CN115770326A - 用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系及其制备方法和用途。凝胶体系包括：凝胶基体聚合物，具有亲水性；基质金属蛋白酶敏感多肽，与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络；用于关节腔内软骨修复再生的活性治疗剂，被束缚在三维交联网络中；活性治疗剂包含来源于干细胞的外泌体。根据本申请实施例，亲水性的凝胶基体聚合物本身可以提供其修复再生的环境；活性治疗剂可以为软骨提供修复再生的环境，两者共同作用，促进关节软骨修复再生；外泌体具有较高的生物活性，可以分泌多种生物因子，以及外泌体表面附着有多种蛋白，可以促进关节软骨的修复和再生；提高关节软骨的修复和再生的效果。
Description
技术领域
本申请属于关节修复技术领域，具体涉及一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系及其制备方法和用途。
背景技术
软骨是人或动物体内骨骼系统的重要组成部分。例如，关节腔内软骨能够起到缓冲应力作用和润滑作用，保护关节内软骨不受损伤，还能增加关节的灵活性。关节软骨损伤后因损伤程度、个体差异、活动刺激及疾病发展阶段的不同，关节腔内的炎性微环境处于不断变化之中。
关节软骨损伤后的急性炎症反应可以诱导炎症细胞在受损区域的积累，起到自动清创的作用，具有保护关节腔内组织和软骨的效果。相关技术中的抗炎策略可能导致关节局部在某一时期处于次或高治疗药物水平，无法使关节软骨实时处于适宜再生的微环境，无法达到最佳的修复治疗效果。
发明内容
本申请实施例提供一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系及其制备方法和用途，旨在提供一种实时响应型释放生物因子的凝胶体系，实现对损伤的关节软骨的修复再生。
第一方面，本申请实施例提供用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系，包括：
凝胶基体聚合物，基体聚合物具有亲水性；
基质金属蛋白酶敏感多肽，基质金属蛋白酶敏感多肽与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络；
用于关节腔内软骨修复再生的活性治疗剂，活性治疗剂被束缚在三维交联网络中；其中，活性治疗剂包含来源于干细胞的外泌体，至少部分基质金属蛋白酶敏感多肽与外泌体结合。
根据本申请一个方面的实施例，凝胶基体聚合物选自透明质酸、聚乙二醇和壳聚糖或其组合，可选为，乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇。
根据本申请一个方面的实施例，基质金属蛋白酶敏感多肽包含如SEQ ID No.1-8中至少一个所示的氨基酸序列。
根据本申请一个方面的实施例，基质金属蛋白酶敏感多肽在凝胶体系中的质量浓度为10～80mg/ml，可选为40mg/ml。
根据本申请一个方面的实施例，活性治疗剂还包括玻璃酸钠、富血小板血浆、间充质干细胞、氨基葡萄糖和硫酸软骨素中至少一种。
根据本申请一个方面的实施例，干细胞选自滑膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或其组合。
根据本申请一个方面的实施例，外泌体在凝胶体系中的质量浓度为1-10μg/ml，可选为5μg/ml。
根据本申请一个方面的实施例，凝胶体系还包括碱性有机溶剂。
第二方面，本申请提供了第一方面的用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系的制备方法，方法包括以下步骤：
S1.提供含有来源于干细胞的外泌体的活性治疗剂；
S2.提供基质金属蛋白酶敏感多肽；
S3.将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽和凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，后进行共孵育，以得到凝胶体系。
根据本申请一个方面的实施例，S3步骤中，先将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽混合，后与凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，接着进行共孵育，以得到凝胶体系。
