CN100591764C - 列管式取向排列结构细胞支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种列管式取向排列结构细胞支架及制备方法，在下端垂直安置有一金属棒的塑料直筒的装置内，采用逐渐降温以形成温度梯度而引导溶液热致相分离的技术制备。细胞支架的材料是合成脂肪族聚酯类生物降解高分子材料、天然生物降解高分子材料，或共混物，材料中包含如生长因子那样的生物可降解活性物质或生物可降解无机物质为第三组分。制备列管式取向排列结构细胞支架用的溶剂为第一溶剂，或混合有第二溶剂的第一溶剂。采用自下而上逐渐降温的技术，降温速度为0.01-2.5℃/分钟，降温范围为+37至-196℃，最终得到管状的一级孔孔径为40-300微米、管壁的二级微孔孔径为0.01-3微米的组织工程用列管式取向结构细胞支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有列管式取向排列结构的组织工程用生物可降解细胞支架。
本发明还涉及上述细胞支架的制备方法。
背景技术
组织工程是将工程学原理同细胞学和组织生物学原理结合在一起以替代有缺陷(已老化、受损伤或病态)组织和器官的科学。它是先将自体细胞或干细胞在生物材料所制备、与所需修复的组织或器官具有相同构形的支架上进行体外培养扩增、而后再植入体内的病损部位、使之繁衍、从而最终达到修复重建组织或器官、恢复功能的目的。由于通过组织工程再造的组织和器官不但可以同人工替代物一样进行大批量的生产，而且可同天然的组织和器官一样具有功能、还可防止免疫排斥的产生，因此可以完全解决如今在组织和器官的修复重建临床上所采用的自体移植、异体移植、异种移植和人工器官等方法所存在的免疫排斥、供源不足，和功能不全等问题，被认为是最有望彻底解决组织和器官修复和治疗难题的途径。
组织工程的核心是构建由细胞与细胞支架结合而成的复合体，因此细胞、细胞支架，以及组织和器官的形成和再生是组织工程的三大要素。其中细胞支架的功能是为细胞的增殖、繁衍提供三维空间、提供营养、进行气体交换、排除废物，并且决定新生组织、器官的形状和大小。所以细胞支架必须保证能让细胞很好地贴附、生长和繁衍，因此细胞支架必须具有良好的细胞亲和性；为保证细胞能在整个支架的各部分都得到繁衍生长、可以很好地进行气体交换和排除废物，细胞支架必须具有一定的孔径和互相沟通的三维孔结构；为了保证新生的组织和器官具有与需再生的组织和器官有同相同形状大小，细胞支架还必须具有一定的几何形状；更为重要的是为保证细胞支架能随着细胞的生长而逐渐消失、从而不影响细胞的繁衍，细胞支架还必须具备与细胞繁衍速度相匹配的生物降解速度、能在体内的生理环境下逐渐降解、由大分子变成小分子，以至最终被机体代谢或吸收。从临床应用出发，对于如关节软骨、肌腱、周围神经、脊髓等具有取向结构的组织，则不但要求细胞支架能满足以上的各种性能要求，而且还要求细胞支架具有列管式取向结构，可使细胞能按照支架的取向结构繁衍和生长，以形成与天然组织结构相似的取向组织。因此具有列管式取向结构的细胞支架对于组织工程化关节软骨、肌腱、周围神经、脊髓等具有取向结构的组织重建和再生具有特别重要的意义。
制备具有一定孔结构细胞支架的技术很多，包括溶液浇铸和制孔剂成型技术、相分离技术、气体制孔技术、乳液冻结干燥技术、快速成型技术、纤维编织技术，以及多种方法联合应用的技术等(王身国，中国康复理论和实践，2002，8(5)：267-269)。通过以上的技术可以制备用不同材质制备的、孔径从几微米到几百微米，呈单一孔结构或多种孔结构，具有纤维状、棒状、板状、膜状、管状等不同形状、不同厚度，不同大小的各种细胞支架，也可制备用一种或几种材料制备、呈一种或多种孔结构的复合结构细胞支架，以供多细胞组织工程细胞培养的需要。但是用这些技术却无法制成呈列管式取向结构的细胞支架，特别是不能制成既具有管状的一级孔、又具有管壁的微小孔(二级孔)可使管管间相通的列管式取向结构细胞支架。
发明内容
本发明目的在于提供一种列管式取向排列结构细胞支架。
本发明的又一目的在于提供上述细胞支架的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的列管式取向排列结构细胞支架，具有管状的列管式取向排列的一级孔，其管壁具有二级孔，一级孔和一级孔之间由二级孔使之相互连通，一级孔的孔径为40-300微米，二级孔的孔径为0.01-3微米。本发明的细胞支架可应用于组织工程化关节软骨、肌腱、周围神经、脊髓等方面。
本发明提供的制备上述细胞支架的方法，是采用温度梯度引导溶液热致相分离的技术，利用溶剂的结晶、而后在减压下升华来形成孔结构；其中利用在温度梯度的推动下大量的第一溶剂自下而上地结晶生长形成取向的列管结构；利用冷冻速度的快慢和冷冻温度的高低来形成不同粗细的管径；利用添加第二溶剂来形成管壁的二级微孔。
具体地说，本发明提供的制备方法，其主要步骤是：
a)取一塑料直筒，垂直放置在相同直径的金属棒上；
b用第一溶剂溶解生物可降解材料，配制成重量比为1-10％的溶液；
c)步骤b的溶液中加入第二溶剂，其加入量为第一溶剂重量的0.01-5.0％，搅拌均匀后静止10-12小时；
d)将骤c的溶液倒入塑料直筒；
e)冷却金属棒下端，并逐渐降温，降温速度为0.01-2.5℃/分钟，降温范围为+37至-196℃，使生物可降解材料溶液中的溶剂结晶固化；
f)将步骤e的固化物取出，于-40至-50℃干燥48-72小时，使溶剂升华。
本发明中，制备列管式取向结构细胞支架的塑料筒由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯，或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。其下端的金属棒为银棒、不锈钢棒、钛合金棒，或铝棒。金属棒的长度可为5-25厘米。
本发明中，用作列管式取向结构的细胞支架的生物降解高分子材料成分为合成脂肪族聚酯类生物降解高分子材料，它们是聚L-丙交酯(PLLA)、聚DL-丙交酯(PDLLA)、共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)(PLLA-co-PDLLA)、共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物(PGLC)、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)，以及聚β-羟丁酯(PHB)、聚β-羟戊酯(PHV)和聚羟基酸(PHA)；或以上两种合成脂肪族聚酯类生物降解高分子的共混物；合成脂肪族聚酯的分子量为40000-300000，共混物的重量比为95∶5-50∶50。
