WO2013013537A1 - 一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法 - Google Patents

一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013013537A1
WO2013013537A1 PCT/CN2012/076577 CN2012076577W WO2013013537A1 WO 2013013537 A1 WO2013013537 A1 WO 2013013537A1 CN 2012076577 W CN2012076577 W CN 2012076577W WO 2013013537 A1 WO2013013537 A1 WO 2013013537A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
final concentration
virus
collagen sponge
composite
Prior art date
Application number
PCT/CN2012/076577
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
王珊珊
Original Assignee
Wang Shanshan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wang Shanshan filed Critical Wang Shanshan
Priority to RU2014103549/15A priority Critical patent/RU2584348C2/ru
Priority to US14/235,355 priority patent/US9439999B2/en
Priority to EP12817662.5A priority patent/EP2737910B1/en
Priority to JP2014521915A priority patent/JP5887407B2/ja
Priority to KR1020147004371A priority patent/KR20140034938A/ko
Priority to KR1020167024422A priority patent/KR101717266B1/ko
Publication of WO2013013537A1 publication Critical patent/WO2013013537A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/102—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/21—Acids
    • A61L2300/214—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/23—Carbohydrates
    • A61L2300/232—Monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding

Definitions

  • the invention belongs to the field of biomedical materials, and relates to a composite collagen sponge and a preparation method thereof.
  • the composite collagen sponge is used for hemostasis in human and animal wounds, to promote cell growth and proliferation, and to repair blood vessels and organ tissues.
  • wound healing and post-surgical growth and regeneration of the body are an associated pathological process that involves a range of biochemical, physiological, and morphological changes in the body. Therefore, skin and organ surface defects often occur when the body is injured. In the case where the cells are unlikely to recover, the transfer flap and the graft skin are infected, ulcerated, necrotic, and the like on the body. In general, in order to reduce the incidence of this phenomenon, antibiotic treatment or anti-infective treatment methods such as traditional Chinese medicine and western medicine are usually used, but the survival rate of the wound tissue cells is extremely low, causing muscle defects, scarring, and wound healing. Bad conditions such as long cycle occur, and even reoperation is performed.
  • Collagen is a structural protein that constitutes the extracellular matrix. It is a white, transparent, unbranched fibril composed of various glycoprotein molecules and has a quaternary structure.
  • the monomer of collagen is procollagen, and the procollagen molecule is a slender triple helix chain.
  • the diameter of the procollagen molecule is 1. 5 nm, the length is about 300 nm, and the relative molecular mass is 2.85 X 10 5 .
  • the special amino acid composition makes it It has a stable three-helix space structure, which has hemostasis, low antigenicity, degradability and biocompatibility. It is used to prepare biomedical materials for clinical hemostasis and cell growth.
  • Fibroblast growth factor is a mitogen, chemotactic and regulatory protein of all relevant cells during wound healing, for cells derived from mesoderm and ectoderm (such as epithelial cells, dermal cells, fibroblasts, Vascular endothelial cells, etc.) have a role in promoting repair and regeneration.
  • US2006/023689K US1978/4, 066, 083, US20080268052 and US2010/7, 754, 258 disclose the use of collagen extracted from the Achilles or the skin of an animal for the preparation of a collagen film, but none of them mention inactivation Viral measures, there may be cross-infection of zoonotic pathogenic microorganisms in clinical application, such as Encephalitis B virus (EBV), Hepatitis E virus (HV), pseudorabies virus (Pseudorabies virus PRV), Vesicular stomatitis virus (VSV), Streptococcus, etc. have caused a large number of cross-infectious diseases of humans and animals. Caused a great disaster, so the products prepared by this preparation process have certain safety concealment in clinical application.
  • EBV Encephalitis B virus
  • HV Hepatitis E virus
  • PRV pseudorabies virus
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • Streptococcus etc.
  • CN1228339 and CN1511592 disclose a composite collagen sponge to which a biological factor is added, but in the preparation process, sterilization is carried out by means of radiation irradiation.
  • the temperature of the product will cause the denaturation of the bioactive substance during the irradiation process, which will not only reduce the activity of the bioactive material, but also generate new immunoactive substances, which will cause unnecessary in clinical applications. Trouble.
  • the present invention proposes a composite collagen sponge and a preparation method thereof.
  • the invention includes the following aspects:
  • the present invention provides a composite collagen sponge comprising collagen and a cell growth factor, the composite collagen sponge having a water absorption of more than 52 times.
  • An amino acid, a sugar and an albumin having a weight ratio of from 1 to 11 : 1. 25 to 17. 5 : 1 to 7.5, the amino acid being selected from the group consisting of leucine, isoleucine, glycine, alanine and At least one amino acid in the serine;
  • the sugar is at least one sugar selected from the group consisting of glucose, lactose, sucrose, trehalose, and mannitol.
  • the final concentration of the amino acid is 2. Omg / ml to 22 mg / ml, preferably 2. 5 mg /ml to 15mg / ml; the final concentration of the sugar added to the collagen solution is 2. 5mg / ml to 35mg / ml, preferably 3.0 mg / ml to 15mg / ml; adding human serum albumin in the collagen solution The final concentration is from 2 mg/ml to 15 mg/ml.
  • a composite collagen sponge comprising collagen, a cell growth factor, and the protective agent according to any one of the above 3 to 5.
  • the present invention further provides a method for preparing a composite collagen sponge according to any one of the above 1 to 6, wherein the step of purifying collagen comprises a step of purifying using ion exchange chromatography, wherein the ion exchange chromatography is CM52.
  • the molar concentration of sodium acetate is 0. 2mol / L to 0. 8mol / L, the concentration of sodium acetate is 0.
  • the concentration of sodium chloride is 0. 2mol / L to 0. 8mol / L, the concentration of sodium acetate is 0 .lmol/L 0
  • step of inactivating the virus comprises the step of inactivating the virus in two steps:
  • the first step of inactivating the virus is the process of inactivating the virus by the organic solvent/detergent
  • the second step of inactivating the virus is to treat the complex collagen sponge solution in a water bath at 90 ° C to 100 ° C for 30 minutes to 120 minutes.
  • the concentration of the collagen is controlled at 30 mg/ml to the final concentration of the polysorbate 80 is 1%, and the final concentration of the tributyl phosphate is 0.3%; 70mg/ml, pH 6. 0 to 8.
  • the final concentration of the amino acid constituting the protective agent is 2.0 mg/ml to 22 mg/ml; the final concentration of the sugar is 2. 5 mg/ml to 35 mg/ml, and the final concentration of albumin is 2 mg/ml to 15 mg/ ml; in a preferred case, the protective agent further comprises glycerol, glycerol is added in the collagen solution in a final concentration of 1. Omg / ml to 15mg / ml.
  • the composite collagen sponge of the invention can promote capillary regeneration, improve local blood circulation, accelerate wound healing, and can be used for burn wounds (including shallow degree, deep II degree, granulation wound), chronic wounds (including chronic ulcers, etc.) ) and fresh wounds (including trauma, donor site wounds, surgical injuries, etc.).
  • the composite collagen sponge product of the invention can maintain the stability of the biological active substance during long-term preservation, has high water absorption, high elastic modulus and excellent softness, and has superior effects in clinical application.
  • Figure 1 is an electropherogram of collagen of the present invention.
  • a in Figure 1 represents the standard relative molecular mass Marker; b represents the collagen standard; c represents the collagen sample of the present invention.
  • Figure 2 shows a comparison of the water absorption of the sample of the present invention and the control sample.
  • Figure 3 shows a comparison of the elastic modulus of the sample of the present invention and a control sample.
  • the collagen in the present invention can be made from fresh mammalian connective tissue or pig skin.
  • the collagen is type I collagen extracted from pig skin, and is purified by a combination of salting out and chromatographic purification in the extraction process, and the obtained collagen has high purity.
  • Non-immunogenic, and the water absorption and elastic modulus are greatly improved; the two-step virus inactivation of the extracted collagen reduces the risk of pathogenic microbial contamination of the obtained collagen sponge, and reduces The effect on the biologically active substance; in addition, the obtained composite collagen sponge product has high stability by adding an effective protective agent.
