图3E，与DTT相比，p＝0.0004，p<0.0001，p<0.0001)。因此，IVIS成像证实与EGBMA交联的微凝胶在体内降解，并且这种降解发生在几周内。

降解特性调节对体内微凝胶的免疫反应

据推测，由于含酯接头的溶胀和水解而引起的微凝胶机械特性的降解和变化会影响对植入物的免疫反应。将所有四种不同的微凝胶制剂注射到BALB/cJ小鼠的皮下背袋中，并在第7天取出组织进行多参数流分析。选择这个时间点是因为它已经证明了被测试材料当中机械特性和降解谱的差异。此外，为了评定降解性和机械特性的动态变化如何影响细胞环境，分析集中于不可降解(DTT)和三种不同可降解制剂之间的比较。与含有1.0mMEGBMA的可降解微凝胶相比，在与DTT交联的微凝胶中的注射位点处，骨髓细胞群(CD45+CD11b+)占主导地位(图4A至4B，p＝0.018)。骨髓区室内亚群的表型分析揭示了在F4/80+巨噬细胞的存在下的差异作为微凝胶交联剂制剂的函数(图4C至4D，p＝0.008)。基于主要组织相容性复合物II类(MHCII)的细胞表达测量该细胞群的活化显示微凝胶制剂当中没有差异(图4E至4F)，但当与最高可降解微凝胶制剂相比，该标记物的强度表达在DTT交联组中最大(图4F，与1.0mM EGBMA相比，p＝0.03DTT)。使用M1和M2相关标记物CD86和CD206对巨噬细胞极化的进一步分析指示，与所有其他可降解制剂相比，不可降解DTT组中M2极化的表达F4/80巨噬细胞的存在增加(图4G)，这示出对不可降解的不可吞噬微凝胶的组织反应此时由M2样表型主导，并且这种极化可以通过材料降解谱来调节。接下来检查微凝胶制剂对T细胞募集至注射位点的影响。与可降解微凝胶相比，DTT交联的微凝胶将更多数量的CD3+细胞募集至植入物袋(图5A至5B)。这种淋巴细胞反应由CD4辅助细胞主导，该CD4辅助细胞在不可降解微凝胶存在下升高(图5C至5D)。活化标记物CD25和PD-1的表达(图5E至5H)也受到微凝胶制剂的影响，与可降解微凝胶相比，在不可降解组中观察到这些标记物的表面表达上调增加。总体而言，DTT组中CD4细胞的存在增强与M2样细胞表型的增加相结合，证明了这两种细胞群之间在组织对不可降解的PEG基微凝胶的反应中的相互作用。此外，微凝胶降解谱，包括机械特性的变化，可以调节特化细胞亚群的募集和表型，从而改变宿主组织对生物材料植入物的反应。

微凝胶诱导的细胞因子环境是动态的并由IFN-γ表达主导

为了更好地了解免疫环境与微凝胶降解谱的相互作用，实施多重技术来研究微凝胶注射后调节T细胞募集和巨噬细胞极化的细胞因子和趋化因子(此处称为细胞因子)环境。另外，考虑到细胞因子之间的高度相关性以及小鼠年龄对细胞因子释放的潜在混杂因素(分析的第一个时间点与最后一个时间点之间有4周的差异)，实施模块化细胞因子分析方法CytoMod来提供细胞因子聚类和观察到的细胞表型之间的一些背景，而不是在不同时间点评估单个细胞因子(Cohen,L.；Fiore-Gartland,A.；Randolph,A.G.；Panoskaltsis-Mortari,A.；Wong,S.-S.；Ralston,J.；Wood,T.；Seeds,R.；Huang,Q.S.；Webby,R.J.；Thomas,P.G.；Hertz,T.A Modular Cytokine Analysis Method Reveals NovelAssociations With Clinical Phenotypes and Identifies Sets of Co-SignalingCytokines Across Influenza Natural Infection Cohorts and HealthyControls.Frontiers in Immunology 2019,10,1338以及Distinct inflammatoryprofiles distinguish COVID-19frominfluenza with limited contributions fromcytokine storm https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe3024(2021年10月25日访问))。分组细胞因子的主成分分析(PCA)识别了细胞因子谱中的两个方向，其中细胞因子水平的大部分变化由细胞因子IFN-γ和IL-2在一个方向上以及G-CSF在正交方向上决定(图6A，向量方向和颜色表示对PCA的贡献)。所有受试者的细胞因子相似性由其皮尔逊相关系数定义(图6B)，由此使用无监督层次聚类来识别五个细胞因子模块(图6C)。在模块1中观察到统计学上显著的相关性，由参与炎症和Th极化反应的细胞因子和趋化因子组成(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17、IL-10、IL-6、MIG、RANTES、M-CSF、LIX)。在所有受试者的细胞因子水平和平均细胞因子矩阵之间计算细胞因子特异性评分，该评分确定IFN-γ为驱动细胞因子，与之前的PCA分析一致。该模块内的相关图指示大多数细胞因子(IL-2、IL-10、IL-6、LIX、M-CSF)和IFN-γ当中的统计学上显著的正相关性。因此，具有高IFN-γ表达的病症相对可能表现出高浓度的这些其他细胞因子(图6D)。