本发明中，用作列管式取向结构细胞支架的生物可降解材料成分也可为天然生物降解高分子材料，它们是壳聚糖、明胶、胶原蛋白、海藻酸钠，或以上两种天然生物降解高分子的共混物，共混物的重量比为95∶5-50∶50。
本发明中，用作列管式取向结构细胞支架的生物可降解材料成分中也可包含第三组分，如生长因子那样的生物可降解活性物质成分，其中所述的生长因子是神经生长因子(NGF)、成纤细胞生长因子(FGF)、上皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、骨衍生性生长因子(BDGF)中的一种或几种共混物。生长因子与生物降解高分子材料的重量比为0.0001-0.01∶1。
本发明中，用作列管式取向结构细胞支架材料的第三组分还可包括或如磷酸三钙、羟基磷灰石那样的生物可降解无机物质成分。无机物质与生物降解高分子材料的重量比为0.01-0.30∶1。
本发明中，根据所用的生物可降解材料的性质，用于配制溶液以形成管状孔(一级孔)的主要溶剂，即第一溶剂为有机溶剂：如苯、二氧六环、四氢呋喃、丙酮；以及水剂，如蒸馏水、浓度为0.5-15.0％(重量)的酸溶液。
本发明中，添加于第一溶剂中用于使在管壁形成微孔(二级孔)的第二溶剂为能与第一溶剂共溶的溶剂，如水、丙酮、苯、四氢呋喃、氯仿。第二溶剂的用量为第一溶剂的0.01-5.0％(重量)。
本发明中，采用的降温速度为0.01-2.5℃/分钟，降温范围为+37至-196℃。
附图说明
图1为本发明的细胞支架示意图。
具体实施方式
如附图1所示，本发明的细胞支架中一级管状孔(a)呈列管式取向排列，其孔径在40-300微米范围，支架的管壁具有二级孔(b)，其孔径在50纳米-3微米范围。一级孔和一级孔之间由二级孔使之相互连通，所以实际上形成的细胞支架上各孔之间均是相互连通的。
实施例1：取分子量为40000的0.5克聚L-丙交酯(PLLA)用二氧六环配成1％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从28℃起以0.2℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到0℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为280±20微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例2：取分子量为60000的1.5克聚DL-丙交酯(PDLLA)用四氢呋喃配成3％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从26℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为150±20微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例3：取分子量为50000的2.5克共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)(PLLA-co-PDLLA)用丙酮配成5％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从29℃起以0.8℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-80℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为100±10微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例4：取分子量为100000的3.5克聚DL-丙交酯(PDLLA)用二氧六环配成7％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从29℃起以2.0℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-196℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为40±5微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例5：取分子量为250000的4.5克聚L-丙交酯(PLLA)用二氧六环配成9％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从26℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为120±15微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例6：取分子量为80000的0.5克共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)用二氧六环配成1％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从24℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为280±20微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例7：取分子量为60000的1.5克共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)用二氧六环配成3％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从19℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为150±20微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