CN1511592A - 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法，其特征是它以胎牛皮或牛跟腱为基料，经过脱水、脱脂处理，进行一次酶处理，降低组织纤维间的共价键，再经透析，进行二次处理，除去抗原决定簇，再用醋酸溶解得到无抗原性胶原溶液，再制成胶原海绵膜，用丙三醇浸泡吸附，经干燥后将肝素醋酸水溶液与表皮生长因子水溶液的混合物与丙三醇再次混合润湿胶原海绵膜，经冷冻干燥构建成皮肤组织工程支架。该支架具有无抗原性、强度高、柔韧性好、手术植入方便、对创伤面无毒害、并可有效诱导创伤面部位自体细胞生长、促进创面愈合的优点及效果。

Description

一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法

技术领域

本发明属于医疗器械敷料类，具体地说它是采用组织工程方法以胎牛皮及牛跟腱的胶原为支架构建皮肤组织工程支架的方法。

背景技术

随着组织工程科学的出现和发展，皮肤创伤修复敷料研究已从单纯的创伤包覆敷料研究转向活性人工皮肤研究，利用组织工程构建的活性人工皮肤成为皮肤创伤修复的最佳选择。

皮肤组织工程支架的研究是组织工程研究的重点之一，已有近20年的历史，人们对以PLGA、乙丙交酯为主的聚酯类和以丝素、胶原为主的天然生物材料进行深入研究表明，聚酯类虽然生物性能良好，但降解后的产物会使周围组织酸度升高，在使用上受到限制；以胶原为主的天然生物材料因具有良好的生物相容性和促进组织修复再生、止血等特点日益引起重视。

胶原蛋白具有G-x-y的重复结构域，种属间差异较小，属免疫原性较低的蛋白质大分子，但不同种属和同种属间仍存在差异，这一差异导致胶原存在一定的免疫特性。

胶原溶液经冷冻干燥形成的胶原海绵膜弹性差、易破碎、稳定性差，因而需外加交联剂或经特殊处理进行交联。

已有的以胶原蛋白为原料制成胶原海绵膜作为创伤敷料的技术中，有的以戊二醛作为交联剂，提高了胶原海绵膜的强度、韧性和稳定性，但已有报道证实戊二醛具有明显的细胞毒性，以含有戊二醛的海绵膜培养细胞，细胞向内生长很少，并且随着胶原海绵膜在体内的逐渐降解，戊二醛单体也会随之释放入体液中，对肌体产生毒害，因此戊二醛不是理想的交联剂；有的用硫酸软骨素作为交联剂，提高了胶原海绵膜的强度和对酶的耐受性，但硫酸软骨素与胶原分子只能弱键结合，其本身具有促进疤痕形成、降低胶原凝血能力等缺点，同样不是理想的交联剂。

发明内容

本发明的目的正是为了克服已有技术的缺点不足之处，提供一种无抗原性、强度高、柔韧性和耐酶性好、对肌体无毒害、含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法。

采用以下工艺技术可实现本发明的目的：

(a)、以胎牛皮或牛跟腱为基料，按常规方法进行脱毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，制成脱水脱脂的胎牛皮或牛跟腱为原料，用双蒸水清洗原料后加入反应器内，加入原料重量1～5％的胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，与原料重量10倍的水配制的水溶液进行一次酶处理，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用双蒸馏水洗涤三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃温度下，振动24～32小时，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达到2M，沉淀完全后，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入反应器内，并加入上述原料重量1～3％的无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，与原料重量10倍的配制的水溶液进行二次酶处理，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；

(b)、再将(a)项的无抗原性胶原溶液倒入预冷模型中，在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再真空冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀，厚度为0.1～0.5mm的胶原海绵膜，然后置入0.5～10％浓度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量为胶原海绵膜重量50～150倍，吸附膨胀后取出胶原海绵膜，在105～130℃温度下，真空干燥18～32小时，得到干胶原海绵膜；

(c)、将肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量为0.1～10mg/ml，然后用100目滤网过滤，得到肝素醋酸水溶液；

(d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生长因子的含量为0.001～0.1μg/ml，得到表皮生长因子水溶液；

(e)、最后将(c)项的肝素醋酸水溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50的比例混合，机械振动48小时后，将上述混合液再与5％的丙三醇水溶液按体积比0.1～5∶100混合后，浸润(b)项的干胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃温度下，冷冻4～10小时，再真空干燥，得到的构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。

本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：

1)、本发明制成的皮肤组织工程支架所用胶原海绵膜无抗原性。

胶原的抗原决定簇位于胶原分子的非螺旋的尾肽部分，本发明首先采用专一性强的胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶对胶原的共价键进行定向切除，然后用无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶对胶原的尾肽进行切除，使胶原不再具有抗原性。

2)、采用增塑和热交联联合处理工艺技术，制成的皮肤组织工程支架强度高、柔韧性和耐酶性好，对创伤肌体无毒害。

已有技术的交联剂因会对肌体产生毒害等均存在一定缺陷，本发明采用以丙三醇增塑和热交联联合处理的方法，制成的皮肤组织工程支架，具有强度高、柔韧性和耐酶性好、对肌体无毒害的特点。

3)、本发明在皮肤组织工程支架中加入表皮生长因子，可有效诱导创伤部位自体细胞生长，促进创面愈合。

外源性表皮生长因子能够诱导细胞分裂，加速创伤修复，已经应用于临床；将外源性表皮生长因子引入皮肤组织工程支架中，可有效诱导创面组织细胞分化生长。

4)、本发明采用表皮生长因子缓释技术，使表皮生长因子可以持续释放。

无论体外细胞培养，还是创伤部位自体细胞生长，生长因子都需要与细胞接触超过一定时间才能有效发挥作用，而生长因子在体内的活性半衰期很短(几小时或更短)，为解决此问题，本发明通过引入肝素，促使表皮生长因子与胶原形成一个缓释系统，逐渐释放出表皮生长因子，在创伤愈合前保持表皮生长因子持续作用于创面组织细胞。