所评估的所有时间点处的所有条件的原始细胞因子值的直接比较指示了动态概况，其中含有EGBMA的制剂对于所评估的大多数细胞因子呈现较低的平均细胞因子水平(图6E至6F、图12A至12F、图13A至13D)。不可降解微凝胶导致注射后早期GM-CSF和G-CSF的表达增加(图6E、图12A至12F)。到第7天，与不可降解对照相比，在具有最高EGBMA可降解接头的组中，参与免疫细胞募集的其他趋化因子(诸如M-CSF)和由IFN-γ(MIG)诱导的单核因子的表达减少(图12A至12F和图13A至13D)。在暴露于可降解微凝胶的组织中，1型相关细胞因子TNF-α和IFN-γ驱动剂IL-2的表达也减少(图12A至12F和图13A至13D)。值得注意的是，关键的2型细胞因子IL-4的表达取决于微凝胶制剂，与所有可降解制剂相比，不可降解微凝胶在所有时间点处观察到较高水平的IL-4(图6F)。另外，在所研究的时间点处，在制剂当中没有观察到血管生成因子VEGF的表达的差异(图12A至12F)。这些结果与注射位点处细胞表型的多参数流分析相结合，指示对PEG基不可降解微凝胶的反应是由1型免疫驱动的，并受到2型驱动细胞因子IL-4的一定程度的交叉调节。重要的是，这种反应可以通过引入在体内可水解降解的不稳定酯基团来调节。在白化小鼠背部对微凝胶注射的组织反应一般是温和的，在植入物周边周围有细胞浸润(图14)。值得注意的是，植入物均未示出封装或囊肿形成的迹象。在植入后4周在宿主植入物边界处，周围的微凝胶植入物周围的细胞沉积是明显的(图15)。图像的定性评定显示，与可降解微凝胶的所有制剂相比，含有不可降解微凝胶(DTT)的植入物的植入物周边周围的细胞密度更高。与含有最高浓度的EGBMA(1.0mMEGBMA)的条件相比，在DTT以及0.25和0.5mM EGBMA条件下泛巨噬细胞标记物CD68的免疫组织化学证明并增加了CD68表达。这些结果与对骨髓群的流式细胞术评定一致(图4A至4G)。

讨论和结论

赋予微凝胶可降解性的策略利用了聚合物主链中的可降解链或不稳定的交联剂单元，以便能够经由水解、酶促反应或溶解进行裂解。此前，产生了用于递送血管生成因子的蛋白酶可降解微凝胶(Foster,G.A.；Headen,D.M.；González-García,C.；Salmerón-Sánchez,M.；Shirwan,H.；García,A.J.Protease-Degradable Microgels for ProteinDelivery for Vascularization.Biomaterials 2017,113,170–175)。虽然这些微凝胶是实施液滴微流控形成的，但考虑到在连续相中交联肽的溶解度有限，因此需要设计定制的微流控装置。在此，提出了一种利用酯水解来调节交联PEG-4MAL微凝胶的降解的制造策略。与以前的方法相比，这种策略可以在以前设计用于制造不可降解微凝胶的相同微流控装置中实施，因为不稳定的交联剂单元可以添加到油交联相中。因此，这种策略只需通过调节交联进料来调节微凝胶产品的降解特性。

通过评估物理和机械特性的变化来监测水凝胶降解，包括溶胀、PEG-FITC标签的释放和弹性模量。这些参数的变化与EGBMA交联剂含量直接相关，从而与可水解基团的数量相关。制造后立即将用最高浓度的不稳定酯结合成的微凝胶溶胀至不可降解微凝胶对照尺寸的约140％；然而，此时没有观察到弹性模量的明显差异。这可以解释为以下事实：为了完全释放PEG-4MAL大分子单体，必须裂解多个酯键。事实上，在水性缓冲液中72小时后，当足够的交联被裂解并且PEG-4MAL大分子单体溶解到水性介质中时，首先观察到弹性模量的可测量变化。随着时间的推移，差异更加明显，并且与EGBMA含量成正比，证明了该方法的可调节性。虽然本实例中未进行测试，但已知酯和硫醇之间的疏水性和碳单元的存在会影响酯水解速率(Zustiak,S.P.；Leach,J.B.Hydrolytically Degradable Poly(EthyleneGlycol)Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and MechanicalProperties.Biomacromolecules 2010,11(5),1348–1357,Jo,Y.S.；Gantz,J.；Hubbell,J.A.；Lutolf,M.P.Tailoring Hydrogel Degradation and Drug Release viaNeighboring Amino Acid Controlled Ester Hydrolysis.Soft Matter 2009,5(2),440–446，以及Schoenmakers,R.G.；van de Wetering,P.；Elbert,D.L.；Hubbell,J.A.TheEffect of the Linker on the Hydrolysis Rate of Drug-Linked EsterBonds.Journal of Controlled Release2004,95(2),291–300)。因此，在酯和硫醇基团之间实施具有疏水性分子单元的接头或改变聚合物密度可以进一步控制通过这种方法合成的水凝胶的降解，而不会对制造技术产生任何明显的影响。

材料的可降解性虽然对于生物材料平台是非常理想的，但可能导致妨碍其在临床中的适用性的不必要的毒性和免疫活化反应。在本实例中，在任何测试的微凝胶制剂中均未观察到对细胞活力的明显影响，这证明微凝胶或其降解副产物的存在在高达大约3微凝胶/μL的剂量下不会导致毒性诱导的细胞死亡。另外，本实例中实施的微凝胶的尺寸(>200μm)应防止它们被巨噬细胞吞噬(Champion,J.A.；Mitragotri,S.Role of Target Geometryin Phagocytosis.PNAS2006,103(13),4930–4934)；然而，降解副产物和部分内化导致巨噬细胞极化。尽管机械线索的变化已证明对M1样巨噬细胞活化有影响(Patel,N.R.；Bole,M.；Chen,C.；Hardin,C.C.；Kho,A.T.；Mih,J.；Deng,L.；Butler,J.；Tschumperlin,D.；Fredberg,J.J.；Krishnan,R.；Koziel,H.Cell Elasticity Determines MacrophageFunction.PLOS ONE 2012,7(9),e41024以及Féréol,S.；Fodil,R.；Labat,B.；Galiacy,S.；Laurent,V.M.；Louis,B.；Isabey,D.；Planus,E.Sensitivity of Alveolar Macrophagesto Substrate Mechanical and Adhesive Properties.Cell Motility 2006,63(6),321–340)，表面化学的变化已被证明对M2样极化有更大的影响(Thiols Decrease HumanInterleukin(IL)4Production and IL-4-Induced Immunoglobulin Synthesis.J ExpMed 1995,182(6),1785–1792以及Li,Z.；Bratlie,K.M.How Cross-Linking Mechanismsof Methacrylated Gellan Gum Hydrogels Alter Macrophage Phenotype.ACS Appl.BioMater.2019,2(1),217–225)。在本实例中，EGBMA交联单元的存在和机械特性的变化都不对M2相关CD206标记物的体外表达产生影响。通过离心/洗涤步骤从微凝胶悬浮液中去除大部分未反应的交联分子。此外，在所实施的微凝胶与细胞比例下，由于水解，溶液中接头分子的浓度不会影响该标记物表达。