  • the composite collagen sponge provided by the invention is based on collagen, wherein a growth factor is uniformly distributed, for example, basic fibroblast growth factor (FGF), and the composite collagen sponge per square centimeter contains FFU of 200U to 1500Uo.
  • FGF basic fibroblast growth factor
  • the composite collagen sponge prepared by the present invention can be made to have a length of 2. 5 cm to 10 cm and a width of 2. 5 cm to
  • the collagen sponge provided by the invention also has the following characteristics: collagen purity is greater than 99. 0%; water absorption is greater than 52 times; ash is less than 1. 0%.
  • the collagen sponge provided by the invention has an elastic modulus of more than 70. ON/cm, and the pore diameter is generally 50 um to 100 um, which can continuously release FGF in 0 to 100 hours (h) to improve the therapeutic effect on the wound.
  • the step S/D inactivates the virus: a virus inactivating agent such as an organic solvent/detergent (Solvent/Detergent) is added to the extracted collagen solution to inactivate the lipid enveloped virus. Specifically, the aqueous solution containing polysorbate 80 and tributyl phosphate is slowly added to the collagen solution under continuous stirring at 50 rpm to 200 rpm, and the mixture is uniformly stirred to obtain a final concentration of polysorbate 80 of 1%. The final concentration of butyl ester was 0.3%, and the virus was inactivated at 24 ° C to 26 ° C for 6 h to 8 h.
  • a virus inactivating agent such as an organic solvent/detergent (Solvent/Detergent)
  • Epidemic encephalitis virus and pseudorabies virus are used as indicator viruses.
  • the indicated virus inactivation can be greater than 41 ogs, which meets the safety requirements.
  • the second step of inactivating the virus The product is inactivated at 90 ° C to 100 ° C for 30 min to 120 min.
  • the product is packaged in aluminum plastic and placed in a water bath sterilizer for 90 ° C to 100 °. C, 30min to 120min water bath treatment.
  • the water bath sterilization method instead of the radiation irradiation to inactivate the virus, the effect of effectively inactivating the DNA and RNA non-lipid envelope virus can be achieved.
  • inactivation conditions at 90 ° C to 100 ° C, 30 min to 120 min have an effect on the biological activity of collagen and growth factors.
  • the present invention adds a protective agent to the collagen solution, and the protective agent contains an amino acid, a sugar and an albumin.
  • the protective agent contains an amino acid, a sugar and an albumin.
  • an appropriate amount of glycerin may be added to the protective agent.
  • the amino acid or amino acid salt used in the protective agent is one or two amino acid or amino acid salts selected from the group consisting of leucine, isoleucine, glycine, alanine and serine.
  • the final concentration of the amino acid or amino acid salt added to the collagen solution is generally from 2. 0 mg/ml to 22 mg/ml, preferably from 2. 5 mg/ml to 15 mg/ml.
  • the sugar used in the protective agent is at least one sugar selected from the group consisting of glucose, lactose, sucrose, trehalose, and mannitol.
  • the final concentration of sugar added to the collagen solution is generally from 2. 5 mg/ml to 35 mg/ml, preferably from 3. 0 mg/ml to 15 mg/ml.
  • the final concentration of glycerin added to the collagen solution is generally from 1. Omg/ml to 15 mg/ml.
  • the albumin used in the protective agent is preferably human serum albumin.
  • the final concentration of human serum albumin added to the collagen solution is 2 mg/ml or more, and the upper limit is 15 mg/ml.
  • the collagen in the present invention is extracted from animal skin, and if the product is used in clinical practice, type I collagen extracted from pig skin is preferably used.
  • the content of collagen is generally 30 mg/ml or more, and the concentration of fibroblast growth factor is generally 400 U/ml to 3000 U/ml.
  • S/D methods for inactivating viruses are generally applicable to blood products. It is a common method to inactivate lipid-coated viruses by adding an organic solvent/detergent (Solvent/Detergent) to blood products, and the organic solvent/detergent used is polysorbate 80 and tributyl phosphate.
  • organic solvent/detergent Solvent/Detergent
  • polysorbate 80 and tributyl phosphate have certain side effects, so it is necessary to control the residual dose of the two in the subsequent collagen purification process, so that the residual amount of polysorbate 80 is less than 100 ug/ml, tributyl phosphate. The residual amount is less than 10 ug/ml.
  • polysorbate 80 and tributyl phosphate can be effectively removed by two salting out and chromatographic purification processes, so that the residual amount of polysorbate 80 is less than 10 ug/ml, and the residual amount of tributyl phosphate is less than 2 ug/ml. .
  • the antigenicity of collagen is mainly derived from the non-helical region of the chain end of the collagen molecule, namely the C-terminal peptide and the N-terminal peptide.
  • the non-helical region of the molecular chain end is decomposed by pepsin, and then the high-purity collagen is obtained by extracting and purifying the terminal peptide to prepare a collagen sponge. 5 ⁇ /L, maintaining at 0 ° C to 4 ° C, maintaining a concentration of 2. Omol / L to 3. 5mol / L, preferably a concentration of 2. 0mol / L to 2. 5mol / L, maintained at 0 ° C to 4 ° C 4 hours (h) to 12h.
  • the gradient is eluted with a pH of 3.5 to 4.5, a concentration of 0.2 mol/L to 0.8 mol/L of an aqueous solution of sodium chloride, preferably using a concentration of sodium chloride. for 0. 2mol / L, 0. 1 ⁇ 2ol / L, 0. 6mol / L 0. lmol / L pH4.5 aqueous solution of sodium acetate gradient elution.
  • the collagen of the present invention has a complete triple helix structure, and the intact biological activity is maintained by SDS-PAGE electrophoresis, and the purity of the collagen is determined to be 96% (W/W) or more, or even more than 99.0%. The problem of immunogenic reaction caused by low-purity collagen extracted by traditional purification methods is avoided.
  • the preparation steps of the composite collagen sponge of the present invention are as follows:
  • Step 1 Select the raw materials and degreasing treatment:
  • Step 2 smashing process: Weigh the pig skin treated in step 1, cut into strips by a wire cutter, and then cut into a block of 0. 2 to 0. 5 cm 2 by a low-temperature pulverizer, poured into a stainless steel container, The solution was immersed in a 75% ethanol solution for 20 minutes, and washed repeatedly with purified water for 10 times, and then repeatedly washed 5 times with the cooled water for injection, and drained.
  • Step 3 Enzymatic hydrolysis process: Add the water for injection to the pig skin material treated in step 2 at a weight ratio of 1:5 to 30 by adding 0 ° C to 4 ° C (for example, the ratio of pig skin to water is 1 kg : 10 kg), and mix. , the acetic acid is driven into the colloid mill, the colloid mill is started in the cooling cycle system, the temperature is controlled at 0 ° C to 4 ° C, homogenate; the homogenate is transferred to the enzymatic hydrolysis tank, slowly adding 1.0 M acetic acid The aqueous solution is adjusted to a pH of 2.5 to 3.5, preferably 2.
  • pepsin is added (5 kg to 10 g of pepsin is added according to 1 kg of step 2), and the enzymatic temperature is controlled between 10 ° C and 20 ° C. Enzymatic hydrolysis for 20h to 24h, at which time the enzymatic hydrolyzate becomes a viscous, uniform gelatinous fluid;
  • Step 4 Inactivate pepsin: Slowly add 20% by weight aqueous sodium hydroxide solution to the hydrolysate treated in step 3, adjust the pH to 9.0, and maintain at 0 °C to 4 °C for 10 h. The pH was then adjusted to 6.5 with 1.0 M aqueous acetic acid.
  • Step 5 Filtration: Add water for injection to the hydrolysate treated in step 4 (digestion solution and water for injection are diluted at a ratio of 1:1 to 10 by weight), and mix to make the collagen concentration 30 mg/ml. To 70 mg/ml, preferably 30 mg/ml, coarsely filter with a filter element having a pore size of 40 ⁇ m, and then finely filter to a dedicated tank for inactivating virus with a pore size of 1. ⁇ filter.
  • Step 6 S/D inactivated virus process: slowly add the aqueous solution containing polysorbate 80 and tributyl phosphate to the solution treated in step 5 while continuously stirring at 50 rpm to 200 rpm, and stir evenly to make polysorbate. The final concentration of 80 is 1% by weight, and the final concentration of tributyl phosphate is 0.3% by weight, and the virus is inactivated at 24 ° C to 26 ° C for 6 h to 8 h, preferably 6 h.
  • Step 9 CM52 cation exchange chromatography purification process: Prepare a preparative column (10 X 100CM,) containing CM52 cation exchange resin with 0. lmol / L pH4.5 sodium acetate buffer solution to balance 10 bed volume, then on 5 ⁇ /L pH4. 5 The aqueous sodium acetate solution was eluted in 5 bed volumes, and then eluted with 0.1 mol/L sodium chloride in 0.1 mol/L of pH 4.5 aqueous sodium acetate solution, and the protein eluate was collected when peaking began. Then, it was eluted with 0.5 mol/L sodium chloride 0.1 mol/L pH 4.5 aqueous sodium acetate solution for 5 bed volumes, and the detection wavelength was 215 nm.