具体实施方式

实施例1

将胎牛皮按常规方法进行脱毛、去筋膜、脂肪和血污、清洗、冷冻、切成厚0.5mm的薄片，用丙酮脱水三次，用石油醚脱脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脱水脱脂的胎牛皮为原料，取10g原料，用双蒸水洗涤加入反应器内，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液。进行一次酶处理，在20℃、pH＝2条件下，机械振动24小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液，取沉淀，用双蒸馏水洗涤三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃温度下，机械振动32小时后，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达到2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀装入透析袋进行透析三次，收集透析后胶原溶液加入反应器内，并加入0.3g菠萝酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动8小时，去除抗原决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，用0.05M的醋酸水溶液1000g溶解用失重法测得含有0.4g/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm的预冷模具中，在-10℃温度下，冷冻24小时，再真空干燥24小时，得到孔径均匀的厚度为0.1mm胶原海绵膜0.15g，然后置入0.5％浓度的7.5ml丙三醇溶液中吸附膨胀后取出在105℃温度下，真空干燥32小时，得干胶原海绵膜，取肝素与0.005M醋酸水溶液中使肝素含量为0.1mg/ml，再将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml与表皮生长因子溶液100ml混合机械振动48小时后，取上述混合液0.1mL与5％浓度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵膜，润湿后在-70℃温度下，冷冻4小时，再真空干燥，得到的构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。

实施例2

将牛跟腱按实施例1的方法进行脱水脱脂，抽真空除去石油醚，制成脱水脱脂的牛跟腱为原料，取原料10g用双蒸水洗涤后加入反应器内，加入由0.3g胰凝乳蛋白酶与100g配制的水溶液进行一次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动16小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清，取沉淀，用双蒸馏水洗涤四次，加入1000g0.5M醋酸水溶液，在10℃温度下，机械振动28小时，再加入氯入钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀，装入透析袋进行透析四次，收集透析后的胶原加入反应器内，并加入0.2g木瓜酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在35℃、pH＝7条件下，机械振动6小时，去除抗原性决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，用0.1M的醋酸水溶液1000g溶解，用失重法，测得含有2mg/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm的预冷模具中，在-40℃温度上冷冻10小时，再真空干燥36小时，得到孔径均匀厚度为0.25mm胶原海绵膜0.3g并置入5％浓度的30mL丙三醇水溶液，吸附膨胀后取出，在120℃温度下，真空干燥20小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量为5mg/ml，在将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生长因子水溶液200mL混合机械振动48小时后，取上述混合液1ml与5％浓度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵膜，浸润后在-40℃温度下，冷冻6小时，再真空干燥，得到的构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。

实施例3

用实施例2的脱水脱脂的牛跟腱为原料，取10g，用双蒸水洗涤后加入反应器内，加入由0.5g菠萝酶与100g水配制的水溶液进行一次酶处理，在40℃、pH＝8条件下，机械振动8小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清，取沉淀用双蒸水洗涤四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃温度下，机械振动24小时后，再加入氯化钠使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀装入透析袋进行透析五次，收集透析后的胶原溶液加入反应器内，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在40℃、pH＝8条件下机械振动4小时，除去抗原决定簇，再按常规方法酶灭活处理，离心分离，弃上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液1000g进行溶解，用失重法测定得到含4mg/ml无抗原胶原溶液，并倒入直径50mm的预冷模具中，在-70℃温度下，冷冻4小时，再真空干燥48小时，得到孔径均匀厚度为0.5mm的胶原海绵膜，0.5g，置入10％浓度的45ml丙三醇溶液吸附膨胀后取出，在130℃温度下，真空干燥18小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，肝素含量为10mg/ml，再取表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子含量为0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液5ml与表皮生长因子水溶液150ml混合机械振动48小时后，取混合液5ml与5％浓度的丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵膜，润湿后在-10℃温度下，冷冻10小时，再真空干燥，得到的构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。

Claims (1)

1、一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法，其特征在于它按下述步骤进行：

(a)、以胎牛皮或牛跟腱为基料，按常规方法进行脱毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，制成脱水脱脂的胎牛皮或牛跟腱为原料，用双蒸水清洗原料后加入反应器内，加入原料重量1～5％的胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，与原料重量10倍的水配制的水溶液进行一次酶处理，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用双蒸馏水洗涤三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃温度下，振动24～32小时，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达到2M，沉淀完全后，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入反应器内，并加入上述原料重量1～3％的无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，与原料重量10倍的配制的水溶液进行二次酶处理，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；

(b)、再将(a)项的无抗原性胶原溶液倒入预冷模型中，在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再真空冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀，厚度为0.1～0.5mm的胶原海绵膜，然后置入0.5～10％浓度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量为胶原海绵膜重量50～150倍，吸附膨胀后取出胶原海绵膜，在105～130℃温度下，真空干燥18～32小时，得到干胶原海绵膜；

(c)、将肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量为0.1～10mg/ml，然后用100目滤网过滤，得到肝素醋酸水溶液；

(d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生长因子的含量为0.001～0.1μg/ml，得到表皮生长因子水溶液；

(e)、最后将(c)项的肝素醋酸水溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50的比例混合，机械振动48小时后，将上述混合液再与5％的丙三醇水溶液按体积比0.1～5∶100混合后，浸润(b)项的干胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃温度下，冷冻4～10小时，再真空干燥，得到的构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。