JPS63146832A

JPS63146832A - 非化学修飾γ−グロブリンの加熱処理方法

Info

Publication number: JPS63146832A
Application number: JP61204760A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Hirao; 平尾　豊; Katsuhiro Uryu; 瓜生　勝寛; Kazuo Takechi; 武智　和男; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-07-09
Filing date: 1986-08-30
Publication date: 1988-06-18
Anticipated expiration: 2010-11-08
Also published as: KR960015104B1; KR880001298A; JPH07103045B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、非化学修飾Ｔ−グロブリン含有水溶液の加熱
処理方法に関する。

さらに詳しくは、非化学修飾Ｔ−グロブリンに、特定の
安定化剤を添加し、加熱処理することによる重合体の増
加、抗補体価の上讐を認めず、かつ非化学修飾Ｔ−グロ
ブリンの活性がそこなわれることのない非化学修飾Ｔ−
グロブリン加熱処理方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕血漿蛋白
成分である非化学修飾免疫グロブリンのうち、特にＩ［
Ｇを主成分とする非化学修飾Ｔ−グロプリン製剤は、こ
れまで広く各種感染症の予防並びに治療に役立てられて
きたが、熱安定性に欠けること、多種ウィルス、細菌等
の抗体を広（含有している等の理由で加熱殺菌は施され
ていムい。

しかし、非化学修飾γ−グロブリンを血脩蛋白の分画か
ら得る場合には、肝炎ウィルス等の夾雑ウィルスの混在
を１００％否定することはできない、そのため、夾雑ウ
ィルスの不活化方法として加熱殺菌を施すことは充分意
義のあることである。

しかし、通常の生理的食塩溶液等の水溶液中でこれを行
うと短時間で白濁し、大部分の活性を失い、蛋白分子が
変性してしまうという問題点がある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、かかる問題点を解決するために種々検討
を重ね、非化学修飾γ−グロブリンを含有する水溶液に
対して、肝炎ウィルス、エイズウィルス等を不活化する
ための加熱処理を行うに際して、ソルビトールを添加す
れば加熱処理に対する非化学修飾Ｔ−グロブリンの熱安
定性が著しく高まることを見出した。

本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり
、その要旨は非化学修飾γ−グロブリン含有水溶液に対
して、ソルビトールの存在下に加熱処理をすることを特
徴とする非化学修飾Ｔ−グロブリン含有水溶液の加熱処
理方法である。

本発明の非化学修飾Ｔ−グロブリンとは、■　自然のま
まで何らの修飾や変化も受けておらず、従ってＴ−グロ
ブリンのフラグメントであるＦａｂ、　Ｆ　（ａｂ’）
ｘ、　Ｆ　ｃ等を含まず、■　抗体価の低下がなく、同
時に抗体スペクトルの低下もなく、 ■　抗補体作用（補体結合性）が日本国生物学的製剤基
準で安全とみなされる２０単位（Ｃ）ｌ　５０値）より
も十分に低いという諸性状を備えたものをいう。

本発明において使用する非化学修飾Ｔ−グロブリンは、
自然状態のものでしかも抗補体価の低いものであれば、
いかなる方法で得たものであってもよいが、既存の設備
で製造できる、既に医薬として使用されている筋注用γ
−グロブリンを用い、酸性処理でその凝集体を切り離し
て得るのが最も効率的である。しかし製造上の複雑さや
収量の低下を問題としないならば、非イオン系界面活性
剤による方法で抗補体作用の原因となるＴ−グロブリン
４１１Ｊ！ｉ体を除去し、抗補体価の低いγ−グロブリ
ンとしたものを使用することが好ましい。

本発明における非化学修飾Ｔ−グロブリン含有水溶液と
しては、非化学修飾Ｔ−グロブリンを含む未精製な水溶
液から高度精製された水溶液までいかなる段階の非化学
修飾Ｔ−グロブリン水溶液であってもよいが、有利には
部分精製または精製段階の水溶液が加熱処理の対象とさ
れる。その蛋白質（非化学修飾Ｔ−グロブリン）の含量
は０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）のものが好ましいが、特に
限定されない、また当該水溶液のｐＨは一般にｐＨ４，
５〜６．５であり、特に適当な緩衝液によってｐＨ５〜
６に調整されていることが好ましい。