  • Step 10 Ultrafiltration step: The collected collagen eluate is subjected to ultrafiltration (Mi ll ipore ) with a pore size of 10 kD and a membrane area of 4 M 2 , and concentrated and desalted, first concentrated to the original volume. 1/3, make up 2/3 of the water for injection, concentrate to 1/3 of the original volume, make up 2/3 of the water for injection, and then concentrate to 1/3 of the original volume. During the concentration process, the inlet pressure of the ultrafilter is Less than 0. 15Mpa, collect collagen retentate.
  • Step 11 Preparation procedure: Adjustment step 10
  • the concentration of the collagen solution obtained is 40 mg/ml to 70 mg/ml, and 1000 ml of the composite collagen sponge solution is prepared according to the formulation shown in Table 1.
  • Step 12 Filtering and sterilizing: The prepared solution was sequentially filtered with a filter material of polyethersulfone, a pore size of 0. 45 ⁇ m and a 22 ⁇ filter (PALL).
  • Step 13 lyophilization process: the solution treated in step 12 is added into a stainless steel mold, the mold size is 15 cm ⁇ 5 cm, and the liquid is 37 ml, and then placed in a lyophilizer for freeze-drying, and the moisture in the solution is removed by a low-temperature freeze-drying method. First, freeze at -40 ° C for 4 h, then vacuum dry, control the vacuum does not exceed 20 Pa, control the product temperature rise rate, increase the product temperature to 20 ° C within 15 h, and maintain at 25 ° C for 4 h.
  • Step 14 Second inactivated virus process: The lyophilized product is packaged in aluminum plastic packaging with an aluminum plastic packaging machine, and then placed in a water bath sterilizing cabinet to perform a water bath to inactivate the virus. Inactivate the virus and store the product in the dark at 2 °C to 8 °C.
  • Embodiment 1 Embodiment 2 Embodiment 3 Step 1
  • Pig skin (kg) 0.5 1.5 2.5 Sodium carbonate aqueous solution concentration (% by weight) 10% 25% 30% Weight ratio of pig skin to sodium carbonate aqueous solution 1:1 1:5 1:10 time (minutes) 20 40 60 Step 3
  • the concentration of the gradient eluted sodium chloride solution is 0.4, 0.4,
  • Collagen (mg) 40000 50000 70000 Fibroblast factor (U) 3000000 1000000 400000 Glycerin (mg) 1500 10000 15000 Sugar dosage (mg) 3000 10000 15000 Amino acid dosage (mg) 2500 10000 15000
  • the amino acid used in the protective agent of Example 1 is glycine, and the sugar is sucrose;
  • the amino acid used in the protective agent of Example 2 is leucine and isoleucine in a weight ratio of 1:1, and the sugar is glucose in a weight ratio of 1:2.
  • the amino acid used in the protective agent of Example 3 is alanine and serine in a weight ratio of 1:1, and the sugar is lactose and mannitol in a weight ratio of 1:2.
  • Example 1 Residual epidemic encephalitis virus titer (LgTCID 5 / 0.1 ml) Example 1
  • Example 2 Example 3 Control sample 6.063 6.313 6.063 Post-treatment sample 0.500 0.500 0.500 Virus reduction 5.563 5.813 5.563 Result: Example 1 The amount of virus reduction is 5.563LgTCID 50 /0. lml
  • Example 2 The amount of virus reduction in Example 2 was 5.813 Lg TCID 50 /0. lml
  • Example 3 The virus reduction amount of Example 3 was 5.563 Lg TCID 50 /0. lml Enzymatic hydrolysate S/D treatment inactivated pseudorabies virus results
  • Residual pseudorabies virus titer (LgTCID 5 ./0. 1ml )
  • Example 1 Example 2 Example 3 Control sample 5. 563 5. 313 4. 875 Sample after treatment 0. 500 0. 500 0. 500 Virus reduction 5. 063 4. 813 4. 375 Result: Example 1 ⁇ 55 .063LgTCID 50 /0. lml
  • the verification results showed that the collagen solution after S/D treatment indicated that the virus inactivation amount was greater than 41 ogs, which met the safety requirements. That is, the final concentration of polysorbate 80 is 1%, and the final concentration of tributyl phosphate is 0, under the condition that the protein concentration is controlled from 30 mg/ml to 70 mg/ml and the pH is from 6.5 to 7.5. 3%, inactivated virus at 24 ° C to 26 ° C for 6 h to 8 h is effective.
  • Example 1 Example 2 Example 3 Control sample 5. 438 5. 688 5. 563 Sample after treatment 0. 500 0. 500 0. 500 Virus reduction 4. 938 5. 188 5. 063 Result: Example 1 ⁇ 54 . 938LgTCID 50 /0. lml
  • Residual pseudorabies virus titer (LgTCID 5 ./0. lml )
  • Example 1 Example 2 Example 3 Control sample 5. 063 5. 563 5. 688 Sample after treatment 0. 500 0. 500 0. 500 Virus reduction 4. 563 5. 063 5. 188 Result: Example 1 ⁇ 54 . 563LgTCID 50 /0. lml
  • Example 1 Example 2 Example 3 Control sample 5. 313 5. 250 5. 625 Sample after treatment 0. 500 0. 500 0. 500 Virus reduction 4. 813 4. 750 5. 125 Result: Example 1 ⁇ >4. 813LgTCID 50 /0. lml
  • Collagen was chromatographed and sampled for collagen purity testing. Prepare the same mass concentration of collagen reference substance, chromatographically purify the sample, without chromatographically purifying the sample, mix with the sample treatment solution, heat in a boiling water bath for 5 min, concentrate the gel to 5%, and separate the gel for 10% for electrophoresis. Blue R250 staining, 7.5% acetic acid and 5% methanol decolorization. The loading is 10ul.
  • Type I collagen control was purchased from Sigma. Collagen was chromatographed and analyzed by electrophoresis. It showed that the band was consistent with the reference substance. It is a typical type I collagen, and there are no other bands, indicating that the extracted sample has high purity.
  • the electropherogram is shown in Figure 1.
  • a represents a standard relative molecular mass Marker
  • b represents a collagen standard
  • c represents a collagen sample obtained in Example 2 of the present invention.
  • the total protein was detected by Kjeldahl method, and then the hydroxyproline content in the hydrolyzate was determined by Woessener method.
  • the collagen content was calculated according to the formula M ⁇ Mc/14%, and the collagen purity was calculated by comparison with the total protein.
  • the content of collagen in Example 2 of the present invention is not lower than the content of the reference substance, indicating that the purity is high. The results are shown in Table 7.
  • the blue complex was formed by reacting polyethoxylated and ammonium cobalt thiocyanate in polysorbate 80, soluble in dichloromethane, and polysorbate 80 was measured at 620 nm by colorimetry.
  • Polysorbate 80 Control CASRestryNumber: 9005-65-6 (USP Pharmacopoeia Standard).
  • the residual amount of tributyl phosphate in the test sample was determined by gas chromatography.
  • the tributyl phosphate reference substance is CASRestryNumber: 126-73-8 (European EP Pharmacopoeia standard), chromatograph: Shimadzu GC-14C, acid-modified polyethylene glycol capillary column, flame ionization detector, injection The amount is 0. lul.
  • the results show that after purification by chromatography, polysorbate 80 and tributyl phosphate are in the product. The residual amount is very low and meets safety requirements.
  • the test results are shown in Table 8 c
  • Example 1 The same procedure as in Example 1 was carried out except that the composition of the composite collagen sponge was as shown in Table 9, and Samples 4, 5 and 6 were obtained.
  • Fibroblast growth factor was detected by cell proliferation/MTT colorimetry.
  • the cells were NIH3T3.
  • Fibroblast growth factor stimulated the growth of NIH3T3 cells.
  • the growth of NIH3T3 cells was due to fibroblast growth.
  • Factor biological activity varies, in order to detect fibroblast growth factor activity.
  • FGF standards were purchased from the China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.
  • NIH3T3 cells were purchased from the Cell Culture Bank of the Chinese Academy of Sciences. The test results are shown in Table 10 and Table 11.
  • a collagen sponge was prepared in the same manner as in Example 1, except that the amount of fibroblast growth factor added was different, and samples 7 and 8, and the long-term stability test of sample 4 were obtained, and the results showed that amino acid and white were added to the formulation. Proteins, sugars and glycerol act as protective agents to effectively ensure the biological activity of the product during its lifetime.
  • composition Sample 4 Sample 5 Sample 6 Collagen 35. Omg/ ml 30. Omg/ml 32. Omg/ml
  • the Y axis is the water absorption amount (mass/mass);
  • the control 1 is the water absorption standard of the absorbent gelatin sponge in the US Pharmacopoeia (USP32-NF27);
  • the control 2 is prepared according to the Chinese Patent CN101279104 Example 1.
  • Control 3 is a collagen sponge prepared according to the example of Chinese patent CN1915437. It can be seen from Fig. 2 that the water absorption of the composite collagen sponge of the present invention is more than 52 times, and the collagen sponge prepared by the prior art and the existing collagen sponge cannot achieve the water absorption amount of the present invention.
  • the Y axis is the modulus of elasticity (N/cm); and the control 4 is a collagen sponge prepared according to the method disclosed in CN1487967A.
  • the sample of the present invention has an elastic modulus of more than 70.0 N/cm, and the collagen sponge prepared by the prior art is less than 50.0 N/cm.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法，该复合胶原蛋白海绵含有胶原蛋白、细胞生长因子和保护剂，其吸水量大于52倍，制备方法中包括阳离子色谱纯化步骤、以及有机溶剂/去污剂灭活病毒和干热灭活病毒二步灭活步骤。通过本发明方法获得的复合胶原蛋白海绵不仅提高了产品临床应用的安全系数和性能，也保证了产品的稳定性和在有效期内的生物活性。