第三方面，本申请提供了第一方面的凝胶体系用于制备治疗关节腔内软骨修复再生药物的用途。
本申请实施例的用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系，根据发炎处的严重程度进行灵活释放生物因子，按需释放活性治疗剂，可以在三维交联网络达到灵活的缓释效果，可以实时智能调节软骨所处的微环境。亲水性的凝胶基体聚合物本身可以对发炎或受损的关节腔内的软骨进行作用，提供其修复再生的环境；活性治疗剂在消炎的基础上可以为软骨提供修复再生的环境，两者共同作用，促进关节软骨修复再生；此外，活性治疗剂中来源干细胞的外泌体，具有较高的生物活性，可以分泌多种生物因子，以及外泌体表面附着有多种蛋白，可以软骨进行消炎处理，并促进关节软骨的修复和再生；外泌体与至少部分基质金属蛋白酶敏感多肽结合，可以伴随着基质金属蛋白酶敏感多肽的被降解，及时且灵活地释放到关节腔中，提高关节软骨的修复和再生的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例的凝胶体系形成示意图；
图2为本申请实施例的凝胶外观图；
图3为本申请实施例的凝胶电镜图；
图4为本申请实施例的不同肽段成胶时间图；
图5为本申请实施例的凝胶分别在PBS、MMP13、MMP13-抑制剂中降解情况；
图6为本申请实施例的外泌体纳米颗粒分别图；
图7为本申请实施例的外泌体透射电镜图；
图8为本申请实施例和对比例的兔软骨缺损后6周后外观图。
具体实施方式
下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本申请进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅意在解释本申请，而不是限定本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本申请的示例来提供对本申请更好的理解。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在组织工程学领域中，大量抗炎和/或抗氧化应激药物已广泛用于关节软骨治疗，并实现了有效的关节软骨恢复，表明抗炎药物在一定程度上可以预防疾病进展，实现对软骨的治疗。
为了推动组织工程学中的大量抗炎和/或抗氧化应激药物应用于临床组织损伤(如软骨损伤)的治疗，本申请人进行了大量的研究，发明人发现，传统早期抗炎策略可能导致关节局部在某一时期处于次或高治疗药物水平，无法使软骨实时处于适宜再生的微环境，阻碍软骨的再生。
然而，软骨损伤后的急性炎症反应可以诱导炎症细胞在受损区域的积累，起到自动清创的作用，具有保护关节组织的特点，但软骨组织的修复能力有待提高。经发明人研究发现，软骨关节损伤后因损伤程度、个体差异、活动刺激及疾病发展阶段的不同，关节炎性微环境处于不断变化之中
发明人发现，传统组织工程早期抗炎策略：单纯利用关节软骨内药物递送系统提供持续的抗炎药物释放，缺乏关注损伤后的疾病进程，这导致关节局部在某一时期处于次或高治疗药物水平，无法实时处于适合软骨再生的微环境，阻碍了关节软骨的修复和再生。
基于此，发明人提出一种疾病微环境响应的药物递送系统，可以利用在受损区域起到清创作用的蛋白，根据微环境的变化控制药物的释放以配合软骨修复再生，实现关节内药物按需智能释放，达到较佳的治疗效果。
凝胶体系
本申请实施例第一方面提供一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系，包括：
凝胶基体聚合物，基体聚合物具有亲水性；
基质金属蛋白酶敏感多肽，基质金属蛋白酶敏感多肽与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络；
用于关节腔内软骨修复再生的活性治疗剂，活性治疗剂被束缚在三维交联网络中；其中，活性治疗剂包含来源于干细胞的外泌体，至少部分基质金属蛋白酶敏感多肽与外泌体结合。
根据本申请实施例，在关节软骨损伤的修复过程中，基质金属蛋白酶家族可以作为剪切胶原纤维，从而作为直接效应蛋白酶引起软骨细胞外基质降解，基质金属蛋白酶与关节腔内微环境及软骨损伤修复密切相关。通过将基质金属蛋白酶敏感多肽与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络，得到能够响应于关节腔内基质金属蛋白酶含量的三维交联网络；活性治疗剂被束缚在三维交联网络中，根据三维交联网络中基质金属蛋白酶敏感多肽被降解的程度或速度，活性治疗剂被释放，可以实时智能调节软骨所处再生微环境。此外，键合或分散于凝胶基体聚合物中的基质金属蛋白酶敏感多肽和活性治疗剂可以在等于或高于2周的时期内根据关节腔内的微环境被持续传递。