尽管报道了几种可降解的PEG基水凝胶的策略，但很少有研究报道体内降解速率可能与体外降解速率有几个数量级的不同(Hunckler,M.D.；Medina,J.D.；Coronel,M.M.；Weaver,J.D.；Stabler,C.L.；García,A.J.Linkage Groups within Thiol–EnePhotoclickable PEG Hydrogels Control In Vivo Stability.Advanced HealthcareMaterials 2019,8(14),1900371,Amer,L.D.；Bryant,S.J.The in Vitro and in VivoResponse to MMP-Sensitive Poly(Ethylene Glycol)Hydrogels.Ann Biomed Eng 2016,44(6),1959–1969，以及Browning,M.B.；Cereceres,S.N.；Luong,P.T.；Cosgriff-Hernandez,E.M.Determination of the in Vivo Degradation Mechanism of PEGDAHydrogels.J Biomed Mater Res A 2014,102(12),4244–4251)。事实上，已证明在培养中快速降解的蛋白酶可裂解制剂不会在植入后降解(Amer,L.D.,Bryant,S.J.The in Vitroand in Vivo Response to MMP-Sensitive Poly(Ethylene Glycol)Hydrogels.AnnBiomed Eng 2016,44(6),1959–1969)。同样，在水解降解中也观察到降解速率的差异，由此体外逐渐水解降解速率与体内观察到的快速降解不匹配(Hunckler,M.D.；Medina,J.D.；Coronel,M.M.；Weaver,J.D.；Stabler,C.L.；García,A.J.Linkage Groups within Thiol–Ene Photoclickable PEG Hydrogels Control In Vivo Stability.AdvancedHealthcare Materials 2019,8(14),1900371)。在此，使用经近红外染料标记的微凝胶，证明了DTT/EGBMA交联的微凝胶在体内降解，降解时间跨越数周。这与体外研究中以及其他含酯的散装PEG水凝胶中观察到的降解速率一致(Zustiak,S.P.；Leach,J.B.HydrolyticallyDegradable Poly(Ethylene Glycol)Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradationand Mechanical Properties.Biomacromolecules 2010,11(5),1348–1357)。在后续研究中，评估生物因子(例如粘附配体、封装细胞或治疗剂)的添加如何改变这些微凝胶中酯水解的速率非常重要。

最后，在皮下背部模型中评定了作为可降解性功能的组织反应。该位点提供了易于访问的位置，该位置可以容纳大量的微凝胶移植体积。此外，它允许使用同一动物作为其自身的内部阳性对照，因为可以将多个独立的微凝胶悬浮液注射到背部的不同象限中。多参数流分析证明了降解依赖性免疫反应，在不可降解制剂中骨髓细胞和T细胞(特别是CD4+细胞)的存在增强，这与示出T辅助细胞驱动对合成材料植入物的反应的其他研究一致(Chung,L.；Maestas,D.R.；Lebid,A.；Mageau,A.；Rosson,G.D.；Wu,X.；Wolf,M.T.；Tam,A.J.；Vanderzee,I.；Wang,X.；Andorko,J.I.；Zhang,H.；Narain,R.；Sadtler,K.；Fan,H.；D.；Le Saux,C.J.；Housseau,F.；Pardoll,D.M.；Elisseeff,J.H.Interleukin17and Senescent Cells Regulate the Foreign Body Response to SyntheticMaterial Implants in Mice and Humans.Sci Transl Med 2020,12(539),eaax3799以及Chan,T.；Pek,E.A.；Huth,K.；Ashkar,A.A.CD4+T-Cells Are Important in RegulatingMacrophage Polarization in C57BL/6Wild-Type Mice.Cellular Immunology 2011,266(2),180–186)。对细胞因子环境的进一步评估为免疫反应的多样性和复杂性提供了另外的见解。与IL-17驱动的对合成散装植入物的免疫反应的报道相反(Chung,L.；Maestas,D.R.；Lebid,A.；Mageau,A.；Rosson,G.D.；Wu,X.；Wolf,M.T.；Tam,A.J.；Vanderzee,I.；Wang,X.；Andorko,J.I.；Zhang,H.；Narain,R.；Sadtler,K.；Fan,H.；/>D.；Le Saux,C.J.；Housseau,F.；Pardoll,D.M.；Elisseeff,J.H.Interleukin 17and Senescent CellsRegulate the Foreign Body Response to Synthetic Material Implants in Mice andHumans.Sci Transl Med2020,12(539),eaax3799)，发现注射合成微凝胶悬浮液会导致IFN-γ的显著表达，该表达保持升高长达4周。值得注意的是，细胞因子相关性的无监督聚类识别IFN-γ为驱动细胞因子通讯的主要反应。IFN-γ是驱动1型免疫反应的典型细胞因子之一(Tuzlak,S.；Dejean,A.S.；Iannacone,M.；Quintana,F.J.；Waisman,A.；Ginhoux,F.；Korn,T.；Becher,B.Repositioning TH Cell Polarization from Single Cytokinesto Complex Help.Nat Immunol2021,22(10),1210–1217)，并且它主要由活化的T细胞产生，并通过STAT1磷酸化促进M1极化(Kak,G.；Raza,M.；Tiwari,B.K.Interferon-Gamma(IFN-γ):Exploring Its Implications in Infectious Diseases.BiomolecularConcepts 2018,9(1),64–79)。对微凝胶悬浮液植入后巨噬细胞细胞反应的快速评估揭示了更类似于M2样表型(即CD206表达)的表型特征。这种表型可塑性证明微环境的变化导致IFN-γ活化的巨噬细胞复极化。进一步的研究应该调查这种复极化是否确实是由于免疫反应中其他细胞因子的存在(即IL-4的持续存在)，考虑到M1极化可以引发响应IL-4的转化为不同的M2表型(O’Brien,E.M.；Spiller,K.L.Pro-Inflammatory Polarization PrimesMacrophages to Transition into aDistinct M2-like Phenotype in Response to IL-4.Journal of Leukocyte Biology n/a(n/a))。另外，这些研究是在BALB/cJ小鼠中进行的，这些小鼠已示出具有向M2极化的遗传倾向。因此，在其他菌株中进行测试之前，微凝胶诱导的M2表型不能被推广(Chan,T.；Pek,E.A.；Huth,K.；Ashkar,A.A.CD4+T-Cells AreImportant in Regulating Macrophage Polarization in C57BL/6Wild-TypeMice.Cellular Immunology 2011,266(2),180–186)。