例8：取分子量为50000的2.5克聚己内酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)用二氧六环配成5％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从21℃起以0.01℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到0℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为240±20微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例9：取分子量为55000的3.5克聚己内酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)用二氧六环配成7％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从20℃起以1.5℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-80℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为80±10微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例10：取分子量为40000的1.5克PLGA和分子量为80000的聚DL-丙交酯(PDLLA)3.0克用二氧六环配成9％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从24℃起以2.5℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-196℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为40±5微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例11：取0.5克聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物(PGLC)用苯配成1％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从24℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为120±15微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例12：取1.5克聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物(PGLC)用苯配成3％(重量)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从24℃起以0.6℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为300±10微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例13：2.5克壳聚糖用1.0％醋酸水溶液配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从28℃起以1.5℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-80℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为80±10微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例14：用蒸馏水配置成明胶水溶液，其余条件同实施例13，得到一级孔径为70±10微米的列管式取向结构细胞支架。
实施例15：取1.5克PLLA，用二氧六环/氯仿＝95/5(重量比)的混合溶剂配置成3％(质量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从25℃起以0.2℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到0℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为150±20微米、列管壁有孔径为0.01-1微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
实施例16：取2.5克PLLA，用四氢呋喃/苯＝95/5(重量比)的混合溶剂配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从25℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为120±15微米、列管壁有孔径为0.1-2微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
实施例17：取0.5克PLGA，用丙酮/四氢呋喃＝95/5(重量比)的混合溶剂配置成3％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从25℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为120±20微米、列管壁有孔径为0.1-2.5微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
实施例18：取5克PLGA和0.05微克成纤细胞生长因子(FGF)，用二氧六环/水＝98.5/1.5(重量比)的混合溶剂配置成3％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从37℃起以0.4℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-20℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为110±2微米、列管壁有孔径为0.05-1.5微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
