KR101994177B1

KR101994177B1 - Il-8 및 골수농축액의 조합을 이용한 연골 재생

Info

Publication number: KR101994177B1
Application number: KR1020160090032A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 윤동석; 김성환
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2019-06-28
Also published as: WO2018012736A1; KR20180008137A

Abstract

본 발명은 IL-8 및 골수농축액의 조합을 이용한 연골 재생에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 IL-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물, 연골 재생용 충전재, 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약학 조성물을 제공하며, 또한, 생분해성 지지체에 IL-8 및 골수농축액을 포함한 연골 재생용 지지체를 제공한다. 상기 조성물 및 지지체를 이용하여 연골 재생과 골 질환 또는 연골 질환 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

IL-8 및 골수농축액의 조합을 이용한 연골 재생{CARTILAGE REGENERATION USING COMBINATION OF IL-8 AND BONE MARROW CONCENTRATE}

본 발명은 IL-8 및 골수농축액의 조합을 이용한 연골 재생에 관한 것이다.

줄기세포를 이용한 조직 및 장기의 재생을 통하여 그 기능을 복원하기 위한 방법들이 많이 시도되고 있다. 줄기세포 중에서, 특히 골수조직에서 발견되는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 골세포, 연골세포, 반월판세포, 심장근육세포, 신경세포 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 다능 줄기세포이다. 또한, 상기 분화 능력과 더불어 해당 결손 조직을 재건할 수 있는 능력이 실험적으로 밝혀져 조직과 장기의 기능을 재건하기 위한 세포 치료제로서의 가능성이 대두되고 있다. 또한, 중간엽줄기세포는 연골세포에 비해 빠르게 증식하기 때문에 관절연골 재생을 위한 중요한 세포원이며, 기존 관절연골 치료법의 단점을 극복하기 위한 대체 치료법으로써 중간엽줄기세포가 주목되고 있다.

연골(cartilage)이란, 연골세포와 연골기질로 구성된 조직으로서, 움직임이 적은 부위에는 뼈와 뼈 사이에 관절연골의 형태를 띠고, 움직임이 많은 부위에는 윤활관절의 형태를 띠고 있다. 이 중 관절연골은 단백다당과 제2형 교원질로 주로 구성된 무혈성 조직이며, 조직부피의 약 5%의 연골세포를 포함하고 있다. 이러한 관절연골은 손상이 발생하면 결손 부위로 연골세포의 이동이 거의 일어나지 않으며 손상된 관절연골은 자발적인 치유가 일어나지 않는 문제점이 있다. 따라서 관절연골이 손상되게 되면, 인위적인 방법으로 치료를 진행해야 하며 대표적인 생물학적 치료방법으로는 자가연골세포이식법과 골수천공술 등이 있다. 자가연골세포이식법은 자가연골세포를 체외에서 배양하여 결손부위로 이식하는 방법으로써 비교적 좋은 치료 결과를 보이나, 반복된 수술과 공여부의 제한성이 단점이다. 골수천공술은 연골결손부의 연골하골을 천공하여 골수와 함께 결손부위로 유입된 중간엽줄기세포를 이용하여 손상된 연골을 치료하는 방법이다. 이 방법은 비교적 간단하고 경제적이나 결과가 일정하지 못하며 유입되는 중간엽줄기세포의 수가 충분치 못할 경우 조직재생이 원활하지 못하다는 단점이 있다.

이와 같은 기존 관절연골 치료법의 단점을 극복하기 위하여, 한국등록특허 제 1493252호에는 인터루킨-8(IL-8)을 이용하여, 손상된 관절연골 부위로 중간엽줄기세포의 유입을 촉진시키고, 상기 케모카인을 포함하는 생분해성 지지체를 손상 부위에 이식시켜 치료에 이용하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, IL-8은 손상부위로 중간엽줄기세포의 유입을 촉진시킬 수는 있으나, 중간엽줄기세포의 연골원(chondrogenic) 분화에는 어떠한 효과를 가지지 않는다는 것을 본 발명에서 확인하였다. 이에 따라, 연골 재생 및 치료에 있어서, 기존의 단점을 극복할 수 있는 보다 효과적인 치료방법의 개발이 절실한 상황이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, IL-8 및 골수농축액(bone marrow concentrate, BMC)을 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 연골 재생용 조성물을 포함하는 연골 재생용 충전재를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 연골 재생을 위한 지지체를 제공하는 것이며, 보다 구체적으로는 생분해성 지지체에 IL-8 및 골수농축액을 포함한 연골 재생용 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IL-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는 골 질환 및 연골 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명은 인터루킨-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는, 연골(cartilage) 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 연골은 유리질연골(hyaline cartilage), 탄성연골(elastic cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 손상된 연골 부위로 줄기세포의 유입을 증대시키고, 유입된 줄기세포의 분화를 촉진시킨다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 줄기세포는 자가(autologous) 유래 줄기세포이며, 보다 구체적으로는 중간엽줄기세포이다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 골수(bone marrow)-, 지방 조직(adipose tissue)- 및 제대혈(cord blood)-유래 중간엽줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

본 발명에 있어서, 중간엽줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화된 성체줄기세포로서 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등으로 분화될 수 있는 미분화된 줄기세포를 의미한다. 중간엽줄기세포의 종류는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있으며, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 골수, 지방조직 또는 제대혈로부터 수득하는 것이 바람직하며, 골수 유래 중간엽줄기세포가 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서, 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8)은 세 가닥의 β판상구조와 α나선구조로 구성된 분자량 약 8,000인 헤파린친화성 염기성 단백질로써, 케모카인아족에 속하는 물질을 의미한다. 이는 염증 시 대식세포를 비롯한 여러 세포에서 생성된다. IL-8 염색체 유전자는 4개의 활성부위와 3개의 비활성부위로 구성되며 상류역에 있는 NF-kB, C/EBP, AP-1결합요소의 상승작용으로 유전자가 활성화된다. 본 발명에 있어서 IL-8은 손상된 조직 부위로 중간엽줄기세포를 유입시키는 역할을 할 수 있다면 제한이 없다.