在一些实施例中，凝胶基体聚合物选自透明质酸、聚乙二醇和壳聚糖或其组合。
根据本申请实施例，具有亲水性的凝胶基体聚合物与基质金属蛋白酶敏感多肽化学键合，形成三维交联网络，可以为活性治疗剂提供作用于关节腔内软骨的载体，可以辅助促进关节腔内软骨修复再生，例如质酸，是构成人体细胞间质、关节滑液等结缔组织的主要成分，用作凝胶基体聚合物时，根据三维交联网络中基质金属蛋白酶敏感多肽被降解的程度或速度，质酸可以在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能，促进关节微环境修复再生；聚乙二醇具有相互连接的微孔网络，可使营养成分浸润，促进细胞生长，以促进软骨基质的产生。
在一些实施例中，凝胶基体聚合物为乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇。
根据本申请实施例，聚乙二醇一种亲水性聚合物，具有良好的生物相容性，具有相互连接的微孔网络，可使营养成分浸润，促进细胞生长。乙烯砜(VS)基团可以作为非零长度交联剂，具有生理和生物相容性反应条件、非引发剂凝胶化、高机械稳定性和合理特异性等优点。使用乙烯砜(VS)基团修饰的四臂聚乙二醇，为发生降解反应的混合物提供了充足的时间，可以达到更好的缓释效果。
在一些实施例中，基质金属蛋白酶敏感多肽包含如SEQ ID No.1-8中至少一个所示的氨基酸序列。
根据本申请实施例，基质金属蛋白酶敏感多肽具有较高的敏感性，可以被发炎或受损的关节腔内的基质金属蛋白酶降解，从而使三维交联网络的孔隙由小变大，变大的孔隙可以更加方便和快捷地使活性治疗剂对微环境发生作用，实现修复和治疗。氨基酸序列具体如表1所示。可以被基质金属蛋白酶13剪切和降解，具有被剪切的位点。
表1。
根据本申请实施例，上述基质金属蛋白酶敏感多肽，含有多个被剪切位点，具有较高的活性，可以被基质金属蛋白酶降解；来源于滑膜间充质干细胞的外泌体，具有较高的活性，包含多种生物因子及核酸物质如miR-26a-5p，从而对发炎处的关节或软骨进行消炎处理，并对关节或软骨进行修复和再生；敏感多肽和外泌体分布于凝胶载体，当组织发炎时，发炎的微环境中聚集有基质金属蛋白酶，可以对凝胶体系中的敏感多肽反应，使敏感多肽被降解；降解后，凝胶体系中的孔隙由小变大，变大的孔隙可以更加方便和快捷地使外泌体中的生物因子和蛋白对微环境发生作用，实现治疗；上述凝聚体系根据微环境中聚集的基质金属蛋白酶浓度不同而匹配的不同降解速度，即根据发炎处的严重程度进行灵活释放生物因子，按需释放负载的生物因子，十分灵活和智能，达到更加灵活的缓释效果，可以实时智能调节软骨所处的微环境。
在一些实施例中，基质金属蛋白酶敏感多肽在凝胶体系中的质量浓度为10～80mg/ml，可选为40mg/ml。
根据本申请实施例，基质金属蛋白酶敏感多肽在凝胶体系中的质量浓度可以为10、15、20、25、30、32、35、38、40、42、43、45、47、50、55、60、65、70、75、80mg/ml，也可以是上述范围内的任意数值。
将上述浓度的基质金属蛋白酶敏感多肽用于软骨修复，可以控制基质金属蛋白酶敏感多肽与关节腔内降解蛋白的反应速率，从而控制三维交联网络中孔隙变大的速率，控制促进外泌体在软骨损失区域的扩散和转移的速度，达到智能缓释的效果，提升凝胶体系对软骨损失的修复效果和治愈能力。上述浓度的基质金属蛋白酶敏感多肽在凝胶体系中可以有效保证缓释修复的效果。
在一些实施例中，活性治疗剂还包括玻璃酸钠、富血小板血浆、间充质干细胞、氨基葡萄糖、硫酸软骨素和双氯芬酸钠中至少一种。
根据本申请的实施例，凝胶基体聚合物可以作为空白骨架，将上述各自活性治疗剂嵌入或束缚在其中，当关节腔内软骨受损，基质金属蛋白酶的含量增多，基质金属蛋白酶敏感多肽被降解的速率提高，活性治疗剂的释放速率也随之提高；当发炎或受损的关节腔内的症状得到缓解，基质金属蛋白酶的含量减少，基质金属蛋白酶敏感多肽被降解的速率降低，活性治疗剂的释放速率也随之降低。例如，在凝胶基体聚合物中掺杂了硫酸软骨素，能诱导间充质干细胞分化成软骨细胞；进一步的，而且可以通过改变活性治疗剂的组成，根据关节软骨的特定区域，定制分化细胞的表型和基质生产模式，实现对关节软骨的特定区域的修复再生。