实施例19：取5克PLGA和1.0克粒径小于10微米的磷酸三钙粉末，用二氧六环/丙酮＝99/1(重量比)的混合溶剂配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从28℃起以0.8℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到-80℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为100±20微、列管壁有孔径为0.01-0.5微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
实施例20：取2.25克PLGA和0.25克粒径小于10微米的羟基磷灰石粉末，用二氧六环/四氢呋喃＝99.99/0.01(重量比)的混合溶剂配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的装置的塑料直筒中。将溶液从26℃起以0.2℃/分钟的降温速度对装置下端的金属棒进行冷却，直到0℃为止使结晶生长完全。然后冷冻干燥48小时使溶剂完全脱除，得到一级孔径为120±15微米、列管壁有孔径为0.01-0.5微米二级孔的列管式取向结构细胞支架。
Claims (10)
1、一种列管式取向排列结构细胞支架，由下述制备方法得到：
a)取一塑料直筒，垂直放置在相同直径的金属棒上；
b)用第一溶剂溶解生物可降解材料，配制成重量比为1％-10％的溶液；
c)在步骤b的溶液中加入第二溶剂，其加入量为第一溶剂重量的0.01％-5.0％，搅拌均匀后静止10-12小时；
d)将步骤c的溶液倒入塑料直筒；
e)冷却金属棒下端，并逐渐降温，降温速度为0.01-2.5℃/分钟，降温范围为+37至-196℃，使生物可降解材料溶液中的溶剂结晶固化；
f)将步骤e的固化物取出，于-40至-50℃干燥48-72小时，使溶剂升华；
所述的生物可降解材料为：
分子量40000-300000的合成脂肪族聚酯类生物降解材料中的一种或两种共混物；或
天然生物可降解材料中的一种或两种共混物；
所述合成脂肪族聚酯类生物可降解材料是：聚L-丙交酯、聚DL-丙交酯、共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)、共聚(丙交酯/乙交酯)、聚己内酯、聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物、聚己内酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物、聚β-羟丁酯、聚β-羟戊酯、聚羟基酸；
所述天然生物可降解材料是：壳聚糖、明胶、胶原蛋白、海藻酸钠；
所述共混物的重量比为95∶5-50∶50；
所述的第一溶剂为苯、二氧六环、四氢呋喃、丙酮或水；
所述的第二溶剂是能与第一溶剂共溶的溶剂。
2、权利要求1的列管式取向排列结构细胞支架，具有管状的列管式取向排列的一级孔，列管壁上具有二级孔，一级孔和一级孔之间由二级孔使之相互连通，一级孔的孔径为40-300微米，二级孔的孔径为0.01-3微米。
3、制备权利要求1或2细胞支架的方法，主要步骤是：
a)取一塑料直筒，垂直放置在相同直径的金属棒上；
b)用第一溶剂溶解生物可降解材料，配制成重量比为1％-10％的溶液；
c)在步骤b的溶液中加入第二溶剂，其加入量为第一溶剂重量的0.01％-5.0％，搅拌均匀后静止10-12小时；
d)将步骤c的溶液倒入塑料直筒；
e)冷却金属棒下端，并逐渐降温，降温速度为0.01-2.5℃/分钟，降温范围为+37至-196℃，使生物可降解材料溶液中的溶剂结晶固化；
f)将步骤e的固化物取出，于-40至-50℃干燥48-72小时，使溶剂升华；
所述的生物可降解材料为：
分子量40000-300000的合成脂肪族聚酯类生物降解材料中的一种或两种共混物；或
天然生物可降解材料中的一种或两种共混物；
所述合成脂肪族聚酯类生物可降解材料是：聚L-丙交酯、聚DL-丙交酯、共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)、共聚(丙交酯/乙交酯)、聚己内酯、聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物、聚己内酯/聚醚嵌段共聚物、聚己内酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物、聚β-羟丁酯、聚β-羟戊酯、聚羟基酸；
所述天然生物可降解材料是：壳聚糖、明胶、胶原蛋白、海藻酸钠；
所述共混物的重量比为95∶5-50∶50；
所述的第一溶剂为苯、二氧六环、四氢呋喃、丙酮或水；
所述的第二溶剂是能与第一溶剂共溶的溶剂。
4、权利要求3的制备方法，其特征在于，所述塑料筒由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。
5、权利要求3的制备方法，其特征在于，所述金属棒为银棒、不锈钢棒、钛合金棒，或铝棒，金属棒的长度为5-25厘米。
6.权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤b中的生物可降解材料中加入有生长因子，生长因子与生物可降解材料的重量比为0.0001-0.01∶1。
7、权利要求6的制备方法，其特征在于，所述的生长因子是：神经生长因子、成纤细胞生长因子、上皮生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、骨衍生性生长因子中的一种。
8、权利要求3的制备方法，其特征在于，步骤b中的生物可降解材料中加入有生物可降解无机物质，无机物质与生物可降解材料的重量比为0.01-0.30∶1。
9、权利要求8的制备方法，其特征在于，所述无机物质是磷酸三钙或羟基磷灰石。
10、权利要求3的制备方法，其特征在于，所述的第二溶剂是水、丙酮、苯、四氢呋喃或氯仿。
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