본 발명의 일 구체예에서, 골수농축액은 자가 유래 골수농축액인, 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 골수농축액(bone marrow concentrate; BMC)은 중간엽줄기세포가 연골원 계통으로 분화되는데 도움을 준다. 보다 자세하게는, 연골원 분화의 미세환경 하에서 연골분화 전사인자 및/또는 마커의 mRNA 발현의 강화를 통하여 중간엽줄기세포가 연골원 계통으로 분화되는데 도움을 준다. 연골 재생에 있어서, 상기 IL-8 또는 골수농축액을 단독으로 사용하였을 때보다 IL-8 및 골수농축액의 조합으로 사용할 경우, 결함 부위에서 더욱 효과적으로 기능적인 연골 재생을 강화시킨다는 것을 확인하였다. 중간엽줄기세포의 분화를 돕는 상기 골수농축액은 바람직하게는 추출된 골수를 원심분리하여 혈장 및 적혈구를 제거하여 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈장 및 적혈구가 제거된 골수농축액을 추가로 0.45㎛ 필터로 필터링하여 제조할 수 있으나, 중간엽줄기세포의 분화를 촉진시키는 골수액이라면 제한이 없다.

본 발명에서 이용되는 IL-8 및 골수농축액의 농도는 생분해성 지지체에 대하여, IL-8 1-10㎍ 및 BMC 50-150㎕인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 IL-8 5㎍ 및 BMC 100㎕인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물에 의해 재생된 연골은 연골분화마커의 발현이 촉진되고, 글리코사미노글리칸의 합성이 증가되며, 상기 연골분화마커는 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸이다.

본 발명에 있어서, 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸 등과 같은 연골분화마커의 발현 수준은 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 코딩(coding)된 mRNA 또는 단백질의 존재 여부 및/또는 발현량을 확인하는 과정으로 마커 유전자의 mRNA에 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브 세트를 이용하여 mRNA의 양을 측정하거나, 마커 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 이용하여 단백질의 양을 확인함으로써 측정할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블롯팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 마커 유전자의 mRNA 또는 마커 유전자의 단백질을 확인할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 발명에 있어서, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan; GAG)은 동물기원의 헥소사민을 포함한 2당의 반복구조를 하는 다당의 1군으로 산성뮤코다당이라고도 한다. 글리코사미노글리칸을 구성하는 단당의 종류는 글루코스, 갈락토스, 만노오스, 키시로스, 아코스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸노이라민산으로, 상기 8종류의 단당 중 특정 2당이 반복함에 의하여 글리코사미노글리칸의 종류가 결정된다. 그 종류로는 히알루론산, 콘드로이친, 콘드로이친 황산, 델마탄 황산, 케라탄 황산, 헤파린, 헤파린 황산으로, 이들의 주요 존재 부위로 연골, 뼈, 추간판, 세포표면, 관절액, 인대 등이 있다. 글리코사미노글리칸의 이당류 유닛의 기본 구성분의 하나인 글루코사민 설페이트(glucosamine sulfate)는 연골세포에서 프로티오글리칸 생성을 통계적으로 유의하게 촉진시키는 것으로 나타났다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 연골 재생용 충전재를 제공한다.

본 발명에 있어서, 충전재는 연골 재생을 일어나게 하기 위해서, 연골 재생에 효과적인 물질을 채워 넣어 연골 재생을 보다 효과적으로 유도될 수 있도록 하기 위한 것으로, 보다 구체적으로 손상 부위에 IL-8 및 골수농축액을 포함하는 연골 재생용 충전재를 사용하여, 연골의 재생을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 생분해성 지지체에 IL-8 및 골수농축액을 포함하는 연골 재생용 지지체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 지지체는 골연골 결함 치료를 위한 지지체로써, IL-8 및 골수농축액을 함유한 고분자로 이루어진 3차원 구조체를 의미하고, 이식을 통해 손상된 연골과 같은 손상 부위로 손상 조직의 재생에 필요한 세포의 이동을 유도하는 기능을 한다. 바람직하게는, 본 발명의 지지체는 생체적합성 물질로, 일반적으로 다공성 미세 지지체를 형성하여 이동하는 세포를 위한 물리적 지지체를 제공하며, 이식된 위치로 치료 또는 재생용 세포의 유입을 위해 제공된다.

본 발명의 생분해성 지지체(biodegrable scaffolds)는 IL-8 및 골수농축액을 함유하며, 이로 인해 손상된 조직에 필요한 세포, 즉 중간엽줄기세포의 유입 및 분화를 촉진시킨다. 이에 따라, 유입된 세포는 손상 부위에서 재생 효능을 발휘한다.