尽管1型细胞因子似乎是局部组织反应的主要驱动因素，但本实例示出IL-4驱动的相互反应，应进一步研究。即使在注射后30天后，不可降解植入物中的IL-4分泌也没有明显可观察到的变化。值得注意的是，通过赋予微凝胶平台一定程度的可降解性，可以调节这种免疫反应，因为与不可降解微凝胶相比，可水解降解的微凝胶的IL-4分泌减少，并且CD206+巨噬细胞的存在相应减少。即使最少限度地掺入不稳定酯交联剂，也不会导致在测试的时间窗口(即0.25mM EGBMA)内完全降解，提供细胞和细胞因子谱的差异，表明材料的降解谱极大地影响组织反应。

虽然本实例中没有进行研究，但一系列参数，诸如几何形状、尺寸、表面纹理、材料的刚度和电荷，可以影响宿主-植入物的相互作用以及随后的免疫识别和FBR的发育(Doloff,J.C.；Veiseh,O.；de Mezerville,R.；Sforza,M.；Perry,T.A.；Haupt,J.；Jamiel,M.；Chambers,C.；Nash,A.；Aghlara-Fotovat,S.；Stelzel,J.L.；Bauer,S.J.；Neshat,S.Y.；Hancock,J.；Romero,N.A.；Hidalgo,Y.E.；Leiva,I.M.；Munhoz,A.M.；Bayat,A.；Kinney,B.M.；Hodges,H.C.；Miranda,R.N.；Clemens,M.W.；Langer,R.The SurfaceTopography of Silicone Breast Implants Mediates the Foreign Body Response inMice,Rabbits and Humans.Nat Biomed Eng 2021,5(10),1115–1130,Veiseh,O.；Doloff,J.C.；Ma,M.；Vegas,A.J.；Tam,H.H.；Bader,A.R.；Li,J.；Langan,E.；Wyckoff,J.；Loo,W.S.；Jhunjhunwala,S.；Chiu,A.；Siebert,S.；Tang,K.；Hollister-Lock,J.；Aresta-Dasilva,S.；Bochenek,M.；Mendoza-Elias,J.；Wang,Y.；Qi,M.；Lavin,D.M.；Chen,M.；Dholakia,N.；Thakrar,R.；Lacík,I.；Weir,G.C.；Oberholzer,J.；Greiner,D.L.；Langer,R.；Anderson,D.G.Size-and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response toMaterials Implanted in Rodents and Non-Human Primates.Nature Mater 2015,14(6),643–651,以及Blakney,A.K.；Swartzlander,M.D.；Bryant,S.J.The Effects ofSubstrate Stiffness on the in Vitro Activation of Macrophages and in VivoHost Response to Poly(Ethylene Glycol)-Based Hydrogels.J Biomed Mater Res A2012,100(6),1375–1386)。例如，球形琼脂糖微凝胶的FBR由植入物的几何形状和尺寸调节，与较小的植入物相比，较大的球形植入物活化较低的FBR(Veiseh,O.；Doloff,J.C.；Ma,M.；Vegas,A.J.；Tam,H.H.；Bader,A.R.；Li,J.；Langan,E.；Wyckoff,J.；Loo,W.S.；Jhunjhunwala,S.；Chiu,A.；Siebert,S.；Tang,K.；Hollister-Lock,J.；Aresta-Dasilva,S.；Bochenek,M.；Mendoza-Elias,J.；Wang,Y.；Qi,M.；Lavin,D.M.；Chen,M.；Dholakia,N.；Thakrar,R.；Lacík,I.；Weir,G.C.；Oberholzer,J.；Greiner,D.L.；Langer,R.；Anderson,D.G.Size-and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response to MaterialsImplanted in Rodents and Non-Human Primates.Nature Mater 2015,14(6),643–651)。同样，用亲水材料对PEG水凝胶的化学修饰可以通过减少蛋白质吸收和细胞附着来调节FBR(Jansen,L.E.；Amer,L.D.；Chen,E.Y.-T.；Nguyen,T.V.；Saleh,L.S.；Emrick,T.；Liu,W.F.；Bryant,S.J.；Peyton,S.R.Zwitterionic PEG-PC Hydrogels Modulate theForeign Body Response in a Modulus-Dependent Manner.Biomacromolecules 2018,19(7),2880–2888)。人们越来越认识到重要的材料特性(诸如刚度)对驱动细胞行为具有深远的影响(Blakney,A.K.；Swartzlander,M.D.；Bryant,S.J.The Effects of SubstrateStiffness on the in Vitro Activation of Macrophages and in Vivo Host Responseto Poly(Ethylene Glycol)-Based Hydrogels.J Biomed Mater Res A 2012,100(6),1375–1386以及Irwin,E.F.；Saha,K.；Rosenbluth,M.；Gamble,L.J.；Castner,D.G.；Healy,K.E.Modulus-Dependent Macrophage Adhesion and Behavior.Journal ofBiomaterials Science,Polymer Edition 2008,19(10),1363–1382)。先前已报道过对PEG水凝胶的刚度驱动的炎症反应，并认为与免疫细胞对较硬表面的粘附增加有关(Blakney,A.K.；Swartzlander,M.D.；Bryant,S.J.The Effects of Substrate Stiffness on thein Vitro Activation of Macrophages and in Vivo Host Response to Poly(EthyleneGlycol)-Based Hydrogels.J Biomed Mater Res A 2012,100(6),1375–1386)。这种反应最近被归因于独立于其他生化线索的机械敏感瞬时受体电位香草精4(TRPV4)(Goswami,R.；Arya,R.K.；Sharma,S.；Dutta,B.；Stamov,D.R.；Zhu,X.；Rahaman,S.O.Mechanosensingby TRPV4Mediates Stiffness-Induced Foreign Body Response and Giant CellFormation.Science Signaling 14(707),eabd4077)。本研究中使用的微凝胶植入物在水解介导的降解期间显著溶胀，且因此不能排除植入后尺寸的这种动态变化以及刚度的降低导致本实例中观察到的细胞浸润的调节。将不可降解植入物中的这两个参数解耦以评估DTT交联微凝胶尺寸对FBR的单一影响将是有意义的。

