JP2002518462A

JP2002518462A - 保護剤を添加しない二重失活処理による静脈内注射用の免疫グロブリンの調製法。

Info

Publication number: JP2002518462A
Application number: JP2000555641A
Authority: JP
Inventors: アイミンチャン; シャオウェンファン; チャオツァオ
Original assignee: チャントゥシーヤンファーマシュティカルファクトリー
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2002-06-25
Also published as: KR20010023277A; EP1033136A1; RU2227747C2; AU756017B2; AU4357699A; CN1137727C; WO1999066955A1; CN1201694A; US6338849B1; EP1033136A4

Abstract

(57)【要約】本発明は生物学的薬剤の調製法に関する。ウイルスに対して、如何なる保護剤をも使用しないで低温失活処理および低pHでのインキュベーション処理を使用して、二重失活処理を行う。ウイルスが効果的に失活処理されるだけでなく、免疫グロブリンの完全性および天然の生物活性を維持すると共に、製品の純度および安全性が保持される。最終製品の形態は、凍結乾燥された粉末ではなく液体である。溶液の浸透圧平衡を保持し、投与後の副作用を回避するために、最終製品に5〜10％のグルコースを添加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、生物製品の調製法、特に、保護剤を使用しない二重失活処理による
IVIG（静脈内注射用の免疫グロブリン）の調製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

IG（免疫グロブリン）の生産は1949年に始まった。1960年代から30種類以上の
IVIGが12ヶ国の29工場で生産され、国際市場に出回り始めた。

【０００３】ヒト胎盤血IVIGは、1985年中国で最初に公表され、その製造および試験の規制
法が「The China National Regulations of Biological Products」に記載され
ている。1992年に、凍結乾燥された低pHのIVIGの試験生産が、「Ministry of th
e Health of P.R. China」によって承認された。

【０００４】しかし、IVIGの大量かつ反復の注射によって流行性Ｃ型肝炎の症例が多数報告
されている。IVIG生産工程においてウイルス失活処理工程無しではその安全性を
確保することが困難であるという多くの証拠が示されている。1990年代から、IV
IG生産の必須の工程としての「ウイルス失活処理」が世界の多くの国々によって
規定されている。

【０００５】低温失活処理は、ウイルス失活処理（すなわち、60℃、10時間の熱失活処理）
を研究するための初期の方法である。

【０００６】 AIDSの急速な蔓延により、HIV（人体免疫欠陥ウイルス）に対し、界面活性剤
を用いてウイルス脂質エンベロープを破壊するエンベロープ破壊法が開発されて
いる。また、低pHインキュベーション、乾熱、照射および濾過などの方法も次々
と開発されている。

【０００７】上記のウイルス失活処理法は、HIV（人体免疫欠陥ウイルス）、HBV（Ｂ−型肝
炎ウイルス）、HCV（Ｃ−型肝炎ウイルス）およびいくつかの共通のウイルス病
理学的因子を失活処理し得るが、これらの方法では異なるウイルスに対して異な
る失活処理能力が現れている。特に、保護剤の存在によりウイルスも保護されて
しまい、製品に微量のウイルスが生き残る。また、エンベロープの破壊法では、
有機溶媒は残留するので、これは製品の純度に影響するだけでなく、静脈内注射
の際に副作用がある。

【０００８】現在、国内外で生産されているIVIG製品は、ほとんど凍結乾燥調製されたもの
であって、サッカロースを保護剤および賦形剤として用いている。

【０００９】最近の文献報告（Murphy P.ら、J-Med-Virol、41、1、61〜64、1993を参照の
こと）では、保護剤の存在がタンパク質の天然の活性を保持する効果を有するが
、ウイルスを確実に保護してしまうと報告されている。同時に、保護剤としての
サッカロースの使用が、いくつかの症例で急性腎機能不全を引き起こすというこ
とが報告されていた。（Winward DBら、Pharmacotherapy、15、6、765〜722、19
95、Hifenhaus L.およびNowak T,、Vox Sang 67（増補版）、1、62〜66、1994、
Horowitz.ら、Blood、86、11、4331〜4336、1995を参照のこと）。

【００１０】上記の記載を要約すると、凍結乾燥IVIGの臨床的副作用は、液体のIVIGより大
きいことが明白である。なぜなら、凍結乾燥過程で一部のIVIGに重合が生じるか
らである。そこで、凍結乾燥調製物は大量生産に適さない。