본 발명에서 이용될 수 있는 지지체는 어떠한 크기, 형태 또는 조성물로도 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 지지체는 바람직하게 폴리(락트산)(PLA; polylactic acid), 베타-트리칼슘 포스페이트(β-TCP), 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤)(PLCL; poly(l-lactide-co-ε-caprolactone)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PCL(poly-ε-caprolactone), PAA(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드, 폴리오소에스테르, 콜라겐 젤, 하이드로 젤, 폴리비닐 알코올 스폰지, 젤라틴, 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글라콜 블랏 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 사용할 수 있으며 가장 바람직하게는 폴리락트산, 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤)을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 이용될 수 있는 지지체는 뼈와 연골 부분으로 나누어지며, 뼈 부분은 PLA(폴리락트산), 베타-트리칼슘 포스페이트 및 NaCl의 혼합물로 구성되며, 연골 부분은 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤)으로 합성하여 두 개의 층을 이루도록 제조되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서 재생 또는 치료란, 상기 조성물의 투여에 의해 골 질환 또는 연골 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 골 질환 또는 연골 질환은 골 또는 연골의 손상 또는 소실에 의한 질환을 의미한다. 상기 연골 질환은 구체적으로는 골연골변성증, 골연골 이영양증, 모르키오병, 골관절염, 박리성 골연골염, 골연골증, 연골염, 연골종, 연골육종, 추간판 탈출증, 클리펠-파일 증후군, 변형성 골염, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 골 질환은 늑골, 두개골, 장골, 상완골, 척추뼈, 골반뼈 및 어깨뼈로 구성된 군으로부터 선택되는 골 조직의 손상에 의한 질환으로, 구체적으로는, 골절, 골손상，골손실, 염증-유도 골 질환, 골수염, 염증성 골다공증, 골연화증， 구루병， 섬유성 골염， 무형성 골 질환, 대사성골 질환, 치주골 질환 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 IL-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는, 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 IL-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물 또는 골 질환 및 연골 질환 치료용 약학 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 충전재 및 지지체를 사용할 경우, 연골 재생을 위한 중간엽줄기세포의 유입을 유도 및 촉진하고, 상기 세포가 연골원 계통으로 분화되는데 도움을 줌으로써 효과적으로 연골을 재생하고 손상된 골 또는 연골을 치료할 수 있다. 이는 IL-8 단독 또는 BMC 단독으로 사용하였을 때보다 조합하여 사용할 때에 시너지 효과를 나타내어 기존에 비해 더욱 추가적인 효과를 가짐으로써, 골 또는 연골의 재생 및 치료에 보다 강화된 효과를 가진다.

이에 따라, 본 발명에 따른 조성물 및 지지체를 사용할 경우, 보다 효과적으로 골 질환 또는 연골 질환에 대한 치료제로써 이용될 수 있다.

도 1은 비글 무릎의 골연골 결함에 대한 지지체, 상기 지지체에 대한 SEM 이미지 및 생체 외 IL-8 방출 시험을 나타낸 것이다.
도 2는 비글 모델에서 지지체 이식 후 및 이식 후 12주에서의 골연골 결함 및 전체적 형태를 나타낸 것이다.
도 3은 골 재생의 μCT 이미지 및 정량적 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 수술 후 12주에 조직학적 분석 및 글리코사미노글리칸 합성 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 재생된 연골 조직의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 재생된 연골 조직으로 유입된 MSC의 존재 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 개 BMSC에서 연골분화 전사인자 및 마커의 mRNA 발현에서의 IL-8과 BMC 처리효과를 나타낸 것이다.
도 8은 배양된 개 BMSC의 골원성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골원(chondrogenic) 계통으로 분화하는 능력에 대하여 특징화한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 재생된 섬유 연골 조직의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 미분화 조건하에서 개 BMSC에서 연골분화 전사인자 및 마커의 mRNA 발현에서의 BMC 처리효과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

비글모델에서의 골연골 결함 치료를 위한 이상( biphasic ) 지지체의 제조

지지체의 뼈 부분을 폴리(락트산)(PLA; polylactic acid) 가루(CM 리서치, 서울, 한국), 베타-트리칼슘 포스페이트(β-TCP; 버클리 어드밴스드 바이오메터리얼즈, 버클리, 캘리포니아) 및 NaCl(sodium chloride; 시그마, 세인트루이스, 미주리)의 혼합물을 소결(sintering)하여 제조하였다. 연골 부분을 제조하기 위하여, 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤)(PLCL; poly(l-lactide-co-ε-caprolactone))을 합성하여 겔-압착법(gel-pressing method)에 사용하였다. PLA에 β-TCP를 혼합한 것을 PLLA/β-TCP라고 명명하였고, PLLA/β-TCP 및 NaCl 입자(70% w/w)를 균일하게 혼합하고 원통형 몰드(cylindrical mold, 직경=5.85mm)에 두었다. 상기 혼합물을 150MPa에서 2분 동안 실온에서 유압프레스(hydraulic press)를 사용하여 압력을 가하여 고체 블록을 수득하였고, 이후에 210℃에서 30분 동안 추가적으로 처리하였다. PLCL를 테트라하이드로퓨란(THF; tetrahydrofuran; 5% w/v)에 용해시킨 후, NaCl 입자(85% w/w)와 혼합하였다. 상기 THF을 공기 중에 증발시켜 PLCL 겔을 형성하고, 이어서 이를 원통형 몰드(직경=6mm)내에서 앞서 제조된 PLLA/β-TCP 블록에 압착시켰다. 다음에, 잔여의 THF를 24시간 동안 실온에서 증발시키고, 진공하에서 72시간 동안 완전히 제거하였다. 그 후, 상기 겔을 탈이온증류수에서 7일 동안 지속적으로 쉐이킹하여 염을 걸러내었다. 이어서, 완성된 지지대를 48시간 동안 동결건조시키고, 에틸렌 옥사이드 가스로 살균하였다. 길이 8mm(PLLA/β-TCP=7mm, PLCL=1mm) 및 직경 6mm의 최종 생성물을 얻었다(도 1A).

자가유래 골수유래 중간엽줄기세포(autologous BMSC) 의 제조 및 배양

전신마취하에서 2% 이소플루란(시그마)을 사용하여 14-15kg의 수컷 비글의 뒤쪽 장골릉(posterior iliac crest)으로부터 골수를 흡인(aspirated)하였다. 흡인 완료 후, 골수 흡인물을 15분 동안 2977g에서 원심분리한 후, 세포 펠렛을 플라스틱 배양 플레이트 표면에 부착되는 흡인물의 자연적인 경향(natural tendency)을 기반으로 선정하였고, 선정된 중간엽줄기세포(MSC)는 10% 소태아혈정(fetal bovine serum; FBS; 깁코) 및 1x 항생제-항진균제 용액(깁코)을 함유하는 저-글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM-LG; 깁코, 그랜드아일랜드, 뉴욕)에서 배양하였다. DMEM-LG에서 배양 7일 후, 비부착 조혈세포을 제거하였다.분리된 세포를 조직 배양 플라스틱에 부착하는 능력과 단일 세포-유래 군체를 형성하는 능력, 그리고 골원성, 지방형성 및 연골원 계통으로 분화하는 능력에 대하여 특징화하였다(도 8). 자가이식에 있어서, 개 BMSC를 각각 7일 동안 분리하여 배양하였다. 생체 내(in vivo) 연구에서 개 BMSC 4계대를 사용하였다.