总之，本实例提出了经济高效的方法以从经由液滴微流控分段的PEG-4MAL大分子单体赋予微凝胶可降解的特征。具有酯不稳定交联结的微凝胶在体外和体内都容易降解。此外，降解谱影响对植入物的免疫反应，当可降解微凝胶被递送时，1型相关细胞因子和细胞会减少。该策略的简单性以及所得微凝胶群的水解降解效率使得该方法对于再生医学和药物递送应用具有吸引力。

实验

微流控装置制造：PDMS微流控装置如先前报道进行制备(Headen,D.M.；Aubry,G.；Lu,H.；García,A.J.Microfluidic-Based Generation of Size-Controlled,Biofunctionalized Synthetic Polymer Microgels for Cell Encapsulation.AdvancedMaterials 2014,26(19),3003–3008)。简而言之，PDMS使用软光刻和具有微流控装置图案的SU8母版进行铸造，并加热至110℃持续20分钟。将所得的PDMS微流控装置从晶圆去除并粘合到载玻片上，并加热至70℃过夜。

PEG-4MAL微凝胶制造：使用具有200μm喷嘴的流动聚焦微流控装置形成聚合物液滴。水相由5％w/v PEG-4Mal(20KDa，Laysan Bio)组成，其先前已与硫醇-PEG-FITC(1kDa，Nanocs)反应。共流屏蔽相由矿物油(Sigma)和2％ SPAN80(Sigma)组成。交联剂相含有浓度为15mM的矿物油/SPAN80与DTT(Thermo)的乳液。为了使微凝胶可降解，将不同量的EGBMA(Sigma)以0.25、0.5和1.0mM浓度添加到该交联剂相中。制造后，通过离心从油相中提取微凝胶，并用2％牛血清白蛋白(Sigma)/PBS(corning)溶液洗涤。

微凝胶定型和溶胀：在制造后使用Biotek Cytation分光光度计测量交联相对微凝胶尺寸的表征。将50μL样品一式三份置于玻璃底6孔板中。记录所有样品的每个微凝胶的定量荧光强度。使用Cytation Gen软件中的细胞分析插件测量液滴直径。对于溶胀研究，将1000个微凝胶置于1mL PBS中并置于培养箱中。每天采集50μL样品并如上所述进行测量。对于FITC追踪研究，将1000个微凝胶置于1mL PBS中，并且每天更换溶液。使用Cytation 3读板器测量收集的上清液荧光。

微毛细管机械测试：使用压力驱动的毛细管微观力学测定微凝胶的弹性特性(Wyss,H.M.；Franke,T.；Mele,E.；Weitz,D.A.Capillary Micromechanics:Measuring theElasticity of Microscopic Soft Objects.Soft Matter 2010,6(18),4550–4555)。在不同的时间点(第0、3、7天)，将微凝胶插入预涂有1％(w/v)BSA的PBS溶液的锥形玻璃微量移液器(Fivephoton Biochemicals)的末端。将高精度压力调节器(Elveflow)连接到微量移液器的末端，并以不同的间隔施加压力(0、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、40、50、60kPa)。当微凝胶达到平衡时(当外部施加的压力与内部弹性应力平衡时，不再在微量移液器中移动)，在显微镜(10X；EVOS)上获取图像，并使用ImageJ测量参数。

活力评定：RAW 264.7细胞与10,000个微凝胶共培养7天。经由AlamarBlue(Invitrogen)测量细胞代谢活性。该测定在不同时间点(1、2、4和7天)进行。孵育4小时后，将100μL上清液转移至96孔板的孔中，并使用Cytation 3成像读取器(Biotek)在570nm和600nm波长下测量OD。

骨髓衍生的巨噬细胞共培养物：从6周龄雄性C57BL/6J小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。清除骨头的软组织，切开一侧以暴露骨髓，并且将其倒置在200μL移液管尖端，以适合1.5mL Eppendorf管。然后将骨头以10,000xg离心15秒，以将骨髓沉淀在Eppendorf管底部。丢弃骨头，并且然后将细胞重悬于RBC裂解缓冲液(Biolegend 420302)中以去除红细胞。然后在MACS缓冲液(DPBS pH 7.2、0.5％ BSA、2mM EDTA)中洗涤细胞，并使用单核细胞分离试剂盒(BM)、小鼠(Miltenyi Biotec 130-100-629)和LS柱(Miltenyi Biotec 130-042-401)分离单核细胞。

将单核细胞在补充有10％热灭活胎牛血清、1％pen/strep和20ng/mL鼠M-CSF(Biolegend 574804)的RPMI 1640培养基(Gibco 11875-085)中在低粘附平板中培养6天。收获细胞并以1:10比率接种微粒(每孔10,000个细胞/1000个微凝胶)。M2对照巨噬细胞在补充有20ng/mL鼠M-CSF和20ng/mL鼠IL-4(Biolegend 574304)的培养基中培养。共培养48小时和96小时后，收获细胞并使用以下标记物进行染色：活死细胞(Zombie Violet，BioLegend 423113)、CD45(PE-Texas Red，BioLegend 103146)、CD11b(PercpCy5.5，BioLegend 101228)、F4/80(FITC，BioLegend 123108)和CD206(PECy7，BioLegend141720)。在FACS-AriaIIIu流式细胞仪(BD Biosciences)上分析样品。

将微凝胶移植到小鼠中：所有动物程序均按照佐治亚理工学院(GeorgiaInstitute of Technology)IACUC批准的方案并按照美国国立卫生研究院指南(IACUC批准的方案编号A100326)进行。将微凝胶注射到8-12周龄BALB/cJ小鼠的表皮下。100μL注射液由约3000个不可降解或可降解的水凝胶组成。所有四种条件均在独立位点处注射到同一动物体内，以减少由于动物之间固有的生物学差异而导致的任何变异性。

微凝胶体内追踪：用经AlexaFluor750 NHS酯(Thermo Fisher)标记的1KDa PEG对大分子单体进行功能化。制造后立即将100μL盐水中的3000个微凝胶注射到表皮下。使用IVIS SpectrumCT成像系统(Perkin-Elmer)纵向监测信号强度和分布。使用Living Image软件分析数据。在定义的口袋区域中绘制目标区域(ROI)，并使用辐射效率[p/s/sr]/[μW/cm2]进行定量。每个组袋在所有时间点处的ROI保持相同尺寸，并适当调整尺寸以包含每个区域的荧光信号，以确保可以跨时间比较各个供体之间的成像数据。强度测量值归一化为第0天的值。