【００１１】

【発明の概要】

本発明の目的は、上記の従来技術における欠点を克服し、保護剤を用いない二
重失活処理（すなわち、２つの異なるメカニズムを用いたウイルス失活処理法を
用いること）されたIVIGの調製法を提供することであり、この方法によってウイ
ルスの完全な失活が達成できるので、本発明のIVIGが臨床により効果的かつ安全
に使用され得る。

【００１２】［発明の詳細な説明］第１工程：低温失活処理原料としてChon成分II（FII）を取り出して2〜10倍量の氷冷蒸留水に溶解し、
0.2〜2.0mmol／Lの酢酸溶液でpH3.5〜5.0に調整し、次いで、分子量10〜100kDa
の限外濾過膜により限外濾過処理および脱アルコール処理を行って、そして1〜1
0mmol／Lのナトリウムイオン濃度になるまで脱塩処理を行う。その後、IVIG濃度
を0.5〜2％に調整し、ボトリングし、内部圧が0.7〜200kPaに達するまで気体CO2
で満たし、保護剤の非存在下でボトルを密閉し、60±1℃で10時間失活処理する
。

【００１３】第２工程：低pHでのインキュベーション処理低温失活処理後のFII溶液を10〜100kDaの限外濾過膜で分割および精製する。
IVIGの純度がまだ97％未満である場合、ゲル吸着および精製によってその純度を
増加させ、次いで、5〜10％IVIGに濃縮し、pHを4.1±0.3に調整し、そして除菌
濾過処理を行い、21日間室温に置く。次いで、5〜10％グルコースを添加して溶
液の浸透圧を調整し、半製品の検査および生物学的試験を行う。半製品の検査が
合格した後、再び除菌濾過して25ml／ボトルまたは50ml／ボトルでボトリングす
る。

【００１４】製品の全面品質検査が、IVIGの規定に従って行われる。 IVIGの品質および安全性を効果的に確認するために、上記のように産生された
IVIGに対して試験を行う（本試験は、West China University of Medical Scien
cesが請け負う）。VSV（水泡性口内炎ウイルス）、Polio-I（背骨髄炎ウイルス
）およびSndbis（Ｂ−型脳炎ウイルス）を指示ウイルスとして使用して、低温失
活処理（従来方法）、低pH失活処理（従来方法）および二重失活処理法（本発明
方法）によってウイルスを失活処理する。得られる結果が表１、表２および表３
に示される。

【００１５】１．低温失活処理

【表１】 60℃での３種のウイルスに対する失活処理効果表１に認められるように、Polio-Iウイルスに対する低温失活処理の失活処理
効果は非常に著しいが、VSVでは効果が少し小さく、Sindbisでは最も劣る。

【００１６】２．低pH失活処理

【表２】pH4.0、23℃における２種のウイルスに対する失活処理効果表２に示されるように、VSVは酸性環境（pH4.0）で非常に感受性があり、容易
に失活され、処理の７日後このウイルスは活性を有さなかった。しかし、Sindbi
sウイルスはpH4.0に対して感受性が低く、処理の21日後、このウイルスはようや
く失活される。

【００１７】３．ウイルスの二重失活処理

【表３】３種のウイルスに対する二重失活処理の効果表３は、３種の指示ウイルスが10時間の低温失活処理によって失活されている
ことを示す。なお、この際さらに低pH失活処理が行われた場合、産物の安全性は
さらに改善される。

【００１８】本発明者らは、調製された幾つかの製品を検出するために、これらの製品を「National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Produc
ts」および AIDS Detection andConfirmation Laboraory of the People's Lib
eration Army (PLA)」に送った。結果を表４および表５に示す。

【００１９】１．低温失活処理

【表４】60℃での４種のウイルスに対する失活処理効果この試験において、ウイルスの最小検出限界は0.50 Log TCID50／0.1mlである
。Sindvisベースウイルスの滴度は7.70 Log PFU／mlである。ND：ウイルス検出
なし。