비글로부터 자가유래 BMC의 제조

수술 전, 전신마취하에서 2% 이소플루란(시그마)을 사용하여 비글의 뒤쪽 장골릉으로부터 자가유래 골수를 흡인하였다. 6mL의 항응혈제(시트르산 덱스트로스 A)가 함유된 30mL 실린지에 24mL의 골수 흡인물을 채웠다. 흡인 완료 후, 골수 흡인물을 15분 동안 2977g에서 원심분리하여, 혈장, 골수농축액, 적혈구를 분리한 후 혈장을 제거하고(국내 등록특허 10-1296450), 하부의 골수농축액 및 적혈구 중 ACK 용해 버퍼(깁코)를 사용하여 적혈구를 선택적으로 용해하였다. 최종적으로, 0.3mL의 BMC를 총 골수 흡인물로부터 얻은 후, 즉각적으로 동물 수술을 위한 수술실로 이동시켰다. 세포 수준에서 자세한 분석을 실시하기 위하여, BMC를 0.45㎛ 기공의 실린지 필터로 여과하고, 상기 BMC를 제조된 개 MSC로 웰당 총 배지의 20% 부피에서 첨가하였다.

수술 절차 및 수술 후 관리

수컷 비글(오리엔트바이오, 성남, 한국)을 동물 실험 모델에 사용하였다(전체 n=15; n=군 당 약 3마리). 개체 간 변수(inter-individual variation)를 최소화하기 위하여, 동일한 연령 및 14-15kg 무게의 비글을 선정하였다. 본 실험을 연세의생명과학연구위원회(Yonsei Biomedical Research Institute Committee)의 실험동물 관리 및 사용에 대한 윤리적 가이드라인(Ethical Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)에 준수하여 수행하였다. 연세대학교 의과대학의 동물실험윤리위원회에 의해 본 프로토콜을 승인받았다(승인번호 2012-0281). 동물 수술 전, 모든 실험동물에 세파졸린(30mg/kg)을 피하 주입하고, 케토롤락 트로메타민(0.5mg/kg) 또한 정맥 내 주입하였다. 모든 수술 절차를 2% 이소플루란(피라말 크리티컬 케어, 베들레헴, 펜실베니아)의 전신마취하에서 프리머스 마취 기계(드레거메디컬, 뤼베크, 독일)를 사용하여 수술하였고, 모든 수술 절차를 본 시설에 속해있는 수의사가 모니터링하였다. 수술 및 수술 후 관리 동안 수술 부위에서 약간의 부기를 제외하고는 합병증 또는 동물 사멸은 일어나지 않았다. 상기 수술 부위를 하루에 한 번 드레싱하였고, 배농(draining) 및 붕대처리하였다. 2% 이소플루란의 전신마취하에서, 오른쪽 무릎에 내측 슬개골 종절개(medial parapatellar incision)를 실시하고, 슬개골(patella)을 외번(evert)하였다. 이상 지지체의 치수와 동일한 직경 6mm 및 깊이 8mm의 원통형 골연골 결함을 대퇴 내측과(femoral medial condyle)의 체중지지 관절 표면에 골연골 자가이식 전송 시스템(Osteochondral Autograft Transfer System, 아스렉스, 네이플즈, 플로리다)을 사용하여 실시하였다. PLCL 및 PLLA/β-TCP로 구성된 생분해성 이상 지지체를 무릎 결함에 압입(press-fitted)하였고, 치료된 결함의 표면을 자연 관절(native articular) 표면으로 매끄럽게 씻어내었다. 상기 지지체를 다음와 같은 물질을 함유하는 골연골 결함 부위에 삽입하였다: 인산완충식염수(PBS), 5㎍의 개 IL-8(CUSABIO, 우한, 중국), 100㎕의 BMC, 100㎕의 BMC와 5㎍의 개 IL-8 또는 MSCs(1x10⁶세포)(도 2A).

이식 전, 상기 지지체를 케모카인 혼합물에 즉각적으로 담가두었다. 수술 후 동물이 진통을 겪는 것을 최소화하기 위하여, 아목시실린 클라블라네이트(13.75mg/kg) 및 멜록시캄(0.1mg/kg)을 7일 동안 지속적으로 사용하였다. 수술 후 12주에, 관절연골-뼈 조직을 수확하는 동안, 모든 실험동물을 메데토미딘 HCL(0.01mg/kg) 및 틸레타민 HCL/졸라제팜 HCL(10mg/kg)을 사용한 마취하에서 포타슘 클로라이드 과잉 투여로 안락사시켰다. 골연골 결함 부위에서 연골하골(subchondral bone) 재생을 정량적으로 평가하기 위해서 고해상도 마이크로검퓨터 단층촬영(μCT [Skyscan1076])을 사용하였다. 각각 NRecon v1.6.6.0 및 CTAn v1.13.2.1을 사용하여 이미지를 재현하고 분석하였다. 삼차원모델 시각화 소프트웨어 CTVol v2.0을 연골하골 재생을 분석하는데 사용하였다. X-선원(X-ray source)에 대한 설정을 전압 70kVp 및 전류 140μA로 하였고, 0.5mm-두께 알루미늄 필터를 빔 경화(beam induration)에 사용하였다. 픽셀 크기를 18㎛, 노출 시간을 1475ms 및 회전 단계를 0.5°로 완전한 회전을 360°로 하였다.