Description

一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料领域， 涉及一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法。所述复 合胶原蛋白海绵用于人体和动物体创面止血， 促进细胞生长增殖， 以及血管和器官组 织修复。
m
在医学领域中， 创伤修复和临床手术后肌体的生长和再生是一个相关联的病理生 理过程， 它包括肌体一系列生化、 生理和形态的变化。 因此肌体受伤时， 常常出现皮 肤和器官表面缺损。 在细胞不可能恢复的情况下， 在肌体上显现出转移皮瓣和移植皮 片感染、 溃烂、 坏死等状况。 一般临床上为了降低这种现象发生的几率， 通常采用注 射抗生素或外部采用中药、 西药等抗感染处理方法， 但创伤面肌体组织细胞的存活率 极低， 造成肌肉缺损， 产生疤痕， 伤口的愈合周期长等不良情况发生， 甚至进行再手 术等特点。
为了避免伤口不良情况发生及减少再手术率这一技术难题， 自八十年代以来有关 利用生长因子对肌体创伤和医疗手术后肌体组织修复作用进行了大量的研究和临床应 用， 使肌体组织修复的内涵已从单纯体表愈合发展到细胞组织的修复过程， 通过生长 因子人工干预创面的自然愈合， 促进或恢复了组织细胞成活的效果。
胶原蛋白是构成细胞外基质的结构蛋白， 是由多种糖蛋白分子构成的白色、 透明、 无分支的原纤维， 具有四级结构。 胶原蛋白的单体是原胶原， 原胶原分子为细长三股 螺旋链， 电镜下测得直径为 1. 5nm， 长约 300nm， 相对分子质量为 2. 85 X 105， 特殊的 氨基酸组成使其具有稳定的三螺旋空间结构， 它具有止血作用、 低抗原性、 可降解性 和生物相容性， 被用于制备生物医学材料， 用于临床止血和促进细胞生长。
成纤维细胞生长因子 （FGF) 是伤口愈合过程中所有相关细胞的促有丝分裂原、 化 学趋化及调节蛋白， 对来源于中胚层和外胚层的细胞 （如上皮细胞、 真皮细胞、 成纤 维细胞、 血管内皮细胞等） 具有促进修复和再生作用。
US2006/023689K US1978/4, 066, 083、 US20080268052和 US2010/7, 754, 258 公开 了采用动物的跟腱或皮中提取的胶原蛋白用于制备胶原蛋白膜的方法， 但都没有提及 灭活病毒的措施， 在临床应用过程中势必存在人畜共患病原微生物交叉感染的可能， 例如乙型脑炎病毒 (Encephal itis B virus EBV)、 戊型肝炎病毒 (Hepatitis E virus HEV)>伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus PRV)、水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus VSV), 链球菌（Streptococcus )等都曾引起大范围的人畜交叉感染疾病的发生， 造成很大的灾害， 所以采用这种制备工艺制备的产品在临床应用中存在一定的安全隐 串、
CN1228339和 CN1511592公开了一种加入生物因子的复合胶原蛋白海绵，但在制备 过程中， 采用了射线辐照的方式进行灭菌处理。 对于生物活性材料来说， 在照射过程 中会引起制品温度升高导致生物活性物质变性， 不但使生物活性材料的活性降低， 而 且会产生新的免疫活性物质， 这在临床应用中会产生不必要的麻烦。
另外， 产品在长期保存过程中活性也会降低， 影响临床应用效果和效期。 但在上 述这些专利中都没有明确采取对加入生物活性物质稳定性的保护措施和考察， 也没有 对灭活病毒效果进行确认。
发明内容
为解决上述技术问题， 本发明提出了一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法。 具体 来说， 本发明包括以下方面：
1、 本发明提供一种复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵含有胶原蛋白和细胞 生长因子， 该复合胶原蛋白海绵的吸水量大于 52倍。
2、 如上述 1 所述的复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵具有大于 70. 0N/cm 的弹性模量。
3、 如上述 2所述的复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵还含有保护剂， 相对 于复合胶原蛋白海绵， 所述保护剂的含量为 10重量 %至 50重量％， 所述的保护剂含有 重量比为 1至 11 : 1. 25至 17. 5 : 1至 7. 5的氨基酸、 糖和白蛋白， 所述氨基酸为选自亮 氨酸、 异亮氨酸、 甘氨酸、 丙氨酸和丝氨酸中的至少一种氨基酸； 所述糖为选自葡萄 糖、 乳糖、 蔗糖、 海藻糖和甘露醇中的至少一种糖。
4、 如上述 3所述的复合胶原蛋白海绵， 其中所述的保护剂以如下方式添加： 在胶 原蛋白溶液中添加氨基酸的终浓度为 2. Omg/ml至 22mg/ml，优选 2. 5 mg/ml至 15mg/ml ; 在胶原蛋白溶液中添加糖的终浓度为 2. 5mg/ml至 35mg/ml，优选 3. 0 mg/ml至 15mg/ml ; 在胶原蛋白溶液中添加人血清白蛋白的终浓度为 2mg/ml至 15mg/ml。
5、 如上述 4所述的复合胶原蛋白海绵， 其中所述的保护剂还含有甘油， 在胶原蛋 白溶液中添加甘油的终浓度为 1. 0mg/ml至 15mg/ml。 因此， 当所述的复合胶原蛋白海 绵含有甘油时， 其与保护剂中的糖的重量比为 0. 5至 7. 5 : 1. 25至 17. 5。
6、 一种复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵含有胶原蛋白、 细胞生长因子和 上述 3至 5任意一项所述的保护剂。 7、 本发明还提供上述 1至 6任意一项所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 该方 法中的胶原蛋白的提纯步骤包括使用离子交换色谱进行纯化的工序， 所述离子交换色 谱为 CM52阳离子交换树脂的制备色谱；洗脱液为含氯化钠和乙酸钠的 pH4. 5的水溶液， 其中氯化钠的浓度为 0. 2mol/L至 0. 8mol/L, 乙酸钠的浓度为 0. lmol/L0
8、 如上述 7所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 该方法中的灭活病毒的步骤包 括二步灭活病毒的过程：
第一步灭活病毒的过程是有机溶剂 /去污剂的灭活病毒的过程；
第二步灭活病毒的过程是在 90°C至 100°C水浴处理复合胶原蛋白海绵溶液 30分钟 至 120分钟。
9、 如上述 8所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 其中所述有机溶剂 /去污剂为 聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的混合物， 所述聚山梨酯 80和磷酸三丁酯在胶原蛋白溶液 中的添加量为使聚山梨酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%; 优选的情 况是， 在控制胶原蛋白的浓度在 30 mg/ml至 70mg/ml， pH值为 6. 0至 8. 0的条件下， 向胶原蛋白溶液中缓慢加入含聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的混合灭菌水溶液， 使聚山梨 酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%， 并在 24°C至 26°C灭活病毒 6小时 至 8小时。
10、 如上述 6至 9任意一项所述复合胶原蛋白海绵的制备方法， 其中在保护剂的 存在下， 实施所述第二步灭活病毒的过程， 向胶原蛋白溶液中添加保护剂的量为使组 成保护剂的氨基酸的终浓度为 2. 0 mg/ml 至 22mg/ml ; 糖的终浓度为 2. 5 mg/ml 至 35mg/ml , 白蛋白的终浓度为 2mg/ml至 15mg/ml ; 在优选的情况下， 所述的保护剂还含 有甘油， 在胶原蛋白溶液中添加甘油的终浓度为 1. Omg/ml至 15mg/ml。
本发明的复合胶原蛋白海绵能促进毛细血管再生， 改善局部血液循环， 加速创面 的愈合， 可用于烧伤创面 （包括浅 Π度、 深 II度、 肉芽创面）、 慢性创面 （包括体表慢 性溃疡等） 和新鲜创面 （包括外伤、 供皮区创面、 手术伤等）。 本发明的复合胶原蛋白 海绵产品在长期保存过程能保持生物活性物质的稳定性， 具有高吸水力和高弹性模量 以及优异的柔软性， 在临床应用中产生了优越的效果。
附图说明
图 1为本发明的胶原蛋白的电泳图谱。图 1 中的 a表示标准相对分子质量 Marker; b表示胶原蛋白标准品； c表示本发明的胶原蛋白样品。
图 2显示的是本发明的样本与对照样本的吸水量的比较。
图 3显示的是本发明的样本与对照样本的弹性模量的比较。 本发明中的胶原蛋白可以新鲜的哺乳动物结缔组织或猪皮为原料。 在本发明的一 个具体实施方案中， 所述胶原蛋白为从猪皮提取的 I型胶原蛋白， 在提取过程中， 采 用盐析和色谱纯化相结合的方式进行提纯， 得到的胶原蛋白纯度高， 无免疫原性， 且 吸水力和弹性模量有了极大的提高； 对提取获得的胶原蛋白进行二步病毒灭活， 降低 了所获得的胶原蛋白海绵的病源微生物污染的风险， 并降低了对生物活性物质的影响； 另外， 通过加入有效保护剂， 使获得的复合胶原蛋白海绵产品具有高的稳定性。
本发明提供的复合胶原蛋白海绵是以胶原蛋白为基质， 其中均匀分布有生长因子， 例如， 碱性成纤维细胞生长因子 （FGF)， 每平方厘米复合胶原蛋白海绵含 FGF为 200U 至 1500Uo
由本发明制备的复合胶原蛋白海绵可制成长度为 2. 5cm至 10cm， 宽度为 2. 5cm至
5. 0cm, 厚度为 0. 3cm至 2. 0cm的产品。
本发明提供的胶原蛋白海绵还具有如下的特点： 胶原蛋白纯度大于 99. 0%; 吸水量 大于 52倍； 灰分小于 1. 0%。
本发明提供的胶原蛋白海绵的弹性模量为大于 70. ON/cm, 形成的孔径一般为 50um 至 100um， 它可以在 0至 100小时 （h) 内连续释放 FGF,提高对创伤的治疗效果。
为减少胶原蛋白海绵产品携带病毒的风险， 确保制品安全， 除加强对原料的筛选 和控制外， 在本发明的胶原蛋白海绵的制备方法中还采用了以下二步灭活病毒的过程： 第一步 S/D灭活病毒的过程： 向提取获得的胶原蛋白溶液中加入病毒灭活剂， 例 如有机溶剂 /去污剂 （Solvent/Detergent ), 灭活脂包膜病毒。 具体方法是在 50rpm至 200rpm连续搅拌的状态下，向胶原蛋白溶液中缓慢加入含聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的 水溶液， 搅拌均匀， 使聚山梨酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%， 并 在 24°C至 26 °C病毒灭活 6h至 8h。
采用流行性乙性脑炎病毒和伪狂犬病毒作指示病毒， 通过上述方法可以使指示病 毒灭活量大于 41ogs， 符合安全性要求。
在上述灭活病毒的方法中， 胶原蛋白浓度过高会影响灭活病毒效果， 因此， 一般 情况下是将胶原蛋白的浓度控制在 30 mg/ml至 70mg/ml， pH值为 6. 0至 8. 0的条件下 进行上述 S/D灭活病毒的过程。