【００２０】検出の結論検出に送られたサンプルを、低温失活処理（60℃で10分間加熱）で処理した。
指示ウイルスVSV、HIV、SindbisおよびPolio-Iに対する失活処理効果が顕著であ
った。30分間の加熱後、ウイルス滴度は検出限界以下に減少した。ウイルスはそ
れぞれ、VSV：4.5〜4.63以上、Polio-I：2.63〜3.63以上、HIV：3.77〜4.17以上
（単位：Log TCID50／0.1ml）、およびSindbis：6.32〜6.41Log PFU／nl以上に
減少した。6時間、10時間加熱のサンプルについて、３世代の盲目継代は陰性で
あった。

【００２１】２．低pH失活処理

【表５】３種のウイルスに対する低pH室温でのインキュベーションにおける失活
処理効果本実験において、ウイルスの最小検出限界は、0.50 Log TCID50／0.1ml以下で
ある。 ※：低温失活処理後のサンプル。 Sindbisベースウイルスの滴度は8.35 Log PFU／mlである。 DN：ウイルス検出なし。

【００２２】検出の結論検出に送られたサンプルをpH4.0±0.2、22〜24℃で21日間インキュベートした
。失活処理効果は、VSV：5.88〜6.63 Log TCID50／0.1ml以上、HIV：3.77〜4.17
以上、およびSindbis：7.33〜7.74Log PFU／ml以上であった。３世代の盲目継代
は陰性であった。

【００２３】上記試験の結果を要約すると、以下の結果が導かれる。１．60℃で10時間の低温失活処理によって、４種のウイルスが失活処理可能であ
るが、特に、VSVおよびPolio-Iウイルスにおいてより効果的である。２．低pHインキュベーションによって、VSV、HIVおよびSinbisウイルスにおいて
効果的な失活処理が可能である。VSV、HIVおよびSindbisウイルスにおいて非常
に強い失活処理効果が認められ、７日間で完全に不活性化した。３．ウイルス二重失活処理について、10時間の低温失活処理の後、pH4.0、室温
で21日間再び保存したところ、すべての指示ウイルスはより確実に不活性化され
た。従って、血液製品の安全性が保証され得る。

【００２４】従来の技術と比較すると、本発明の利点は以下である。１．本発明方法において保護剤を添加していない。本方法は効果的にウイルスを
不活性化し得る。IVIG分子の完全性および天然の生物活性を維持すると共に、製
品の純度および安全性を確保することができ、生物製品に良好な安定性を与える
。製品のウイルス失活処理効果および全体的な品質は、「Ministry of Health o
f P.R. China」の検証によって認められ、「China National Regulation of Bio
logical Products」の1995版の基準に一致している。２．本発明方法では、IVIG調製において凍結乾燥粉末よりも液体調製物を選択す
る。これは、生産期間を短縮すると共に、エネルギー消費を低減し、そして大量
生産するのに好ましい。製品の品質は、安定で信頼できる。３．溶液の浸透圧平衡を調節するために、生物製品に5〜10%のグルコースを添加
し、患者における投与後の副作用の発生を防止する。

【００２５】

【実施例】

実施例１保護剤を添加しない二重失活処理によるヒト血液IVIGの調製法第１工程（低温失活処理） 16.5kgのFII沈殿物を165リットルの蒸留水（0℃）に溶解し、1mmol／Lの酢酸
溶液でpH3.5に調整し、100kDaの限外濾過膜により限外濾過処理および脱アルコ
ール処理を行って、そして1.2mmol／Lのナトリウムイオン濃度になるまで脱塩処
理を行った。その後、IG濃度を1.5％に調整し、ボトリングし、内部圧を100kPa
になるように気体CO2で満たし、ボトルを密閉し、60±1℃で10時間失活処理した
。第２工程（低pHでのインキュベーション処理）低温失活処理後のFII溶液を100kDaの限外濾過膜で分割および精製した。IGの
純度が97％未満であった場合、DEAE-Sephadex A-50ゲル吸着を用いてその純度
を98%以上に増加した。次いで、5％IGに濃縮し、pHを4.1に調整し、除菌濾過を
行った。21日間室温で保持した後、5％のグルコースを添加した。細菌除去後の
半製品を、物理学的および化学的検査ならびに発熱因子試験および失活処理試験
に供した。半製品の検査が合格した場合、再び除菌濾過を行い、25ml／ボトルま
たは50ml／ボトルでボトリングした。製品の全面品質検査を、ヒト血液IVIGの規
定に従って行った。