组织反应的多参数流分析：通过12mm活检穿孔器获取组织样品，并用Accumax溶液(Sigma)在37℃消化60min。将消化的组织通过40μm过滤器，并且然后用1X PBS洗涤两次。对活细胞/死细胞进行洗涤染色(Zombie violet，BioLegend 423113)，并用骨髓标记物：CD45(PE-Texas Red，BioLegend 103146)、CD11b(PercpCy5.5，BioLegend101228)、F4/80(FITC，BioLegend 123108)、CD11c(BV785，BioLegend 117335)、MHCII(APC-Cy7，BioLegend107652)、CD86(APC，BioLegend 105012)、CD206(PECy7，BioLegend 141720)进行表面染色。以及淋巴标记物：CD45(BV711，BioLegend)、CD3(BV510，BioLegend 100233)、CD4(APC，BioLegend 100412)、CD8(PercpCy5.5，BioLegend 100732)、CD25(PECy7，BioLegend102016)、PD-1(PE Texas Red，BioLegend135227)。用BD Aria进行流式细胞术并在FCS表达中进行分析。

细胞因子分析：如上所述将微凝胶皮下注射到表皮下。在设定的时间点，使用周围注射位点中的12mm活检穿孔器去除组织。随后将样品置于含有蛋白酶抑制剂(Thermo)的RIPA缓冲液中。对样品进行超声处理并在4℃以10,000×g离心10min以去除碎片。将上清液冷冻在液氮中并储存在-80℃直至分析。根据制造商的说明，在Magpix多路复用机(Luminex)上使用Milliplex MAP小鼠细胞因子/趋化因子32重测定(Millipore，MCYTMAG)对样品进行分析。使用R中的“prcomp”函数对所有样品进行PCA，并使用“factoextra”包进行可视化。使用CytoMod研究细胞因子相关性(Cohen,L.；Fiore-Gartland,A.；Randolph,A.G.；Panoskaltsis-Mortari,A.；Wong,S.-S.；Ralston,J.；Wood,T.；Seeds,R.；Huang,Q.S.；Webby,R.J.；Thomas,P.G.；Hertz,T.A Modular Cytokine Analysis MethodReveals Novel Associations With Clinical Phenotypes and Identifies Sets ofCo-Signaling Cytokines Across Influenza Natural Infection Cohorts and HealthyControls.Frontiers in Immunology 2019,10,1338以及Distinct inflammatoryprofiles distinguish COVID-19frominfluenza with limited contributions fromcytokine storm https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abe3024(2021年10月25日访问))。对于相关分析，将低于检测下限的值设置为检测下限。将Log₁₀浓度的多元线性回归建模为时间的函数。R中的“emmeans”包用于评定条件之间估计的边际平均值中的成对差异，并使用Tukey方法来调整多重比较。

免疫组织化学：第30天安乐死后，在周围的注射位点中使用12mm活检穿孔器以去除组织，然后将该组织固定在10％福尔马林溶液中过夜。随后将样品在分级乙醇溶液中脱水处理、在二甲苯和石蜡包埋中澄清。将切片切成10μm，并使用苏木精和伊红(H&E)对载玻片进行染色，并且对巨噬细胞泛标记物CD68(abcam，ab125212)进行IHC，以及核染色(DAPI，Invitrogen D1306)。

统计分析：所有实验均在生物复制品上进行。每个实验组的样品尺寸和使用的统计测试，在适当的情况下进行事后检验，以确定组当中的显著差异，并在适当的图例中报告。图例中呈现了精确的p值或显著性符号的含义。使用Graphpad Prism v9(GraphPadInc.)分析数据。对于细胞因子分析，将浓度数据进行对数转换以进行归一化；使用hclust、glm和lmmeans包在R中进行分析。实验没有采用盲法，也没有使用随机化。

实例2.可降解微凝胶

水凝胶与含酯接头的交联提供了一种集中于酯键水解裂解的降解机制。降解可以通过酯不稳定接头的聚合物含量、分子量和交联密度来控制(Zustiak,S.P.，和Leach,J.B.(2010).Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol)Hydrogel Scaffolds withTunable Degradation and Mechanical Properties.Biomacromolecules,11(5),1348–1357)。与酶依赖性水凝胶相比，通过这种方法开发的水凝胶是通过水解可降解的，从而允许仅取决于水凝胶的可调节物理、机械和化学特性的受控、一致的降解谱((Sung,B.,Kim,C.，和Kim,M.-H.(2015).Biodegradable colloidal microgels with tunablethermosensitive volume phase transitions for controllabledrugdelivery.Journal of Colloid and Interface Science,450,26–33以及Stukel,J.,Thompson,S.,Simon,L.，和Willits,R.(2015).Polyethlyene glycol microgels todeliver bioactive nerve growth factor:Microgels to Deliver BioactiveNGF.Journal of Biomedical Materials Research Part A,103(2),604–613)。重要的是，这种降解方法不会阻碍半胱氨酸封端的粘合剂或肽的实施(Stukel,J.,Thompson,S.,Simon,L.，和Willits,R.(2015).Polyethlyene glycol microgels to deliverbioactive nerve growth factor:Microgels to Deliver Bioactive NGF.Journal ofBiomedical Materials Research Part A,103(2),604–613)。它在药物递送和组织工程中的用途已证明该方法能够有效地提供长期、持续的释放谱(Zustiak,S.P.，和Leach,J.B.(2010).Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol)Hydrogel Scaffolds withTunable Degradation and Mechanical Properties.Biomacromolecules,11(5),1348–1357,Pradal,C.,L.，和Cooper-White,J.J.(2015).HydrolyticallyDegradable Polyrotaxane Hydrogels for Drug and Cell DeliveryApplications.Biomacromolecules,16(1),389–403，以及Davis,K.A.，和Anseth,K.S.(2002).Controlled Release from Crosslinked Degradable Networks；CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,19(4–5),385–424)。在此，我们提出了一种基于流动聚焦液滴生成产生单分散可水解降解的水凝胶的制造机制，其可调节的释放和降解谱取决于不稳定乙烯接头的引入。经由添加不同量的乙烯接头和不可降解的硫醇接头来调节水凝胶结构的不稳定酯化学，可以开发受控的水凝胶降解谱。另外，我们表征了机械特性变化和可降解副产物对体外和体内细胞表型的影响。