IL-8 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)

본 발명의 지지체 시스템에서 IL-8의 방출 패턴을 평가하기 위해서, 제조사의 지침에 따른 IL-8 효소결합면역흡착측정법(ELISA; R&D 시스템즈, 미니애폴리스, 미네소타)을 실시하였다. ELISA 전, 동적 조건을 자극하기 위해서 본 발명에서 사용되는 IL-8-주입 지지체를 37℃로 3g에서 쉐이킹 조건하에서 보관하였다. 상등액을 20분, 1시간, 4시간, 24시간, 48시간, 96시간, 144시간 및 192시간에서 회수하였고, 회수하는 시간에 배양 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 회수한 상등액을 항체로 코팅된 웰에 로딩하였고, 실온에서 4시간 동안 마이크로플레이트 쉐이커(microplate shaker) 위에서 배양하였다. 웰을 제공된 세척 버퍼로 세척하였고, 검출 항체와 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 플레이트를 분광 마이크로플레이트 리더(spectrophotometric microplate reader)로 450nm에서 리딩하였다. 모든 분석을 두 번씩 수행하였다. IL-8 농축액을 표준곡선으로부터 계산하였다.

조직학적 분석( Histological analysis)

지지체를 함유하는 재생된 연골 조직 및 마이크로메스 펠렛(micromass pellets)을 7일 및 24시간 동안 10% 포말린에 각각 고정시켰다. 고정 후, 상기 포말린-고정 표본을 파라핀에 임베디드(embedded)시켰다. 상기 파라핀-임베디드 절편을 탈파라핀화(deparaffinized)시키고, 재수화(rehydrated)시켜 PBS로 두 번 세척하여, 상기 절편을 손상된 지역에서의 조직 재생을 평가하기 위하여 사용하였다. 상기 제조된 연골 조직을 4㎛의 두께로 슬라이스하였고, 재생된 연골 조직에서의 세포 형태를 관찰하기 위하여 헤마톡실린에오진(HE)으로 염색하였고, 총 콜라겐 합성을 관찰하기 위하여 마손트리크롬(MT)으로 염색하였고, 글리코사미노글리칸을 검출하기 위하여 사프라닌 O/패스트 그린으로 염색을 실시하였다. 상기 염색한 샘플을 VS120 가상 현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)을 사용하여 관찰하였고, 절편의 이미지를 OlyVIA 2.5 프로그램(올림푸스)을 사용하여 분석하였다. 조직학적 검사의 정량적 평가를 위하여 O'Driscoll 점수 시스템을 사용하였고, 재생된 연골을 3명의 독립적인 전문가에 의해 점수 등급을 사용하여 평가하였다. 상기 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 모든 점수를 세 개의 독립적인 평가의 평균으로 나타내었다.

면역조직화학( Immunohistochemistry )

파라핀-임베디드 절편을 탈파라핀화시키고, 재수화시켜 PBS로 두 번 세척하였다. 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase)로 인한 비특이적 배경 염색을 감소시키기 위해서, 상기 절편을 과산화수소 블럭에 10분 동안 배양하고, PBS로 두 번 세척하였다. 상기 절편을 래빗 항-COL2A1(산타크루즈 바이오테크놀로지, 달라스, 텍사스), 마우스 항-아그레칸(산타크루즈 바이오테크놀로지), 래빗 항-COL1(산타크루즈 바이오테크놀로지) 또는 래빗 항-CD105(바이오스, 우번, 메사츄세츠) 항체와 4℃에서 밤새 배양한 후, PBS로 세척하였다. 피코에리트린-접합 고트-래빗 이차 항체(산타크루즈 바이오테크놀로지)와 녹색 및 적색 형광 단백질-접합 고트 항-마우스 이차 항체를 일차 항체의 시각화에 사용하였다. 모든 일차 및 이차 항체를 각각 1:100 및 1:5000의 희석에 적용하였다. 세포핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(시그마)로 염색하였다. 이미지를 짜이스 LSM 700 공초점 레이저 스캔 현미경(ZEN 2011 소프트웨어; 칼 짜이스 마이크로이미징, 예나, 독일)으로 조사하였다.

생체 외 연골원 분화(in vitro chondrogenic differentiation)

4계대까지 계대배양된 개 BMSC를 연골원 분화 분석에 사용하였고, 상기 세포를 연골분화(chondrogenic) 배지(1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄-A [깁코], 1% 항생제-항진균제 용액, 50㎍/mL 아스코르브산 및 10ng/mL 형질전환성장인자-β3 [TGF-β3; R&D 시스템즈]를 함유하는 DMEM-고 글루코스)에 보관하였다. 마이크로메스 배양을 위하여, 1x10⁵(10㎕)개의 세포 펠렛을 24-웰 플레이트에 조심스럽게 배치하고, 37℃에서 2시간 동안 부착하게 하였다. 이어서, 연골분화 배지에 IL-8 단독(500ng/mL), BMC 단독(20% w/v) 또는 두 가지 모두를 첨가하였다. 마이크로메스를 7일 및 14일 후에 수확하여, 연골분화-관련 전사인자 및 표지 유전자의 mRNA 및 단백질 발현을 각각 평가하였다.