在一些实施例中，干细胞选自滑膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或其组合。
根据本申请实施例，由于干细胞为滑膜间充质干细胞，得到的外泌体具有多种蛋白和核酸分子，可以促进抗炎性因子生成、抑制基质蛋白酶产生、促巨噬细胞极化功能的积极作用，通过其在关节腔内抗炎及免疫调控的作用，增强软骨支架对兔软骨缺损的修复效果。同时，来源于干细胞为滑膜间充质干细胞的外泌体等可以与活性治疗剂中的硫酸软骨素等组分，共同促进关节软骨再生，实现修复速度快和实现完全再生软骨的效果。
在一些实施例中，外泌体在凝胶体系中的质量浓度为1～10μg/ml，可选为5μg/ml。
根据本申请实施例，外泌体在凝胶体系中的质量浓度可以为1、2、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.3、4.5、4.7、5、6、7、8、9、10μg/ml，也可以是上述范围内的任意数值。
将上述浓度的外泌体用于软骨修复，可以促进外泌体在软骨损失区域的扩散和转移，能够大大提高外泌体的有效利用率，提升凝胶体系对软骨损失的修复效果和治愈能力。上述浓度的外泌体在凝胶体系中活性强，能分泌和提供生物因子作用于损失区域。
在一些实施例中，凝胶体系还包括碱性有机溶剂。碱性有机溶剂选自三乙醇胺、PBS/NaOH或其组合。碱性有机溶剂的pH约为8。本实施例中的碱性有机溶剂可以使凝胶基体聚合物分散其中，还可以为关节损伤区域提供碱性微环境，促进关节损伤区域的修复。
第二方面，本申请提供了第一方面的用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系的制备方法，方法包括以下步骤：
S1.提供含有来源于干细胞的外泌体的活性治疗剂；
S2.提供基质金属蛋白酶敏感多肽；
S3.将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽和凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，后进行共孵育，以得到凝胶体系。
根据本申请实施例，将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽和凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，控制共孵育的条件，可以得到具有活性的外泌体，使凝聚体系中的外泌体和凝胶基体聚合物共同作用，促进关节腔内软修复再生。
在一些实施例中，S1步骤中，可以将活性治疗剂中的各组分在溶于中进行混合，并保持外泌体的活性。
在一些实施例中，S3步骤中，先将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽混合，后与凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，接着进行共孵育，以得到凝胶体系。本申请实施例中，先将活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽混合可以实现活性治疗剂、基质金属蛋白酶敏感多肽的结合，随着基质金属蛋白酶敏感多肽被降解，外泌体可以根据被降解的速度直接释放到关节腔内，更直接快速地根据被降解的速度对关节腔内的损失区域作用，达到修复再生的目的。
在一些实施例中，碱性有机溶剂选自三乙醇胺、PBS/NaOH或其组合。
在一些实施例中，共孵育的条件为37℃。
第三方面，本申请提供了第一方面的凝胶体系用于制备治疗关节腔内软骨修复再生药物的用途。根据本申请实施例，可以为制备治疗关节腔内软骨修复再生药物提供一个新思路，如可注射的凝胶体系，或通过控制凝胶体系浓度，实现将凝胶体系作为支撑结构用于关节腔内。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
滑膜间充质干细胞外泌体的提取与鉴定
1)滑膜干细胞的提取