第二步灭活病毒的过程： 将产品在 90°C至 100°C、灭活 30min至 120min,例如将产 品进行铝塑包装， 并放入水浴灭菌柜中， 进行 90°C至 100°C、 30min至 120min水浴处 理。 用该水浴灭菌的方法替代射线辐照的方式进行灭活病毒的处理， 可以达到有效地 灭活 DNA和 RNA非脂包膜病毒的效果。 在第二步的灭活病毒过程中， 于 90°C至 100°C、 30min至 120min的灭活条件会对 胶原蛋白和生长因子的生物活性产生影响。 为解决这种问题， 本发明在第二步的灭活 病毒过程中， 在胶原蛋白的溶液中加入了保护剂， 该保护剂含有氨基酸、 糖和白蛋白。 为使获得的复合胶原蛋白海绵更松软， 弹性力更大,还可在所述保护剂中加入适量的甘 油。
在所述保护剂中使用的氨基酸或氨基酸盐为选自亮氨酸、 异亮氨酸、 甘氨酸、 丙 氨酸和丝氨酸中的一种或两种氨基酸或氨基酸盐。 在胶原蛋白溶液中添加氨基酸或氨 基酸盐的终浓度一般为 2. 0 mg/ml至 22mg/ml , 优选 2. 5 mg/ml至 15mg/ml。
在所述保护剂中使用的糖为选自葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 海藻糖和甘露醇中的至少 一种糖。 在胶原蛋白溶液中添加糖的终浓度一般为 2. 5 mg/ml 至 35mg/ml， 优选 3. 0 mg/ml至 15mg/ml。
在所述保护剂含有甘油的情况下， 在胶原蛋白溶液中添加甘油的终浓度一般为 1. Omg/ml至 15mg/ml。
如果产品应用于临床时， 在所述保护剂中使用的白蛋白最好为人血清白蛋白。 在 胶原蛋白溶液中添加人血清白蛋白的终浓度为 2mg/ml或大于 2mg/ml，上限为 15mg/ml。
本发明中的胶原蛋白是从动物皮中提取的， 如果产品应用于临床时， 最好采用从 猪皮中提取的 I型胶原蛋白。 在配制的复合胶原蛋白海绵的溶液中， 胶原蛋白的含量 一般为 30mg/ml以上， 成纤维细胞生长因子的浓度一般为 400 U/ml至 3000U/ml。
S/D 灭活病毒的方法一般适用于血液制品。 在血液制品中加入有机溶剂 /去污剂 ( Solvent/Detergent ) 的办法灭活脂包膜病毒是常用的方法， 所使用的有机溶剂 /去 污剂为聚山梨酯 80和磷酸三丁酯。 但聚山梨酯 80和磷酸三丁酯具有一定副作用， 所 以需要在后续的胶原蛋白纯化过程中， 对二者的残留剂量进行控制， 使聚山梨酯 80残 留量小于 100ug/ml， 磷酸三丁酯残留量小于 10ug/ml。
在本发明中，通过两次盐析以及色谱纯化过程能有效地去除聚山梨酯 80和磷酸三 丁酯， 使聚山梨酯 80残留量小于 10ug/ml， 磷酸三丁酯残留量小于 2ug/ml。
胶原蛋白的抗原性主要来自胶原蛋白分子链端的非螺旋区域， 即 C末端肽和 N末 端肽。 本发明是通过胃蛋白酶分解掉分子链端的非螺旋区域， 然后通过提取纯化去除 端肽获得高纯度的胶原蛋白用于制备胶原蛋白海绵。 进行盐析纯化时， 使用的氯化钠 水溶液浓度为 2. Omol/L至 3. 5mol/L,优选浓度为 2. 0mol/L至 2. 5mol/L, 在 0°C至 4°C 维持 4小时（h)至 12h。 用 CM52 阳离子交换层析纯化时， 用 pH=3. 5至 4. 5、 浓度为 0. 2mol/L 至 0. 8mol/L 的氯化钠水溶液进行梯度洗脱， 优选采用含氯化钠浓度为 0. 2mol/L、 0. ½ol/L、 0. 6mol/L的 0. lmol/L pH4. 5的乙酸钠水溶液进行梯度洗脱。 经 SDS-PAGE 电泳检测， 本发明的胶原蛋白具有完整的三螺旋结构， 保持了完整的生物活 性， 并且经检测计算胶原蛋白的纯度达到 96% (W/W) 以上， 甚至 99. 0%以上， 避免了 采用传统纯化方法提取的低纯度胶原蛋白而引起的免疫原性反应问题。
冻干产品时， 先采用 -40°C至 -45°C进行冷冻 3 h至 5h， 再抽真空干燥， 控制真空 度不超过 20Pa， 控制产品温度上升速率， 在 10h至 15h内使产品温度上升到 20°C， 并 在 20°C至 25°C维持 2h至 5h， 控制经冻干的产品的水分在 5%以内， 以保证生物因子的 活性。
具体来说， 本发明的复合胶原蛋白海绵的制备步骤如下：
步骤 1 选取原料和脱脂处理：
取检疫检验合格的新鲜哺乳动物结缔组织或猪皮为原料， 进行处理,其工艺如下： 将猪皮用刀去掉猪毛和内侧的油脂， 称取处理后的猪皮放入不锈钢容器中， 按猪皮原 料与 10%至 35% (W/W) (优选 25%) 的碳酸钠水溶液 1 : 1至 10的重量比（优选 1 : 5)， 加入碳酸钠水溶液， 浸泡 20min至 60min (优选 20min)， 每 5分钟搅拌一次； 浸泡后 捞出，用纯化水冲洗 10次； 沥净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质。
步骤 2 粉碎工序： 称取步骤 1处理过的猪皮， 用切丝机切成条状， 然后用低温粉 碎机切成 0. 2至 0. 5 cm 2的块状， 倒入不锈钢容器中， 加入 75%乙醇溶液浸泡 20min捞 出， 用纯化水反复冲洗 10次， 再用冷却后的注射用水反复冲洗 5次， 沥干。
步骤 3 酶解工序： 按 1 : 5至 30的重量比例向步骤 2处理过的猪皮原料加入 0°C至 4°C注射用水 （例如猪皮与水的比例为 1kg : 10kg) ， 混匀， 用蠕动泵打入胶体磨中， 胶 体磨提前启动冷却循环系统， 温度控制在 0°C至 4°C， 匀浆； 将匀浆液转入酶解罐中， 缓慢滴加 1. 0M的醋酸水溶液， 调 pH值到 2. 5至 3. 5， 优选 2. 5； 加入胃蛋白酶（按 1kg 步骤 2原料加入 5g至 10g胃蛋白酶）， 酶解温度控制在 10°C至 20°C之间， 酶解 20h至 24h， 此时酶解液成粘稠、 均匀的胶状流体；
步骤 4 灭活胃蛋白酶：向步骤 3处理的酶解液中缓慢加入重量比为 20%的氢氧化钠 水溶液， 调整 PH值为 9. 0， 在 0°C至 4°C维持 10h。 然后用 1. 0M的醋酸水溶液调整 pH 值到 6. 5。
步骤 5 过滤： 向步骤 4处理的酶解液中加入注射用水 （酶解液与注射用水按重量 比为 1 : 1至 10的比例进行稀释） ， 混匀， 使胶原蛋白浓度为 30 mg/ml至 70mg/ml， 优选 30mg/ml， 用孔径为 40μιιι的滤芯进行粗滤， 再用孔径为 1. Ομιιι滤芯进行精滤至灭 活病毒专用罐中。 步骤 6 S/D灭活病毒工序： 在 50 rpm至 200rpm连续搅拌的状态下， 向步骤 5处 理的溶液中缓慢加入含聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的水溶液， 搅拌均匀， 使聚山梨酯 80的终浓度为 1% (重量百分比），磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3% (重量百分比），在 24°C 至 26°C病毒灭活 6h至 8h， 优选 6h。
步骤 7 盐析工序： 向经步骤 6处理的溶液中加入氯化钠， 同时用搅拌器搅拌， 转 速为 100 rpm至 500rpm，使氯化钠的终浓度为 2. 0 mol/L至 2. 5mol/L，优选为 2. 5mol/L, 在 0°C至 4°C维持 4h。用连续流冷冻离心机 14000rpm至 16000rpm、0°C至 4°C离心 60min 至 30min， 弃去上清； 以沉淀物： 0. 3M醋酸水溶液的重量比 =1 : 10至 15， 取沉淀物加 入 0. 3M 的醋酸水溶液， 搅匀， 使沉淀溶解完全， 加入氯化钠， 使氯化钠的终浓度为 2. 05mol/L至 2. 5mol/L， 优选为 2. 5mol/L， 离心， 获取胶原蛋白沉淀。
步骤 8 脱盐工序： 按照胶原蛋白沉淀与 95%冷乙醇重量比 =1 : 3至 8， 向步骤 7中 得到的胶原蛋白沉淀中加入 95%的冷乙醇，搅拌均匀， 8000rpm、 0°C至 4°C离心 30min， 弃去上清， 收集沉淀物， 重复一次。 按照胶原蛋白沉淀物： 乙酸钠溶液的重量比 =1 : 8至 20， 向胶原蛋白沉淀物加入 0. lmol/L pH4. 5的乙酸钠溶液，搅拌均匀， 用滤芯孔 径为 0. 45um滤器过滤， 转入 CM阳离子色谱纯化工序。
步骤 9 CM52阳离子交换色谱纯化工序： 将装有 CM52阳离子交换树脂的制备色谱 柱 （10 X 100CM，） 用 0. lmol/L pH4. 5的乙酸钠缓冲液平衡处理 10个柱床体积， 然后 上样， 上样速度为 20. 0 ml/min至 30. 0ml/min， 优选为 23. 0ml/min， 再分别用含氯化 钠浓度为 0. 2mol/L 的 0. lmol/L pH4. 5 的乙酸钠水溶液洗脱 5 个柱床体积， 再用含 0. 4mol/L氯化钠的 0. lmol/L pH4. 5的乙酸钠水溶液洗脱， 当开始出峰时收集蛋白洗脱 液， 然后用 0. 6mol/L氯化钠的 0. lmol/L pH4. 5的乙酸钠水溶液进行洗脱 5个柱床体 积， 检测波长为 215nm。
步骤 10 超滤工序： 将收集的胶原蛋白洗脱液用孔径为 10kD、 膜面积为 4M2的切向 流超滤器超滤 （Mi l l ipore ) ， 进行浓缩脱盐处理， 先浓缩到原体积的 1/3， 补足 2/3 的注射用水， 再浓缩到原体积的 1/3，补足 2/3的注射用水，然后浓缩到原体积的 1/3， 在浓缩过程中超滤器进口压力为小于 0. 15Mpa,收集胶原蛋白截留液。
步骤 11 配制工序： 调整步骤 10 得到的胶原蛋白溶液的浓度为 40 mg/ml 至 70mg/ml , 按照表 1所示的配方配制 1000毫升的复合胶原蛋白海绵溶液。
步骤 12 过滤除菌工序：将配制好的溶液依次用安装材质为聚醚砜，孔径为 0. 45μιιι 和 0. 22μιιι滤芯 （PALL) 的滤器过滤。 步骤 13冻干工序:将步骤 12处理的溶液加入不锈钢模具中，模具规格 15cmX5cm， 分装液体为 37ml， 然后放入冻干机中进行冷冻干燥， 通过低温冷冻干燥方法将溶液中 的水分去除， 先采用 -40°C进行冷冻 4h， 再抽真空干燥， 控制真空度不超过 20Pa， 控 制制品温度上升速率， 在 15h内使制品温度上升到 20°C， 并在 25°C维持 4h。
步骤 14、 二次灭活病毒工序： 将冻干后的产品用铝塑包装机进行铝塑包装， 然后 放入水浴灭菌柜中进行水浴灭活病毒。 灭活病毒完成， 将产品在 2 °C至 8 °C条件下避光 存放， 备用。
实施例 1-3
按照如下表 1所列的条件实施上述复合胶原蛋白海绵的制备步骤， 获得样本 1-3。 表 1
实施例 1 实施例 2 实施例 3 步骤 1
猪皮 （千克） 0.5 1.5 2.5 碳酸钠水溶液浓度 （重量％) 10% 25% 30% 猪皮与碳酸钠水溶液的重量比 1:1 1:5 1:10 时间 （分钟） 20 40 60 步骤 3
猪皮与注射用水的重量比 1:5 1:10 1:30 用醋酸调节 PH值到 2.5 3.0 3.5 胃蛋白酶添加量 1:0.005 1:0.008 1:0.01 酶解温度' C 10 15 20 酶解时间 （小时） 24 22 20 步骤 5
酶解液与注射用水的重量比 1:10 1:5 1： 1 胶原蛋白浓度 40 45 60 步骤 6
加入 11%的聚山梨酯 80至终浓度为 1% 1% 1%
3.3%的磷酸三丁酯的水溶液至终浓度为 0.3% 0.3% 0.3% 灭活病毒温度 °c 24 25 26 灭活病毒时间 （小时） 6 7 8 步骤 7
加入氯化钠至终浓度为 2.0 2.0 2.5 离心速度 14000 15000 16000 离心时间 60 50 30 沉淀物与 0.3M醋酸水溶液的重量比 1:10 1:12 1:15 步骤 8 胶原蛋白沉淀与 95%乙醇的重量比为 1:3 1:5 1: 8 胶原蛋白沉淀物与 0. lmol/L乙酸钠溶液的重