ソルビトールの添加量は非化学修飾Ｔ−グロブリン水溶
液１００−当たり、一般に１０〜７０ｇ。

好ましくは３０〜７０ｇ、より好ましくは４０〜６０ｇ
である。

加熱処理時のイオン強度は、低イオン強度であることが
好ましく、特に０．０１以下、さらに好ましくは０．０
０１以下である。

加熱処理は、夾雑ウィルスを不活化するに十分な温度及
び時間行えばよく、置体的には５０℃〜７０℃、好まし
くは約６０℃にて、ｌＯ分〜２０時間、好ましくは１０
時間行われる。

本発明の加熱処理による効果を検討するため、非化学修
飾Ｔ−グロブリン製剤に含まれる可能性が危惧される各
種ウィルスの感染性について、安定化剤の添加による加
熱効果、安定化剤の無添加による加熱効果を実験した。

この実験は、非化学修飾Ｔ−グロブリン試料に痘癒ウィ
ルス、おたふくかぜウィルス、はしかウィルス、水泡性
口内炎ウィルス、チクングニアウイルス、ポリオウィル
ス、コタサツキーウイルス、エコーウィルスを加え、６
０℃で１０時間の加熱処理を行い、経時的に残存するウ
ィルス感染性を測定したが、１０時間後には安定化剤の
添加、無添加にかかわらず、感染性を完全に失っていた
。この結果は用いたウィルス以外のウィルスについても
本発明の加熱処理が施されるならば感染性は失活させう
ることを示唆するものであり、また、数分間の加熱処理
で感染性は十分減少させうるものであることを示してい
る。

上記加熱処理を行った後、外観、性状はもとより、重合
体の定量、抗補体価の測定、麻疹抗体価の測定および急
性毒性実験を行った。かくして、本発明方法を経たもの
は非化学修飾γ−グロブリン製剤として医療上極めて安
全性の高い、また、有効性の高いものであることが確認
された。

かくして本発明の処理を受けた製剤は、溶液状であり、
粗製品を用いた場合は公知の精製法に準じてさらに処理
を行った後、必要ならば、透析、除菌濾過を行った後、
包装単位に従って５００〜１０．０００■の非化学修飾
γ−グロブリンを含むように分注される。当該製剤の貯
蔵に際しては、高温を避ければ特に問題ではない、望ま
しくは、３０℃以下にて保存される。また、当該製剤は
所望により凍結乾燥製剤としてもよい。

当該処理を経た非化学修飾Ｔ−グロブリンは、そのまま
、または自体公知の製剤化処理を行って、例えば注射用
蒸留水で希釈または溶解して投与される。投与量は、通
常、成人に対しては、１＠に非化学修飾Ｔ−グロブリン
として２５００〜５０００　ｗｗｚ量、小児に対しては
、１回に非化学修飾γ−グロブリンとして１００〜１５
０　ｑｒ／　ｋｇ体重が使用される。

〔効果〕

本発明の加熱処理を経た非化学修ｆ！ｔａｒ−グロブリ
ンは、たとえば肝炎ウィルス、エイズウィルス等のウィ
ルスが実質的に不活化されており、かつ非化学修飾Ｔ〜
グロブリンは高活性で存在するので、本発明の処理を経
た非化学修飾γ−グロブリンの使用によってウィルスに
よる感染の可能性が掻めて少ない。

また、本発明の処理を経た非化学（Ｉ！飾γ−グロブリ
ンは、水に対する溶解性に便れており、水溶屑物の溶状
が良好に保たれ、さらに高分子型の生成が抑制され、か
つ抗補体価の上昇が抑制されており、静脈投与製剤用の
処理法として好適である。

〔実施例〕

以下の実施例において、試験は次の方法によって行った
。

（試験方法）外観性状としては、濁りが問題となることから０、Ｄ、
ｈｏ、　ｎｓの吸光度を測定した。

重合体の定量は高速液体クロマトグラフィーで分析した
。

抗補体価の測定は、カパットとマイヤーの方法（Ｉｉｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｓ＋１ｓ
ｔｒｙ＋　　２２５　　（１９６１））および６岡、開
田の方法〔免疫の生化学、１０３、昭４６（共立出版）
〕に準じた。即ち、１００単位の補体が試料を加えるこ
とによって何単位に減少するかを測定し、その減少単位
を抗補体価として表わした。