将大鼠麻醉后，无菌条件下于打开膝关节关节囊，髌上囊处取出滑膜组织，将收集的标本浸于4℃无菌生理盐水中。将标本移入无菌操作台，PBS冲洗3次，剪除脂肪和部分结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织。用无菌眼科剪将滑膜剪成1.0-2.0mm3碎块，将碎片移入15ml的离心管，依次用0.1％的胰蛋白酶(30min)和0.1％胶原酶P(2h)在37℃、5％CO2培养箱中消化。消化结束后，经120目无菌过滤网过滤，1000r/min离心10min弃去上清液。重复3次，除去含胶原酶的上清液，重悬细胞并计数。以1×104个有核细胞平铺于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下，在基础培养基(DMEM、体积分数10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中培养，24h后换液，除去未贴壁细胞，单层培养7-14d。连续观察细胞克隆的生长和形态学特征，挑选合适的细胞继续扩增培养，以此作为原代滑膜干细胞(SMSCs)。细胞生长至亚融合状态时，2.5g/L胰蛋白酶消化，1:3传代接种于培养皿，每3日更换培养基。第3代细胞为目的细胞，即大鼠滑膜间充质干细胞。
2)大鼠滑膜间充质干细胞上清收集：
当滑膜间充质干细胞生长密度达80％后，将培养基更换为含10％去外泌体血清的培养基，48h-72h后收取培养上清液，将其于4℃300×g，10min离心除去细胞碎片：4℃2000×g，10min离心去除死细胞等杂质：0.22m无菌德膜过滤进一步去除杂质：4℃100000×g，120min超速离心得到含有外泌体的沉淀，加入约200μl PBS洗涤，再次4℃100000xg，120min超速离心，得到高纯度滑膜间充质干细胞来源的外泌体，将所得外泌体保存于-80℃做后续使用。
3)外泌体鉴定
对所获得的外泌体采用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)进行观察及鉴定。
透射电子显微镜：将外泌体的悬浮液滴于铜网上，在空气中干燥。然后，用3％戊二醛固定样品2小时后用PBS液冲洗，再用2％乙酸铂酯染色30秒，将样品置于TEM(HITACHI，日本)下并观察外泌体的形貌和大小。
纳米颗粒跟踪分析：使用纳米颗粒跟踪分析仪(NanoSight NS500，Zetaview，英国)检测外泌体的粒径大小和浓度，如图6。首先，使用已知尺寸的颗粒(CPC1O0标准溶液)校准测量系统的NP100纳米孔，然后用PBS液清洗3次：将外泌体样品用PBS液稀释1000倍，然后加入纳米孔中进行测定。使用纳米颗粒跟踪分析仪和Control Suite V2.2软件对外泌体的粒径和浓度进行测量和分析。
根据上述检测的粒径主要分布在100nm-200nm之间；透射电镜图如图7，说明得到了滑膜间充质干细胞外泌体。
实施例2
乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇与基质蛋白酶敏感多肽构建响应型水凝胶体系
选取8种具备基质蛋白酶-13(MMP-13)的被剪切位点的基质蛋白酶敏感多肽(如表1)与乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇进行交联，如图1所示。使用弱碱性0.3M三乙醇胺作为溶剂，将8种肽段分别与乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇混合，使肽段终质量浓度为40mg/ml，乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇终质量浓度为100mg/ml，混合后至于37℃下反应，随后使用无菌水冲洗6h，制备成响应型水凝胶体系。
实施例3
一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系，包括：
凝胶基体聚合物，基体聚合物具有亲水性，浓度为100mg/ml；
基质金属蛋白酶敏感多肽，基质金属蛋白酶敏感多肽与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络，基质金属蛋白酶敏感多肽的序列为GCRR-GPLGLSLGK-RRCG，浓度为40mg/ml；
用于关节腔内软骨修复再生的活性治疗剂，活性治疗剂被束缚在三维交联网络中；其中，活性治疗剂包含来源于干细胞的外泌体，至少部分基质金属蛋白酶敏感多肽与外泌体结合，浓度为5μg/ml。
得到的凝胶体系在孵育后，通过控制凝胶基体聚合物可以具有支架的支撑作用，得到凝胶支架。
利用蔡司体视镜观察水凝胶支架的大体观及形态学结构，利用扫描电镜观察水凝胶的表面结构，如图2和图3所示。
测试部分