1:8 1:10 1:20 量比 上样速度 ml/min 20.0 23.0 30.0
0.2、 0.2、
0.2、 0.4、
梯度淋洗的氯化钠溶液的浓度 0.4、 0.4、
0.6
0.6 0.6 梯度淋洗的氯化钠溶液的 PH值 4.5 4.5 4.5 步骤 11 配制 1000ml溶液加入各组分的量
胶原蛋白 （mg) 40000 50000 70000 成纤维细胞因子 （U) 3000000 1000000 400000 甘油 （mg) 1500 10000 15000 糖用量 (mg) 3000 10000 15000 氨基酸用量 （mg) 2500 10000 15000
20%w/v人血白蛋白用量 ml 10 40 75 步骤 14
温度' C 100 95 90 时间 min 30 60 120 获得样本 样本 1 样本 2 样本 3 胶原蛋白纯度 （％) 99.0 99.4 99.6 吸水量 （倍） 55 60 58 弹性模量 (N/cm) 75 80 78
实施例 1 的保护剂使用的氨基酸为甘氨酸， 糖为蔗糖； 实施例 2的保护剂使用的 氨基酸为重量比 1:1的亮氨酸和异亮氨酸， 糖为重量比 1:2的葡萄糖和海藻糖； 实施 例 3的保护剂使用的氨基酸为重量比 1:1的丙氨酸和丝氨酸， 糖为重量比 1:2的乳糖 和甘露醇。
5、 检测结果
(1) S/D灭活病毒效果验证
对 S/D灭活病毒效果进行验证。 采用流行性乙性脑炎病毒和伪狂犬病毒作为指示 病毒； 培养细胞为 BHK21细胞， 采用 96孔细胞病变法， 按照 Karber法计算。 结果见 表 2和表 3
表 2 酶解液 S/D处理灭活流行性乙性脑炎病毒结果
残余流行性乙性脑炎病毒滴度 （LgTCID5。/0.1ml) 实施例 1 实施例 2 实施例 3 对照样本 6.063 6.313 6.063 处理后样本 0.500 0.500 0.500 病毒降低量 5.563 5.813 5.563 结果： 实施例 1的病毒降低量 5.563LgTCID50/0. lml
实施例 2的病毒降低量 5.813LgTCID50/0. lml
实施例 3的病毒降低量 5.563LgTCID50/0. lml 酶解液 S/D处理灭活伪狂犬病毒结果
残余伪狂犬病毒滴度 （LgTCID5。/0. 1ml )
实施例 1 实施例 2 实施例 3 对照样本 5. 563 5. 313 4. 875 处理后样本 0. 500 0. 500 0. 500 病毒降低量 5. 063 4. 813 4. 375 结果： 实施例 1 Ξ55. 063LgTCID50/0. lml
实施例 2Ξ≥4. 813LgTCID50/0. lml
实施例 3Ξ≥4. 375LgTCID50/0. lml
验证结果表明胶原蛋白溶液经 S/D处理后， 指示病毒灭活量大于 41ogs， 符合安全 要求。 即在蛋白浓度控制在 30 mg/ml至 70mg/ml， pH值为 6. 5至 7. 5的条件下， 使聚 山梨酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%， 在 24°C至 26°C灭活病毒 6h 至 8h是有效的。
(2) 水浴灭活病毒后， 取样进行灭活效果验证。 采用流行性乙性脑炎病毒、 伪狂 犬病毒和猪细小病毒作为指示病毒； 培养细胞为 BHK21细胞， 采用 96孔细胞病变法， 计算按照 Karber法， 结果见表 4、 表 5、 表 6。
表 4 水浴灭活流行性乙性脑炎病毒结果
残余流行性乙性脑炎病毒滴度 （LgTCID5。/0. lml )
实施例 1 实施例 2 实施例 3 对照样本 5. 438 5. 688 5. 563 处理后样本 0. 500 0. 500 0. 500 病毒降低量 4. 938 5. 188 5. 063 结果： 实施例 1 Ξ54. 938LgTCID50/0. lml
实施例 2Ξ≥5. 188LgTCID50/0. lml
实施例 3Ξ≥5. 063LgTCID50/0. lml
表 5 水浴灭活伪狂犬病毒结果
残余伪狂犬病毒滴度 （LgTCID5。/0. lml )
实施例 1 实施例 2 实施例 3 对照样本 5. 063 5. 563 5. 688 处理后样本 0. 500 0. 500 0. 500 病毒降低量 4. 563 5. 063 5. 188 结果： 实施例 1 Ξ54. 563LgTCID50/0. lml
实施例 2Ξ≥5. 063LgTCID50/0. lml
实施例 3Ξ≥5. 188gTCID50/0. lml
水浴灭活猪细小病毒结果 残余猪细小病毒滴度 （LgTCID5。/0. 1ml )
实施例 1 实施例 2 实施例 3 对照样本 5. 313 5. 250 5. 625 处理后样本 0. 500 0. 500 0. 500 病毒降低量 4. 813 4. 750 5. 125 结果： 实施例 1 Ξ≥>4. 813LgTCID50/0. lml
实施例 2 〉4. 750LgTCID50/0. lml
实施例 3 Ξ≥5. 125gTCID50/0. lml
验证结果表明样品经水浴灭活处理，指示病毒灭活量大于 41ogs，符合安全性要求。 ( 3 ) 胶原蛋白纯度检测
胶原蛋白经色谱纯化后取样进行胶原蛋白纯度检测。 配制相同质量浓度的胶原蛋 白对照品， 色谱纯化样品， 未经色谱纯化样品， 与样品处理液混合， 在沸水浴中加热 5min, 浓缩胶为 5%， 分离胶为 10%进行电泳， 采用考马斯亮蓝 R250染色， 7.5%醋酸 和 5%甲醇脱色。 上样量为 10ul。 I型胶原蛋白对照品购于 Sigma公司。 胶原蛋白经 过色谱纯化处理后经过电泳分析表明与对照品相比谱带一致， 是典型的 I型胶原蛋白， 且无其他杂带， 说明提取的样品纯度高。 电泳图谱见图 1。 图 1 中的 a表示标准相对 分子质量 Marker; b表示胶原蛋白标准品； c表示本发明实施例 2获得的胶原蛋白样品。
( 4) 胶原蛋白含量检测
采用凯氏定氮法检测总蛋白， 然后采用 Woessener法测定水解液中羟脯氨酸含量， 按照公式 M^Mc/14%计算出胶原蛋白含量， 再与总蛋白比较计算胶原蛋白纯度。 本发明 实施例 2的胶原蛋白的含量不低于对照品的含量， 说明纯度很高。 结果见表 7。
表 7 胶原蛋白含量检测结果
色谱纯化前 色谱纯化后 对照品
胶原蛋白 91. 5% (m/m) 99. 4% (m/m) 99. 0% (m/m)
( 5 ) 聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的残留量
在色谱纯化后取样对聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的残留量进行检测， 确认去除效果 的有效性。
依据聚山梨酯 80 中的聚乙氧基 （Polyethoxylated) 和铵钴硫氰酸盐反应形成蓝 色复合物， 可溶于二氯甲烷， 用比色法在 620nm处测定聚山梨酯 80。 聚山梨酯 80对照 品 CASRestryNumber: 9005-65-6 (美国 USP药典标准）。使用气相色谱测定法测定供试 品中的磷酸三丁酯残留量。 磷酸三丁酯对照品为 CASRestryNumber: 126-73-8 (欧洲 EP药典标准品）， 色谱仪： 岛津 GC-14C ， 用酸改性聚乙二醇毛细管柱， 火焰离子化检 测器， 进样量为 0. lul。 结果表明经过色谱纯化后聚山梨酯 80和磷酸三丁酯在产品中 的残留量很低， 符合安全要求。 检测结果见表 8 c
表 8 色谱纯化后聚山梨酯 80和磷酸
组 成 聚山梨酯 80 (ug/ml) 磷酸三丁酯 (ug/ml) 实施例 1 5 未检出
实施例 2 6 未检出
实施例 3 3 未检出
( 6 ) 水浴灭活前后 FGF活性变化
采用与实施例 1相同的方法， 只是复合胶原蛋白海绵的组成如表 9所示， 获得样 本 4、 5禾口 6。
采用细胞增殖法 /MTT 比色法对成纤维细胞生长因子 （FGF) 进行检测， 细胞为 NIH3T3, 成纤维细胞生长因子对 NIH3T3细胞的生长具有剌激作用， NIH3T3细胞的生长 状况因成纤维细胞生长因子生物活性不同而不同， 以此来检测成纤维细胞生长因子活 性。 FGF标准品购于中国药品生物制品鉴定所， NIH3T3 细胞购于中国科学院典型培养 物委员会细胞库。 检测结果见表 10、 表 11。
检测结果表明： Co60照射 10kG对 FGF的活性损害比较大， Co60照射 10kG同 100 °C、 30min比， 数据经 SPSS软件处理 P<0. 01 具有可比性。
采用与实施例 1 相同的方法制备胶原蛋白海绵， 只是成纤维细胞生长因子的添加 量不同， 获得样本 7、 8， 并和样本 4进行长期稳定性考察试验， 结果表明在配方中加 入氨基酸、 白蛋白、 糖和甘油作为保护剂可有效地保证产品在有效期内的生物活性。
表 9 复合胶原蛋白海绵的组成
组 成 样本 4 样本 5 样本 6 胶原蛋白 35. Omg/ ml 30. Omg/ml 32. Omg/ml
FGF 3000U/ml 3000U/ml 3000U/ml 甘油 1. 5mg/ml 1. 5mg/ml 1. 5mg/ml 蔗糖 3. Omg/ml 3. Omg/ ml 3. Omg/ml 甘氨酸 2. 5mg/ml 2. 5mg/ml
人血白蛋白 2. Omg/ml 表 10 FGF活性检测结果
样本 4 样本 5 样本 6 灭活前 灭活后 灭活前 灭活后 灭活前 灭活后
Co60照射 10kG 1500U/cm2 1200U/cm2 1450U/cm2 1250U/cm2 1500U/cm2 1280U/cm2
100°C、 30min 1500U/cm2 1460U/cm2 1450U/cm2 1380U/cm2 1500U/cm2 1390U/cm2 表 11 成纤维细胞生长因子长期稳定性检测结果
组 成 1月 6月 12月 24月 收率％ 样本 4 1500U/cm2 1450/cm2 1420/cm2 1390/cm2 92. 67 样本 7 1480U/cm2 1420U/cm2 1380U/cm2 1360U/cm2 91. 89 样本 8 1420U/cm2 1400U/cm2 1350U/cm2 1300U/cm2 91. 54
( 7) 吸水力对比
检测采用实施例 1、 2、 3 获得的样本 1、 2和 3的吸水力并和对照样本比较， 取 海绵一块， 精密称重 （精确到 0. lmg) ， 浸入 20°C的纯化水中， 轻轻揉搓， 不使破损， 待吸足水分， 用小镊子轻轻夹住一角， 提出水面停留 2 分钟后称重， 并与胶原蛋白海 绵质量进行比较。 检测及对比结果如图 2所示。
图 2中， Y轴为水吸收量 （质量 /质量）； 对照 1为 《美国药典》 （USP32-NF27) 中 吸收性明胶胶海绵的吸水量标准； 对照 2为按照中国专利 CN101279104 实施例 1制备 的胶原蛋白海绵； 对照 3为按照中国专利 CN1915437的实施例制备的胶原蛋白海绵。 由图 2可以看出本发明的复合胶原蛋白海绵的吸水量均在 52倍以上， 而由现有技术制 备的胶原蛋白海绵和已有的胶原蛋白海绵无法达到本发明的吸水量。
( 8) 弹性模量对比
将试样两端分别固定在拉力检测仪的夹具上，启动仪器以一定的速度分离并拉伸试 样， 测定试样上的应力变化， 直到试样破坏为止。 检测及对比结果如图 3 所示。 图 3 中 Y轴为弹性模量 （N/cm); 对照 4是按照 CN1487967A公开的方法制备的胶原蛋白 海绵。 由图 3可以看出， 本发明的样本具有大于 70.0N/cm的弹性模量， 而由现有技术 制备的胶原蛋白海绵低于 50.0N/cm。