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Quantitative reverse transcriptase -polymerase chain reaction)

중합효소 연쇄반응(PCR) 분석을 실시하였다. 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 RNeasy 키트(퀴아젠, 발렌시아, 캘리포니아)를 사용하여 분리하였다. 총 RNA의 1마이크로그램을 Omniscript 키트(퀴아젠)를 사용하여 역전사시켰다. 프라이머 세트를 하기와 같이 설계하였다:

히포크산틴 포스포리보실전달효소(HPRT)(센스―5'-AGCTTGCTGGTGAAAAGGAC-3'/안티센스―5'-TT ATAGTC AAGGGCATATCC-3'), Sox5(센스―5'-CCTCAAAGCCTCTGTCCCAG-3'/안티센스―5'-TCTTGGATGGCCTTGGTGAC-3'), Sox6(센스―5'-CCGTTTTGGCAGGAG TTTGG-3'/안티센스―5'-GG GCTGGTCCCTCTCTTTTC-3'), Sox9(센스―5'-CACAAGAAAG ACCACCCGGA-3'/안티센스―5'-GGAAATGTGCGTCTG TTCGG-3'), 아그레칸(센스―5'-GA GAGGAGACCCAAAC AGCC-3'/안티센스―5'-GGCACTCGTCAATGTCTGGA-3') 및 제 II형 콜라겐(센스―5'-GGGCAGAGGCAGGAAACTAA-3'/안티센스―5'-TGTAGG ACACACGCAGTTCC-3').

3번의 측정(n=3)으로 구한 평균 사이클 임계값을 내부 대조군으로써 HPRT 정규화와 유전자 발현을 계산하는데 사용하였다.

통계학적 분석

정상 테스트가 통과하도록, 두 개의 군 간의 비교에 양측-꼬리 독립 스튜던트 t-검정(two-tailed unpaired Student's t-test)을 사용하였다. 세 개 또는 그 이상의 군들의 비교에 대하여는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였다. 시너지 효과(synergistic effect)를 BMC-비처리군과의 비교 결과를 통하여 분석하였다. NS는 개 IL-8 및 개 IL-8/BMC군 간에 유의적 차이점이 없다는 것을 나타낸다. 모든 데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001 값은 통계학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.

실험결과

이상 지지체의 특성 및 생체 외 IL-8 방출 시험

비글 모델에서 골연골 결함 치료를 위해 제조된 이상 지지체를 관찰한 주사 전자 현미경 이미지를 도 1B에 나타내었다. 도 1B는 PLCL(윗부분) 및 PLLA/β-TCP(밑부분) 지지체의 각 부분을 나타내고, 두 부분은 서로 고도로 연결되어 있는 것을 보여준다. 이상 지지체는 다공성 68.8%±3.12% 및 기공 크기 288.1±68.15㎍를 가지며, 이는 지지체로부터 IL-8이 방출되어 MSC를 유입(recruitment)하는데 적당하다. 본 발명에 사용된 지지체의 압축계수(compressive modulus)는 117.5±15.62MPa이다. 생체 외 방출 시험을 5㎍의 재조합 개 IL-8을 함유하는 이상 지지체로부터의 IL-8 방출 패턴을 조사하기 위하여 실시하였다. 그 결과로 1일 또는 2일 이내에 4.78±0.12 및 4.85±0.15㎍의 IL-8이 각각 방출된 것을 도 1C에 나타내었다. 상기 결과는 IL-8이 본 발명에 따른 지지체 시스템에서 빠르게 방출되었다는 것을 나타낸다. 이는 지지체로부터의 IL-8의 파열 방출(burst release)이 손상된 조직 부위로 MSC가 유입되는 것을 촉진시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

골연골 결함에서 재생된 연골 및 골 재생의 전체적 형태에서의 IL-8 및 BMC의 조합 효과

수술 후 12주에서 비글의 골연골 결함에서 재생된 관절연골의 전체적 형태를 관찰하였다. 도 2B에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-8/BMC군에서 결함부위의 연골 표면이 둘러싸인 연골과 유사한 매끈한 연골-유사 조직으로 거의 가득 채워진 것을 확인하였다. IL-8/BMC군의 재생된 연골-유사 조직은 다른 군들에 비해 더욱 투명하였다. 이와 대조적으로, IL-8-단독, BMC-단독 및 MSC군은 PBS군에 비하여 결함 부위에서 더 나은 연골 재생을 보이지만, IL-8/BMC군에서의 재생에 비해서는 불완전한 연골 재생을 보였다. 상기 결과는 IL-8 및 BMC의 조합이 골연골 결함의 연골 표면에서의 조직 재생에 추가적인 강화 효과를 가진다는 것을 의미한다.

비글 모델에서 손상된 관절연골, 연골하골 및 골(bone) 재생에서 IL-8 및 BMC 조합의 효과를 평가하였다. 수술 후 12주에, μCT 이미지를 수득하였고, 상기 μCT 이미지를 이용하여 각각의 지지체가 이식된 골연골 결함 부위에서 연골하골의 재생을 평가하였다. 상기 μCT 결과는 PBS에서의 골(뼈) 재생과 비교하여 IL-8-단독 및 IL-8/BMC군에서 골 재생이 강화되었다는 것을 보여주며, 상기 강화된 수준은 IL-8-단독 및 IL-8/BMC군간에서 유사한 것으로 나타났다(도 3A). MSC군에서의 골 재생은 PBS군에서와 유사한 결과를 보였다. 예상외로, BMC-단독군에서 PBS군에서의 골 재생보다 낮은 결과를 보였다. 더욱 자세하게, μCT 결과의 정량은 PBS군(6.69±0.42), BMC-단독군(2.62±0.30) 및 MSC군(7.42±0.52)이 다량의 골 재생을 유도하지 않았다는 것을 보여준다. 그에 비하여, IL-8-단독(17.29±0.98) 및 IL-8/BMC군(14.62±0.48)은 다른 군들에 비하여 우수한 골 재생을 보였다(도 3B). 추가적으로, IL-8-단독(1.34±0.29) 및 IL-8/BMC군(1.30±0.05)은 PBS(0.40±0.11), BMC-단독(0.47±0.14) 및 MSC(0.52±0.02)군에 비하여 더 좋은 주입 비율 당 골 부피를 나타내었다(도 3C). 상기 결과는 골 재생이 IL-8 단독에 의한 골연골 결함 부위로의 MSC 유입을 통하여 강화된다는 것을 나타내며, 이를 통하여 IL-8/BMC 군을 골 질환 관련 치료 용도로 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