1)不同肽段成胶速度评估：将多肽与乙烯枫基团修饰的四臂聚乙二醇按一定比例混合好后置于37℃下，在不同时间拿出观察其成胶状态，如图4所示，其中，peptide1-8依次对应表1中8个多肽，其中，肽段3，序列为GCRR-GPLGLSLGK-RRCG，成胶速度为5分钟之内，可以应用于上述水凝胶体系。
2)凝胶的降解响应性：将凝胶3分别置于浓度普通PBS溶液、浓度为100ng/ml的MMP13溶液、浓度为100ng/ml的MMP13+浓度为10μg/ml的抑制剂溶液中，浓度为10μg/ml的抑制剂溶液主要含有CL-82198化合物。在6h、12h、24h、48h、3d、5d、7d、10d及14d后取出，冻干后测量其干重，计算凝胶降解率为：(W0(初始重量)-W(处理后重量))/W0(初始重量)(图5)。
通过图5的结果，说明了凝胶3的降解速率在MMP13的作用下明显加快，而加入MMP13及MMP13抑制剂后，凝胶降解速率无明显变化，提示凝胶具有MMP13智能响应特性。
应用实验
将实施例3的水凝胶作用于软骨受损的家兔，为MRE组，对比未经处理组作参照，为对照组，如图8，左图为未经处理组，软骨损伤经两周后修复效果差，右图为将实施例3的水凝胶处理的软骨受损的家兔，修复效果较好。用实施例3的水凝胶作用于软骨受损的家兔得到加入凝胶家兔修复效果更好的结果，说明了本申请的凝胶体系具有更优异的修复再生能力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，上述描述的系统、模块和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。应理解，本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系，包括：
凝胶基体聚合物，所述基体聚合物具有亲水性；
基质金属蛋白酶敏感多肽，所述基质金属蛋白酶敏感多肽与基体聚合物化学键合，以形成三维交联网络；
用于关节腔内软骨修复再生的活性治疗剂，所述活性治疗剂被束缚在所述三维交联网络中；其中，所述活性治疗剂包含来源于干细胞的外泌体，至少部分所述基质金属蛋白酶敏感多肽与所述外泌体结合。
2.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述凝胶基体聚合物选自透明质酸、聚乙二醇和壳聚糖或其组合，可选为，乙烯枫基团或其他活性基团修饰的四臂聚乙二醇；
所述基质金属蛋白酶敏感多肽包含如SEQ ID No.1-8中至少一个所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述基质金属蛋白酶敏感多肽在所述凝胶体系中的质量浓度为10～80mg/ml，可选为40mg/ml。
4.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述活性治疗剂还包括玻璃酸钠、富血小板血浆、间充质干细胞、氨基葡萄糖和硫酸软骨素中至少一种。
5.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述干细胞选自滑膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或其组合。
6.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述外泌体在所述凝胶体系中的质量浓度为1-10μg/ml，可选为5μg/ml。
7.根据权利要求1所述的凝胶体系，其特征在于，所述凝胶体系还包括碱性有机溶剂。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的用于关节腔内软骨修复再生的凝胶体系的制备方法，包括以下步骤：
S1.提供含有来源于干细胞的外泌体的活性治疗剂；
S2.提供基质金属蛋白酶敏感多肽；
S3.将所述活性治疗剂、所述基质金属蛋白酶敏感多肽和凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，后进行共孵育，以得到所述凝胶体系。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，S3步骤中，先将所述活性治疗剂、所述基质金属蛋白酶敏感多肽混合，后与凝胶基体聚合物在碱性有机溶剂中进行混合，接着进行共孵育，以得到所述凝胶体系。
10.如权利要求1-7中任一项所述的凝胶体系用于制备治疗关节腔内软骨修复再生药物的用途。
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