Claims

权利要求书
1、 一种复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵含有胶原蛋白和细胞生长因子， 该复合胶原蛋白海绵的吸水量大于 52倍。
2、如权利要求 1所述的复合胶原蛋白海绵，该复合胶原蛋白海绵具有大于 70. ON/cm 的弹性模量。
3、 如权利要求 2所述的复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵还含有保护剂， 相对于复合胶原蛋白海绵， 所述保护剂的含量为 10重量 %至 50重量％， 所述的保护剂 含有重量比为 1至 11 : 1. 25至 17. 5 : 1至 7. 5的氨基酸、 糖和白蛋白， 所述氨基酸为选 自亮氨酸、 异亮氨酸、 甘氨酸、 丙氨酸和丝氨酸中的至少一种氨基酸； 所述糖为选自 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 海藻糖和甘露醇中的至少一种糖。
4、 如权利要求 3所述的复合胶原蛋白海绵， 其中所述的保护剂以如下方式添加： 在胶原蛋白溶液中添加氨基酸的终浓度为 2. 0mg/ml 至 22mg/ml， 优选 2. 5 mg/ml 至 15mg/ml ; 在胶原蛋白溶液中添加糖的终浓度为 2. 5mg/ml至 35mg/ml， 优选 3. 0 mg/ml 至 15mg/ml ; 在胶原蛋白溶液中添加人血清白蛋白的终浓度为 2mg/ml至 15mg/ml。
5、 如权利要求 4所述的复合胶原蛋白海绵， 其中所述的保护剂还含有甘油， 在胶 原蛋白溶液中添加甘油的终浓度为 1. Omg/ml至 15mg/ml。
6、 一种复合胶原蛋白海绵， 该复合胶原蛋白海绵含有胶原蛋白、 细胞生长因子、 权利要求 3至 5任意一项所述的保护剂。
7、 权利要求 1至 6任意一项所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 该方法中的胶 原蛋白的提纯步骤包括使用离子交换色谱进行纯化的工序， 所述离子交换色谱为 CM52 阳离子交换树脂的制备色谱； 洗脱液为含氯化钠和乙酸钠的 PH4. 5 的水溶液， 其中氯 化钠的浓度为 0. 2mol/L至 0. 8mol/L, 乙酸钠的浓度为 0. lmol/L 0
8、 如权利要求 6或 7所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 该方法中的灭活病毒 的步骤包括二步灭活病毒的过程：
第一步灭活病毒的过程是有机溶剂 /去污剂的灭活病毒的过程；
第二步灭活病毒的过程是在 90 °C至 100 °C水浴处理复合胶原蛋白海绵溶液 30分钟 至 120分钟。
9、 如权利要求 8所述的复合胶原蛋白海绵的制备方法， 其中所述有机溶剂 /去污 剂为聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的混合物， 所述聚山梨酯 80和磷酸三丁酯在胶原蛋白 溶液中的添加量为使聚山梨酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%; 优选 的情况是， 在控制胶原蛋白的浓度在 30 mg/ml至 70mg/ml， pH值为 6. 0至 8. 0的条件 下， 向胶原蛋白溶液中缓慢加入含聚山梨酯 80和磷酸三丁酯的混合灭菌水溶液， 使聚 山梨酯 80的终浓度为 1%， 磷酸三丁酯的终浓度为 0. 3%， 并在 24°C至 26°C灭活病毒 6 小时至 8小时。
10、 如权利要求 6至 9任意一项所述复合胶原蛋白海绵的制备方法， 其中在保护 剂的存在下， 实施所述第二步灭活病毒的过程， 向胶原蛋白溶液中添加保护剂的量为 使组成保护剂的氨基酸的终浓度为 2. 0 mg/ml至 22mg/ml ; 糖的终浓度为 2. 5 mg/ml至 35mg/ml , 白蛋白的终浓度为 2mg/ml至 15mg/ml ; 在优选的情况下， 所述的保护剂还含 有甘油， 在胶原蛋白溶液中添加甘油的终浓度为 1. Omg/ml至 15mg/ml。
PCT/CN2012/076577 2011-07-28 2012-06-07 一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法 WO2013013537A1 (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014103549/15A RU2584348C2 (ru) 2011-07-28 2012-06-07 Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления
US14/235,355 US9439999B2 (en) 2011-07-28 2012-06-07 Composite collagen sponge and preparation method thereof
EP12817662.5A EP2737910B1 (en) 2011-07-28 2012-06-07 Composite collagen sponge and preparation method thereof
JP2014521915A JP5887407B2 (ja) 2011-07-28 2012-06-07 複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法
KR1020147004371A KR20140034938A (ko) 2011-07-28 2012-06-07 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법
KR1020167024422A KR101717266B1 (ko) 2011-07-28 2012-06-07 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102127130A CN102357259A (zh) 2011-07-28 2011-07-28 一种生物蛋白海绵及其制备方法
CN201110212713.0 2011-07-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013013537A1 true WO2013013537A1 (zh) 2013-01-31