골연골 결함 부위에서 재생된 연골의 조직학적 분석

HE 및 MT 염색을 이용하여 조직학적 특성을 분석하였다. 재생된 조직의 연골 표면의 HE 염색에서 PBS 및 BMC-단독군이 다른 군들에 비하여 더욱 많은 염증 세포 및 혈관 조직이 형성된 반면에 IL-8-단독 및 MSC군에서는 섬유조직이 관찰되었다. 이와 대조적으로, IL-8/BMC군에서는, 재생된 조직의 연골 표면이 연골세포-유사 세포 및 골소강(urethrales)을 가진 매끈한 연골-유사 조직을 보였으며, 이는 IL-8/BMC군에 의해 재생된 연골이 정상 연골과 매우 유사하다는 것을 의미한다(도 4A, 윗부분). MT 염색에서는 모든 군에서의 재생된 조직의 연골 표면에 콜라겐 증착을 보이는 것으로 나타났으나, 그 중 IL-8/BMC군이 다른 군들에 비해 더 높은 콜라겐 함량을 보였다. 또한, IL-8/BMC군에서만 연골세포와 형태상으로 유사한 세포를 확인하였다. IL-8-단독 및 MSC군을 처리한 연골 표면에서는 연골세포-유사 세포가 존재하지 않았음에도 불구하고, 두 군에서 재생된 조직에서 많은 세포들이 관찰되었다(도 4A, 밑부분).

재생된 연골-유사 조직에서의 GAG 합성에서 IL-8 및 BMC 조합의 효과

PBS, IL-8-단독, BMC-단독, IL-8/BMC 및 MSC으로 처리한 조직의 재생 가능성을 조사하기 위하여, 사프라닌 O 염색을 사용하여 GAG의 합성을 평가하였다. 다른 군들에 비하여 IL-8/BMC군에서의 GAG 합성이 확연히 증가하였다. IL-8-단독군 또한 GAG 합성이 약간 증가되었으나, 재생된 조직의 연골세포에서 연골세포-유사 세포는 보이지 않았다. IL-8-단독 및 IL-8/BMC군과 대조적으로, PBS 및 BMC-단독군에서는 연골 표면에서의 GAG 합성이 나타나지 않았다. 조직이 사프라닌 O에 대하여 음성적이었음에도, MSC군에서의 연골 표면에서는 다양한 세포들이 관찰되었다(도 4B 및 도 4C). PBS군에서 가장 낮은 O'Driscoll 점수를 나타내었다(4.67±0.57). IL-8-단독(9.67±2.51) 및 BMC-단독(7.67±1.15)군은 PBS군에 비하여 약간 높은 점수를 보였다. MSC군(11.33±0.58) 또한 다른 군들에 비하여 약간 높은 점수를 보였다. 그러나, IL-8 및 BMC(15.67±0.58)의 조합은 다른 군들의 점수에 비하여 확연히 높은 점수를 나타내었다(도 4D). 상기 결과를 통하여, IL-8 및 BMC의 조합이 IL-8 단독 또는 BMC 단독에 비하여 결함 부위에서 더욱 효과적으로 기능적인 연골 재생을 강화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

연골분화 마커의 발현에서 IL-8 및 BMC 조합의 효과

면역조직화학을 이용하여, PBS, IL-8-단독, BMC-단독, IL-8/BMC 및 MSC군에서 재생된 조직의 연골 표면에서 두 개의 연골분화 마커인 제 II형 콜라겐 및 아그레칸의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과로 IL-8 및 BMC의 조합에서만이 재생된 연골 표면에서 제 II형 콜라겐 및 아그레칸의 발현을 유도되었다는 것을 확인하였다. IL-8-단독 및 MSC군에서는 재생된 연골 조직에서 제 II형 콜라겐 및 아그레칸이 약하게 발현되었지만, 재생된 연골 표면에서는 미미한 발현을 보였다(도 5A 및 도 5B). 추가적으로, 제 I형 콜라겐을 사용하여 섬유조직 형성 수준을 확인하였다. 그 결과, IL-8-단독 및 BMC-단독군의 조합에서 정상군과 유사한 제 I형 콜라겐 발현이 나타났다(도 9). 조합하여, 상기 결과는 IL-8 및 BMC의 조합이 제 II형 콜라겐 및 아그레칸과 같은 연골분화 마커의 수준을 증가시키는 결과를 통하여 유리질 연골(hyaline cartilage) 재생을 강화시킨다는 것을 입증하였다.

생체 내 MSC 유입에서의 IL-8 및 BMC 조합의 효과

생체 내 연골 결함 부위에 대한 MSC 유입에서의 IL-8 및 IL-8/BMC의 효과를 확인하기 위하여, 개 항-CD105 항체를 사용하여 MSC의 존재를 분석하였다. PBS 대조군에 비하여, IL-8이 연골 결함 부위로 CD105-양성 세포의 유입을 확연하게 유도시킨다는 결과를 보였다. 상기 PBS 대조군에서는 BMC가 약간 유도되었다. IL-8 및 BMC의 조합이 연골 결함 부위로 CD105-양성 세포의 유입에 추가적인 효과를 가지지만, IL-8/BMC군은 MSC군에 비하여 CD105-양성 세포를 결함부위로 유입시키는데 더 좋은 효과를 보이지는 않았다. 모든 실험군은 PBS군에 비하여 좋은 효과를 나타내었다(도 6A 및 도 6B).