方法

微流控装置制造。PDMS微流控装置是通过添加184硅弹性体和184硅弹性体固化剂构建的。然后将有机硅混合物置于由微流控装置图案组成的硅晶圆上，并加热至110℃持续20分钟。将所得的PDMS微流控装置从晶圆去除并粘合到载玻片上，并加热至70℃过夜。

四臂聚(乙二醇)微凝胶构建。将PEG-4Mal(来自Laysan Bio的20KDa四臂聚乙二醇)、PEG生物素和DTT(二硫苏糖醇)称重至适当的量。制备A10 mM DPBS/HEPES(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水/4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)溶液，该溶液用于悬浮PEG生物素。这种新溶液由DPBS/HEPES溶液组成并且然后使用Peg生物素重悬PEG-4Mal，其通过管线流至微流控装置。另外，还制备了DTT和DPBS/HEPES溶液。还制备了2％SPAN 80/矿物油溶液，并将395ul的DTT的DPBS/HEPES溶液添加到5mL的2％ SPAN 80/矿物油溶液中。对于可降解微凝胶，将计算浓度的可降解硫醇接头添加到DTT和2％SPAN 80/矿物油的溶液中。创建解决方案后，设置了三个注射器，并准备好微流控装置的制造。设置一个泵将油推过装置(1ul/min)，设置另一个泵将PEG推过装置(5ul/min)，并且最后一个泵用于将DTT溶液推过装置(35ul/min)。从装置中的收集槽到填充有dPBS和1％ BSA(牛血清白蛋白)的收集管设置收集线。启动装置后，设置管线并使三种溶液流过微流控装置。通过装置运行泵和管线大约45分钟后，将收集管置于离心机中五分钟，并进行一系列洗涤以从收集物中去除DTT和油，导致在管底部收集微凝胶。

微凝胶降解。将大约200个微凝胶置于48孔板的每个孔中并历经多天的历程孵育。每天，使用LED显微镜对每个孔中的微凝胶数量进行计数并分析溶胀情况。分析微凝胶后，将DPBS添加到每个孔中并放回培养箱中。

蛋白质封装的半定量分析。进行蛋白质印迹转移以分析水凝胶捕获蛋白质的能力。通过凝胶电泳和化学发光成像技术，对微凝胶进行半定量分析，以确定微凝胶是否适合移植。

将微凝胶移植到小鼠体内。将微凝胶注射到8-12周龄Balb/C小鼠的表皮下。100uL注射液由约3000个不可降解或可降解的水凝胶组成。不可降解微凝胶由DTT交联剂和无可降解硫醇连接剂组成，而可降解微凝胶由DTT交联剂和0.25mM、0.5mM或1mM硫醇连接剂的混合物组成。

微凝胶追踪。使用IVIS成像系统，可以看到微凝胶成像及其荧光。历经多天的历程，追踪并记录了微凝胶信号传导的降解速率。

实例3.用于治疗性递送的可水解降解的水凝胶

水凝胶越来越多地在用于递送药物或生物治疗剂的再生医学中使用，因为它们具有模块化、生物相容性，并且可以经工程改造为具有可控的机械特性。越来越多地，使用序列特异性酶促降解掺入水凝胶中的肽来制造可降解水凝胶。然而这种降解方法具有细胞相容性，但肽在油中的溶解度差以及对大体积肽溶液的要求限制了用微流控装置合成单分散可降解水凝胶。在此，基于对内源刺激(即水解)反应的不稳定化学，报道了具有可调节降解的可水解降解的水凝胶。

方法

水凝胶颗粒(微凝胶)是在微流控油包水液滴发生器中制造的，如前所述(Headen等人Microsystems&Nanoengineering 4.1(2018):1-9)。聚合物用1kDa SH-PEG-FITC(用于体外追踪)或SH-PEG-AF750(用于体内成像)进行预功能化。微凝胶与含有以下物质的溶液交联：二硫苏糖醇(DTT)，或以不同摩尔比的DTT与可降解接头乙二醇双-巯基乙酸酯的混合物。将微凝胶注射到小鼠的皮下进行体内追踪。简而言之，向8-12周龄的Balb/C小鼠注射100uL约3000个不可降解水凝胶(DTT交联)或可降解水凝胶(DTT和0.25mM、0.5mM或1mM可降解接头的混合物)。

结果

通过测量37℃dPBS中微凝胶培养物溶液中的溶胀百分比和PEG-FITC接头的存在情况来追踪微凝胶的降解。发现溶胀百分比与制造时可降解接头的摩尔浓度相关(图1F)。当与不可降解水凝胶相比，高度可降解水凝胶在制造后4小时内溶胀约40％(p<0.0001)。到培养后一个月，1mM可降解水凝胶已溶胀至DTT不可降解水凝胶尺寸的60％(P<0.0039)。最初，DTT、0.25mM和0.5mM组之间没有观察到尺寸差异，但到第30天，当与不可降解凝胶相比，它们的尺寸增加了30％(分别为p<0.0001、p<0.019)。水凝胶的降解将导致PEG-FITC接头从PEG-4MAL主链上裂解(图1B)。因此，随着时间的推移追踪培养物的荧光强度以确定溶液中PEG-FITC的存在。正如在溶胀研究中观察到的，1mM可降解水凝胶组中的荧光强度较高(与DTT相比，p<0.001)。然而当将可降解性最低的凝胶与DTT交联水凝胶比较时，没有观察到显著差异。为了评估体内降解，使用IVIS成像系统监测微凝胶(图16A至16B)。注射后立即在所有组中检测到强信号。到第1天，所有组中的信号均衰减了约38％，这可归因于制造期间游离染料的存在，而不是归因于降解。到第3天，1mM水凝胶组中的信号已下降至33％，而DTT注射位点处的信号保持恒定。到第10天，在高度可降解组中没有观察到可检测到的信号，然而在DTT微凝胶组中没有观察到任何变化。