麻疹抗体価はＩｌｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｉｏｎｆｅｓｔ法により測定し、国際単位
（Ｉｌｌ／１５０ｗ）で表わした。

実施例１コーン画分■十ｍ１ｋｇに０．００１Ｍの塩化ナトリウ
ム溶液１（ｌを加え、ｐＨを５．０に調整した後、ＰＥ
Ｇ＃４０００を終濃度が８％になるように添加し、２℃
で遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８
，０とした後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１２％にな
るように加え、２℃で遠心分離を行い、ＩｇＧ画分を集
めた。

このＩｇＧｌｌｉｉ分を、水を用いＩｇＧ濃度が７％に
なるように溶解せしめ、ρ１１を６．５に調整した。

この？８’ｔｆｔｊｔ　Ｄ　ＩＥ　Ａ　Ｅ−セファデッ
クス（そのｌａｊ当たり５０−溶液量）で０〜４℃の条
件下約１時間接触処理し、処理後上清を遠心分離で回収
した。

このＩｇＧ溶液１００＠ｊを別途調整したベンズアミジ
ンセファロース（登録商標、ファルマシア社製）カラム
５＠１およびヒト血液型物質フォルミルセルロファイン
力ラム３−を通過させヒト血液型抗体を吸着除去した。

この工程での吸着により血液型抗体は（１：３２）から
（１：　２）に低下した。

この未吸着画分（非化学修飾Ｔ−グロブリン）を５％濃
度に調整し、安定化剤ソルビトールを２０％濃度（γ−
グロブリン溶液１０３ｍ７に対しソルビトールを２０ｇ
加えたもの）に添加後、６０’Ｃ１１時間の加熱処理を
行い、溶液の濁り、重合体の定量及び抗補体価を調べた
。この結果、イオン強度を０〜０．０１、特に０．００
１以下に調整し、安定化剤を添加し、ｐｌｌを４．５〜
６．５、特に５〜６に調整することによって非化学修飾
Ｔ−グロブリンの加熱安定性は増大した（表１）。

実施例２実施例１で得た非化学修飾γ−グロブリン溶液、即ち未
吸着画分に各種濃度にソルビトールを添加、非化学修飾
γ−グロブリン濃度を５％に調整したものにつき６０℃
加熱処理を行い、重合体定量、抗補体価、麻疹抗体価等
の測定を行い、その結果を表２に示した。

ソルビトールを１０ｇ、／ｄｌ！しか含まない系は、ｐ
Ｈ値によっては１時間以内に白濁し、変性、重合体の生
成、抗補体価の上昇を示していることが見られるのに対
し、ソルビトールを１５ｇ／ｄｊ！加えた系は、非化学
修飾Ｔ−グロブリンの安定性が高まった（表２）。

実験例１安全性試験として急性毒性実験を行った。

実施例１において、ｐＨ５，０で６０℃、１時間加熱処
理を施したサンプルにつき、無菌生理的食塩水で十分透
析した後、マウスの尾静脈から１６当たり総量０．５−
および１．０−をそれぞれ１群５匹に投与し、７日間観
察したが、異常は認められなかった。

（以下余白）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）非化学修飾Ｔ−グロブリン含有水溶液に対して、
ソルビトールの存在下に加熱処理をすることを特徴とす
る非化学修飾γ−グロブリン含有水溶液の加熱処理方法
。
（２）ソルビトールの添加量が、非化学修飾γ−グロブ
リン水溶液１００ｍｌ当たり、１０〜７０ｇである特許
請求の範囲第（１）項記載の加熱処理方法。
（３）低イオン強度下で加熱処理されることを特徴とす
る特許請求の範囲第（１）項記載の加熱処理方法。
（４）イオン強度が０．０１以下である特許請求の範囲
第（３）項記載の加熱処理方法。
（５）イオン強度が０．００１以下である特許請求の範
囲第（３）項記載の加熱処理方法。
（６）加熱処理が、約６０℃、１０分〜２０時間処理で
ある特許請求の範囲第（１）項記載の加熱処理方法。