생체 외 BMC-처리 MSC에서의 연골분화 전사인자 및 마커의 mRNA 발현 패턴의 변화

IL-8과 BMC의 조합이 비글 모델에서의 골연골 결함에서 연골 재생을 강화시키는 이유를 예상한 결과, BMC가 IL-8에 의한 MSC 유입에 연골분화 전사인자 및 마커의 발현을 강화시킬 수 있다는 것을 제기하였다. 상기 가설을 확인하기 위하여, MSC와 연골분화와 관련된 유전자의 mRNA 발현을 조사하였다. 실시간 PCR 결과를 통하여, IL-8-처리 MSC에서 Sox5, 6 및 9의 mRNA 발현에 변화가 없다는 것을 확인하였다. 그러나, BMC는 Sox6 및 9의 mRNA 발현을 확연하게 강화시켰다(도 7A). IL-8과 BMC의 조합 또한 Sox5, 6 및 9의 mRNA 발현에 추가적인 효과를 보이지 않았다. 유사하게, IL-8 단독은 아그레칸 또는 제 II형 콜라겐의 mRNA 발현에 대한 효과를 가지지 않았다. BMC 단독은 아그레칸 또는 제 II형 콜라겐의 mRNA 발현을 확연하게 강화시켰다(도 7B). IL-8과 BMC의 조합은 아그레칸 또는 제 II형 콜라겐의 mRNA 발현에 대한 추가적인 효과를 가지지 않았다. Sox9 및 제 II형 콜라겐의 단백질 수준은 IL-8과 BMC의 조합에 의한 추가적인 효과에 대하여 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 7C). 더욱이, 상기 결과는 마이크로메스 모델에서의 결과와 유사하게 나타났다(도 7D). 이에 따라, IL-8은 골수로부터 결함부위로 MSC를 유입시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, IL-8은 MSC의 연골원 분화에 어떠한 효과를 가지지 않는다는 것을 확인하였다. BMC-처리 MSC가 생체 내에서 TGF-β3 없이 연골원 분화를 할 때에는, 개 MSC의 Sox5, Sox6, Sox9, 아그레칸 및 제 II형 콜라겐의 mRNA 발현을 유도하지 않았다(도 10). 결과적으로, 연골원 분화의 미세환경하에서 연골분화 전사인자 및 마커의 mRNA 발현의 강화를 통하여 MSC가 연골원 계통으로 분화되는데 BMC가 도움을 준다는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, IL-8과 BMC의 조합을 통하여, 손상된 골 또는 연골을 효과적으로 재생할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 골연골변성증, 골연골 이영양증, 모르키오병, 골관절염, 박리성 골연골염, 골연골증, 연골염, 연골종, 연골육종, 추간판 탈출증, 클리펠-파일 증후군, 변형성 골염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 골손상，골손실, 염증-유도 골 질환, 골수염, 염증성 골다공증, 골연화증， 구루병， 섬유성 골염， 무형성 골 질환, 대사성골 질환, 치주골 질환 등 다양한 골 질환 또는 연골 질환의 치료에 폭넓게 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

인터루킨-8(Interleukin-8; IL-8) 및 골수농축액(bone marrow concentrate; BMC)을 유효성분으로 포함하는,
손상된 연골 부위로 줄기세포의 유입을 증대시키고, 유입된 줄기세포의 분화를 촉진시키고, 연골(cartilage)을 재생시키기 위한 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 골수농축액은 자가(autologous) 유래 골수농축액인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 연골은 유리질연골(hyaline cartilage), 탄성연골(elastic cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 줄기세포는 자가(autologous) 유래 줄기세포인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인, 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 골수(bone marrow)-, 지방 조직(adipose tissue)- 및 제대혈(cord blood)-유래 중간엽줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물에 의해 재생된 연골은 연골분화마커의 발현이 촉진되고, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan; GAG)의 합성이 증가된, 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 연골분화마커는 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸인, 조성물.
제 1항에 따른 조성물을 포함하는 손상된 연골 부위로 줄기세포의 유입을 증대시키고, 유입된 줄기세포의 분화를 촉진시키고, 연골(cartilage)을 재생시키기 위한 충전재.
생분해성 지지체에 인터루킨-8(Interleukin-8; IL-8) 및 골수농축액(bone marrow concentrate; BMC)을 포함하는,
손상된 연골 부위로 줄기세포의 유입을 증대시키고, 유입된 줄기세포의 분화를 촉진시키고, 연골(cartilage)을 재생시키기 위한 지지체.
제 11항에 있어서,
상기 생분해성 지지체는 폴리(락트산)(PLA; polylactic acid), 베타-트리칼슘 포스페이트(β-TCP), 폴리(l-락티드-코-ε-카프로락톤)(PLCL; poly(l-lactide-co-ε-caprolactone)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PCL(poly-ε-caprolactone), PAA(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드, 폴리오소에스테르, 콜라겐 젤, 하이드로 젤, 폴리비닐 알코올 스폰지, 젤라틴, 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글라콜 블랏 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 연골 재생용 지지체.
IL-8 및 골수농축액을 유효성분으로 포함하는 골 질환 또는 연골 질환 치료용 약학 조성물로서,
상기 골 질환 또는 연골 질환은 골 또는 연골의 손상 또는 소실에 의한 질환인, 약학 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 연골은 유리질연골(hyaline cartilage), 탄성연골(elastic cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
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제 13항에 있어서,
상기 연골 질환은 골연골변성증, 골연골 이영양증, 모르키오병, 골관절염, 박리성 골연골염, 골연골증, 연골염, 연골종, 연골육종, 추간판 탈출증, 클리펠-파일 증후군, 변형성 골염, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 골 질환은 늑골, 두개골, 장골, 상완골, 척추뼈, 골반뼈 및 어깨뼈로 구성된 군으로부터 선택되는 골 조직의 손상에 의한 질환인, 약학 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 골 질환은 골절, 골손상，골손실, 염증-유도 골 질환, 골수염, 염증성 골다공증, 골연화증， 구루병， 섬유성 골염， 무형성 골 질환, 대사성골 질환 및 치주골 질환 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.