结论

采用微流控油包水液滴发生器可以制备单分散可水解降解的水凝胶。乙烯接头与不可降解的硫醇接头的采用允许体外和体内可控的持续材料降解。

所附权利要求的组合物和方法在范围上不受本文描述的具体组合物和方法的限制，所述具体组合物和方法旨在作为权利要求的几个方面的说明，并且功能上等效的任何组合物和方法旨在落入权利要求的范围内。除了本文所示出和描述的组合物和方法之外，对方法的各种修改旨在落入所附权利要求书的范围内。进一步地，尽管仅具体描述本文公开的某些代表性组合物和方法步骤，但是这些组合物和方法步骤的其它组合也旨在落入所附权利要求书的范围内，即使没有具体叙述。因此，本文中可以明确提及步骤、要素、组分或成分的组合，然而，包含步骤、要素、组分和成分的其它组合，即使未明确陈述。

如本文中所使用的术语“包含(comprising)”及其变体与术语“包括(including)”及其变体同义地使用并且是开放性的非限制性术语。尽管术语“包含”和“包括”已经在本文中用于描述各个实施例，但是术语“基本上由…组成”和“由…组成”可以用于代替“包括”和“包含”以提供更具体的实施例，并且还被公开。除了在示例中或另外注明的情况下，说明书和权利要求中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字至少应被理解，并且不是试图将等价物原理的应用限制在权利要求的范围内，根据有效数字的数量和普通舍入方法来解释。

Claims (45)

1.一种水凝胶，其包含与含有至少一个式I部分的第一交联剂交联的聚合物主链：

其中：

m和n独立地为1或2；

A为C₂-C₁₀烷基；并且

为用于所述第一交联剂内的所述部分的连接点。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中m为1。

3.根据权利要求1所述的水凝胶，其中m为2。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶，其中n为1。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶，其中n为2。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的水凝胶，其中A选自C₂-C₈烷基、C₂-C₆烷基和C₂-C₄烷基。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的水凝胶，其中A为C₂烷基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶，其中所述聚合物主链包含聚(乙二醇)或其官能化衍生物。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的水凝胶，其中所述聚合物主链包含选自以下的聚合物：聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙二醇)-二丙烯酸酯(PEG-DA)、多臂聚(乙二醇)-丙烯酸酯(PEG-Ac)、聚(乙二醇)-二硫醇(PEG-diSH)、聚(乙二醇)二乙烯基砜(PEG-diVS)、多臂聚(乙二醇)乙烯基砜(PEG-VS)、聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、多臂聚(乙二醇)-甲基丙烯酸酯(PEG-Mac)、聚(乙二醇)-二烯丙基醚(PEG-diAE)、多臂聚(乙二醇)-烯丙基醚(PE-AD)、聚(乙二醇)-二乙烯基醚(PEG-diVE)、多臂聚(乙二醇)-乙烯基醚(PEG-VE)、聚(乙二醇)-二马来酰亚胺(PEG-diMI)、多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺(PEG-MI)、聚(乙二醇)-二降冰片烯、多臂聚(乙二醇)降冰片烯、聚(乙二醇-碳酸乙烯酯)、多臂聚(乙二醇)-碳酸乙烯酯和聚乙二醇低聚富马酸酯，或它们的组合。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的水凝胶，其中所述聚合物主链包含多臂聚(乙二醇)-马来酰亚胺。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的水凝胶，其中所述第一交联剂包含能够与所述聚合物主链反应的m+n部分，其中m和n如权利要求1中所定义。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的水凝胶，其中所述第一交联剂包含式II化合物：

其中：

X¹和X²在每次出现时独立地选自能够与所述聚合物主链反应的部分；

L¹和L²在每次出现时独立地选自连接部分；并且

m、n和A如权利要求1中所定义。

13.根据权利要求12所述的水凝胶，其中X¹和X²各自为-SH。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的水凝胶，其中L¹和L²在每次出现时独立地选自C₁-C₁₀烷基。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的水凝胶，其中所述第一交联剂包括乙二醇双(巯基乙酸酯)。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的水凝胶，其中所述第一交联剂是可水解降解的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的水凝胶，其中所述聚合物主链进一步与第二交联剂交联。

18.根据权利要求17所述的水凝胶，其中所述第二交联剂是水解稳定的。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的水凝胶，其中所述第二交联剂包括二硫苏糖醇(DTT)。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶的降解是通过改变所述第一交联剂与所述第二交联剂的摩尔比可调节的。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶是可注射的和/或可植入的。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶呈膜、海绵、凝胶、固体支架、纺成纤维、编织或非编织网、纳米颗粒或微粒的形式。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的水凝胶，其进一步包含至少一种细胞。

24.一种用于合成根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶的方法，其包括使聚合物与包含至少一个式I部分的第一交联剂反应：

其中所有变量如权利要求1中所定义。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一交联剂包含式II化合物：

其中：

X¹和X²在每次出现时独立地选自能够与所述聚合物主链反应的部分；

L¹和L²在每次出现时独立地选自连接部分；并且

m、n和A如权利要求1中所定义。

26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述第一交联剂包括乙二醇双(巯基乙酸酯)。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其进一步包括使所述水凝胶与第二交联剂反应，其中所述第二交联剂是水解稳定的。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第二交联剂包括二硫苏糖醇(DTT)。

29.一种治疗性递送组合物，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶以及一种或多种治疗剂。

30.根据权利要求29所述的治疗性递送组合物，其中所述一种或多种治疗剂可选自细胞、蛋白质、抗体、核酸、生长因子或药物。

31.一种细胞培养基，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶。

32.一种组织支架，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶。

33.一种生物反应器，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶。

34.一种伤口敷料，其包含根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶。

35.一种促进有此需要的受试者的组织生长的方法，其包括：

识别靶位点；以及

向所述靶位点施用治疗有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的水凝胶。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶位点包括期望在其中促进新组织的组织缺损。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中使用成像模态来识别所述靶位点。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述成像模态选自CT、MRI或X射线。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述水凝胶被注射或植入到所述靶位点中。

40.一种向受试者的靶位点递送治疗剂的方法，所述方法包括向所述靶位点施用治疗有效量的根据权利要求29或权利要求30所述的治疗性递送组合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶位点与疾病状态或病症相关。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述靶位点为肿瘤。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中使用成像模态来识别所述靶位点。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述成像模态选自CT、MRI或X射线。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述水凝胶被注射或植入到所述靶位点中。