Family

ID=45582674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2012/076577 WO2013013537A1 (zh) 2011-07-28 2012-06-07 一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9439999B2 (zh)
EP (1) EP2737910B1 (zh)
JP (1) JP5887407B2 (zh)
KR (2) KR20140034938A (zh)
CN (1) CN102357259A (zh)
RU (1) RU2584348C2 (zh)
WO (1) WO2013013537A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11604026B2 (en) 2019-03-14 2023-03-14 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization loading tray assembly and system
US11634257B2 (en) 2017-10-09 2023-04-25 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container and method of using same
CN118384313A (zh) * 2024-04-23 2024-07-26 暨南大学 胶原蛋白-可得然胶复合止血凝胶海绵及其制备和应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102357259A (zh) * 2011-07-28 2012-02-22 王珊珊 一种生物蛋白海绵及其制备方法
KR101531479B1 (ko) * 2014-11-21 2015-06-26 세원셀론텍(주) 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
CN105126084A (zh) * 2015-07-29 2015-12-09 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种胶原蛋白组合物及其制备方法
RU2637634C1 (ru) * 2016-10-21 2017-12-05 Владимир Иосифович Лозинский Антибактериальная белковая губка для химиотерапии инфицированных ран и способ ее получения
CN107349463A (zh) * 2017-06-16 2017-11-17 卓阮医疗科技（苏州）有限公司 一种生物源性止血微粒及其制备方法
US11884953B2 (en) 2017-10-11 2024-01-30 Shuang Liu Method for preparing protein peptide based on connective tissue and prepared protein peptide and use thereof
CN107827974B (zh) * 2017-11-10 2021-01-01 中国科学院过程工程研究所 一种人纤维蛋白原的制备方法
CN111084788A (zh) * 2018-10-22 2020-05-01 上海蓝盎电子科技发展有限公司 人工细胞间质
CN109985271B (zh) * 2019-02-26 2021-10-22 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 一种用于难愈合创面修复的复合胶原敷料及其制备方法
CN114099761B (zh) * 2020-08-27 2022-06-21 厦门大学 一种浴海绵止血材料及其制备方法和应用
CN112999096A (zh) * 2021-03-31 2021-06-22 广州源肽生物科技有限公司 一种含活性多肽美容制品冻干海绵及其制备方法
CN114225020B (zh) * 2021-12-31 2023-05-02 暨南大学 一种ova淀粉样蛋白原纤维及其制备方法与应用
CN114632183B (zh) * 2022-03-30 2023-02-03 温州医科大学 一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4066083A (en) 1976-06-03 1978-01-03 Pentapharm A.G. Sterile surgical collagen product
CN1228339A (zh) 1999-02-04 1999-09-15 李校坤 促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用
US6180606B1 (en) * 1994-09-28 2001-01-30 Gensci Orthobiologics, Inc. Compositions with enhanced osteogenic potential, methods for making the same and uses thereof
CN1486748A (zh) * 2003-08-07 2004-04-07 唐宝辉 生物膨胀性止血海绵及其生产工艺
CN1487967A (zh) 2001-01-25 2004-04-07 �ο���ҽҩ���޹�˾ 一种制备胶原海绵的方法和用于萃取部分胶原泡沫的装置以及拉长的胶原海绵
CN1511592A (zh) 2002-12-30 2004-07-14 中国皮革和制鞋工业研究院 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法
US20060236891A1 (en) 2003-02-21 2006-10-26 Trevor Morgan Porcine collagen film
CN1915437A (zh) 2005-08-15 2007-02-21 上海其胜生物制剂有限公司 胶原蛋白海绵的制备工艺
CN101279104A (zh) 2007-04-05 2008-10-08 辽宁绿谷药械有限公司 一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法
US20080268052A1 (en) 2006-09-21 2008-10-30 Voytik-Harbin Sherry L Collagen preparation and method of isolation
CN101612113A (zh) * 2009-06-23 2009-12-30 武汉海特生物制药股份有限公司 一种神经生长因子海绵剂及其制备方法
CN102357259A (zh) * 2011-07-28 2012-02-22 王珊珊 一种生物蛋白海绵及其制备方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5001169A (en) * 1984-10-24 1991-03-19 Collagen Corporation Inductive collagen-based bone repair preparations
JPH01303152A (ja) 1988-06-01 1989-12-07 Katakura Chitsukarin Kk 止血材およびその製造法
DK223389D0 (da) 1989-05-05 1989-05-05 Ferrosan As Saarsvamp
WO1992017209A1 (en) * 1991-04-08 1992-10-15 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Porous solid preparation containing physiologically active protein substance
DE4404625C2 (de) 1994-02-14 1996-10-17 Ludwig Dr Baumgartner Verfahren zur Inaktivierung thermolabiler Viren in biologischem Material unter Beibehaltung der kollagenen Eigenschaften
US6686191B1 (en) * 1995-09-22 2004-02-03 Bayer Healthcare Llc Preparation of virally inactivated intravenously injectable immune serum globulin
DE69724243T2 (de) * 1996-04-04 2004-06-17 Baxter Ag Blutstillender schwamm auf kollagenbasis
US5814328A (en) 1997-01-13 1998-09-29 Gunasekaran; Subramanian Preparation of collagen using papain and a reducing agent
CA2277814A1 (en) 1997-01-16 1998-07-23 Cohesion Corporation Lyophilized collagen-based biomaterials, process of preparation and uses thereof
AT407117B (de) 1997-09-19 2000-12-27 Immuno Ag Fibrinschwamm
JP4334719B2 (ja) 1999-08-27 2009-09-30 学校法人 関西大学 凍結保護物質の調製方法
SE9904237D0 (sv) 1999-11-22 1999-11-22 Ana Mar Diagnostics Ab New compound
GB0216002D0 (en) 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
CN1183941C (zh) * 2002-09-28 2005-01-12 陈武德 一种治疗心脑血管病的中药水丸
WO2005053617A2 (en) * 2003-11-28 2005-06-16 Alternative Sourced Collagen, Llc Compositions and methods comprising collagen
CN101001649B (zh) * 2004-07-09 2011-08-31 弗罗桑医疗设备公司 包括透明质酸的止血组合物及其制备方法
JP2009540936A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ユニバーシティー オブ サウス フロリダ コラーゲン足場、それを伴う医療用埋植物、およびその使用方法
US8088323B2 (en) 2007-02-27 2012-01-03 Ppg Industries Ohio, Inc. Process of electrospinning organic-inorganic fibers
DE102007037056A1 (de) 2007-07-24 2009-01-29 Aesculap Ag Hämostyptikum
CN101486748B (zh) * 2008-01-15 2011-11-02 浙江新和成股份有限公司 一种5，7-双烯胆固醇酯的制备方法
US8900640B2 (en) 2008-04-02 2014-12-02 Hoya Corporation Expandable, porous apatite/collagen composite, and its production method
WO2010062049A2 (ko) * 2008-11-03 2010-06-03 Lee Jae In 형상기억합금을 이용한 동력발생장치

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4066083A (en) 1976-06-03 1978-01-03 Pentapharm A.G. Sterile surgical collagen product
US6180606B1 (en) * 1994-09-28 2001-01-30 Gensci Orthobiologics, Inc. Compositions with enhanced osteogenic potential, methods for making the same and uses thereof
CN1228339A (zh) 1999-02-04 1999-09-15 李校坤 促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用
CN1487967A (zh) 2001-01-25 2004-04-07 �ο���ҽҩ���޹�˾ 一种制备胶原海绵的方法和用于萃取部分胶原泡沫的装置以及拉长的胶原海绵
CN1511592A (zh) 2002-12-30 2004-07-14 中国皮革和制鞋工业研究院 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法
US7754258B2 (en) 2003-02-21 2010-07-13 Devro Plc Porcine collagen film
US20060236891A1 (en) 2003-02-21 2006-10-26 Trevor Morgan Porcine collagen film
CN1486748A (zh) * 2003-08-07 2004-04-07 唐宝辉 生物膨胀性止血海绵及其生产工艺
CN1915437A (zh) 2005-08-15 2007-02-21 上海其胜生物制剂有限公司 胶原蛋白海绵的制备工艺
US20080268052A1 (en) 2006-09-21 2008-10-30 Voytik-Harbin Sherry L Collagen preparation and method of isolation
CN101279104A (zh) 2007-04-05 2008-10-08 辽宁绿谷药械有限公司 一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法
CN101612113A (zh) * 2009-06-23 2009-12-30 武汉海特生物制药股份有限公司 一种神经生长因子海绵剂及其制备方法
CN102357259A (zh) * 2011-07-28 2012-02-22 王珊珊 一种生物蛋白海绵及其制备方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11634257B2 (en) 2017-10-09 2023-04-25 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container and method of using same
US11604026B2 (en) 2019-03-14 2023-03-14 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization loading tray assembly and system
US11609043B2 (en) 2019-03-14 2023-03-21 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container fill fixture, system and method of use
US11609042B2 (en) 2019-03-14 2023-03-21 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Multi-part lyophilization container and method of use
US11740019B2 (en) 2019-03-14 2023-08-29 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization loading tray assembly and system
US11747082B2 (en) 2019-03-14 2023-09-05 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Multi-part lyophilization container and method of use
US11815311B2 (en) 2019-03-14 2023-11-14 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Lyophilization container fill fixture, system and method of use
US11994343B2 (en) 2019-03-14 2024-05-28 Terumo Bct Biotechnologies, Llc Multi-part lyophilization container and method of use
CN118384313A (zh) * 2024-04-23 2024-07-26 暨南大学 胶原蛋白-可得然胶复合止血凝胶海绵及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140034938A (ko) 2014-03-20
EP2737910A1 (en) 2014-06-04
US20140235539A1 (en) 2014-08-21
JP5887407B2 (ja) 2016-03-16
US9439999B2 (en) 2016-09-13
EP2737910A4 (en) 2015-05-27
EP2737910B1 (en) 2018-12-19
JP2014521415A (ja) 2014-08-28
RU2584348C2 (ru) 2016-05-20
CN102357259A (zh) 2012-02-22
RU2014103549A (ru) 2015-09-10
KR101717266B1 (ko) 2017-03-16
KR20160108599A (ko) 2016-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013013537A1 (zh) 一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法
ES2236733T3 (es) Foromulaciones cicatrizantes que contienen fibronectina de plasma humano.
CN107648205B (zh) 一种促进伤口愈合的胶原肽敷料及其制备方法
CN111202868B (zh) 用于制备角蛋白凝胶敷料的组合物及其制备方法和应用
CN105031740A (zh) 一种具有防水透气功能的仿生人工皮肤及其制备方法
CN110559476B (zh) 一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法
CN102258770A (zh) 一种安全高效的冻干纤维蛋白封闭剂及其制备方法
JP4925822B2 (ja) ウイルス不活性化熱処理へ供するための血漿タンパク質の寒冷沈降物を安定化する方法
CN106178092B (zh) 制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法以及通过使用其制备纤维蛋白封闭剂的方法
CN111420023B (zh) 含i型胶原和透明质酸的复合物及制备和用途
KR20180028229A (ko) 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
CN108785656A (zh) 一种降低宫颈癌发病风险的药物制剂及其制备方法
CN104721877B (zh) 一种无菌胶原贴敷料及其制备方法
CN105581964A (zh) 一种活肤美容产品及其制备方法
CN110665060B (zh) 一种骨修复材料及其制备方法和应用
CN104873978A (zh) 一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂
CN100594930C (zh) 以垂体前叶肾上腺皮质提取物为主要成份的组合药物及其制备方法和用途
US20160324728A1 (en) Process for Producing EMD of Increased Stability
CN114303454B (zh) 生物制品dbt的病毒灭活方法
CN104524603A (zh) 可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法
Liu et al. Fabrication and safety evaluation of collagen sponge
JP2002518462A (ja) 保護剤を添加しない二重失活処理による静脈内注射用の免疫グロブリンの調製法。
WO2004108751A1 (fr) Cardiomyopeptidine, son procede de production et son utilisation
JPH03505200A (ja) 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用物質を含む製剤の製造方法
CN105920660B (zh) 用于治疗慢性伤口的组合物及制剂

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12817662

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014521915

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147004371

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014103549

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14235355

Country of ref document: US