【００２６】実施例２保護剤を添加しない二重失活処理によるヒト血液IVIGの調製法第１工程（低温失活処理） 15kgのFII沈殿物を150リットルの蒸留水（0℃）に溶解し、0.2mmol／Lの酢酸
溶液でpH5.0に調整し、10kDaの限外濾過膜により限外濾過処理および脱アルコー
ル処理を行って、そして10mmol／Lのナトリウムイオン濃度になるまで脱塩を行
った。その後、IG濃度を2％に調整し、ボトリングし、内部圧を0.7kPaになるよ
うに気体CO2で満たし、ボトルを密閉し、60±1℃で10時間失活処理した。第２工程（低pHでのインキュベーション処理）低温失活処理後のFII溶液を10kDaの限外濾過膜で分割および精製した。IGの純
度が97％未満であった場合、DEAE-Sephadex A-50ゲル吸着を用いてその純度を98
%以上に増加した。次いで、8％IGに濃縮し、pHを4.1に調整し、除菌濾過を行っ
た。そして21日間室温で保持した後10％のグルコースを添加した。以降の手順は
実施例１と同じであった。

【００２７】実施例３保護剤を添加しない二重失活処理によるヒト血液IVIGの調製法第１工程（低温失活処理） 16.5kgのII沈殿物を165リットルの蒸留水（0℃）に溶解し、2.0mmol／Lの酢酸
溶液でpH4.2に調整し、50kDaの限外濾過膜により限外濾過処理および脱アルコー
ル処理を行って、そして5mmol／Lのナトリウムイオン濃度になるまで脱塩処理を
行った。その後、IG濃度を0.5％に調整し、ボトリングし、内部圧を200kPaにな
るように気体CO2で満たし、ボトルを密閉し、60±1℃で10時間失活処理した。第２工程（低pHでのインキュベーション処理）低温失活処理後のFII溶液を50kDaの限外濾過膜で分割および精製した。IGの純
度が97％未満であった場合、DEAE-Sephadex A-50ゲル吸着を用いてその純度を
98%以上に増加した。次いで、10％IGに濃縮し、pHを4.1に調整し、除菌濾過を行
った。21日間室温で保持した後、8％のグルコースを添加した。以降の手順は実
施例１と同じであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ファンシャオウェン中国、スーチャンプロビンス 610214、チャントゥ、ファーヤンタウン、ジエアーヤン (72)発明者ツァオチャオ中国、スーチャンプロビンス 610214、チャントゥ、ファーヤンタウン、ジエアーヤンＦターム(参考） 4C085 AA33 CC13 CC22 DD01 DD07 DD08 DD23 DD41 4H045 AA20 CA42 EA20 GA10 GA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】保護剤を添加しない二重失活処理による静脈内注射用の免疫
グロブリンの調製法であって、原料としてChon成分IIを取り出し2〜10倍量の氷冷蒸留水に溶解し、0.2〜2.0m
mol／Lの酢酸でpH3.5〜5.0に調整し、次いで、分子量10〜100kDaの限外濾過膜に
より限外濾過処理および脱アルコール処理を行って、そして1〜10mmol／Lのナト
リウムイオン濃度になるまで脱塩し、その後IG（免疫グロブリン）濃度を0.5〜2
％に調整し、ボトリングし、圧力が0.7〜200kPaに達するまで気体CO2で満たし、
保護剤の非存在下でボトルを密閉し、60±1℃で10時間失活処理する第１工程（
低温失活処理）と、低温失活処理後のFII溶液を10〜100kDaの限外濾過膜で分割および精製し、次
いで、5〜10％IGに濃縮し、pHを4.1±0.3に調整し、除菌濾過を行って、最後に2
1日間室温で保持し、さらに、溶液の浸透圧平衡を調整するために5〜10％グルコ
ースを添加する第２工程（低pHでのインキュベーション処理）と、を含むことを特徴とする、保護剤を添加しない二重失活処理による静脈内注射
用の免疫グロブリンの調製法。
【請求項２】低温失活処理後の前記FII溶液を、10〜100kDaの限外濾過膜
で分割して精製し、IGの純度が97％未満であった場合、この純度がゲル吸着で改
善される第２工程（低pHでのインキュベーション処理）を特徴とする請求項１の
方法。