JPS62283933A

JPS62283933A - 静注用非化学修飾免疫グロブリンの加熱処理方法

Info

Publication number: JPS62283933A
Application number: JP12629586A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Hirao; 平尾　豊; Katsuhiro Uryu; 瓜生　勝寛; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋; Kazuo Takechi; 武智　和男
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-05-31
Filing date: 1986-05-31
Publication date: 1987-12-09
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPH07121877B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、発明の詳細な説明〔産業上の利用分野〕本発明は、静注用非化学修飾免疫グロブリンのウィルス
不活化のための加熱処理方法に関するものである。

〔従来技術〕

従来より、アルブミンなどの血漿蛋白について、そこに
混入してくる懸念のあるウィルスを不活化する最も確実
な方法として、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状
加熱法と称す）が、Ｍｕｒｒａｙ　（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、
　　３１　　（５）　　５３４１〜３５Ｂ　　（１９５
５））の報告に基づいてとられており、以来今日に至る
まで長年にわたり汎用され、疫学的にも液状加熱法のウ
ィルス不活化効果が立証されている。

しかしながら、アルブミンのように液状加熱に耐えるも
のは血５！冒白の中でも極く限られており、特に生理活
性または生物活性を有する血漿蛋白は熱に対し非常に敏
感で、熱変性をおこし易く、活性の低下、消失を招きや
すい。

一方、液状加熱法とは別に、水分を含まないか、または
ほとんど含まない乾燥状態で、血漿蛋白の加熱処理（以
下、乾熱処理という）を行うと、液状加熱法に比べ、そ
の活性の低下が著しく抑制されることが血液凝固第■因
子をモデルとする実験で明らかとなった。しかし、−Ｃ
に乾熱処理においても、安定化剤を添加しなければ血漿
蛋白の活性低下はまぬがれ得ないし、また、水に対する
熔解性および溶状が悪くなるというのが実情である。

ところで、加熱によるウィルス不活化の作用機序は、液
状加熱では主としてウィルスの蛋白質成分の変性に基づ
いているのに対し、乾熱処理では主にウィルスの脂質成
分の酸化によって傷害を受け、病原性が失われるといわ
れており、両方のウィルス不活化機構はお互いに重なり
合う部分があるものの、基本的には異なることが示唆さ
れている（Ｒａｈｎ、　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｏｆ　５ｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ　Ｍａｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、　　Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、９
．ｌＮ４７、（１９４５）　）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、静注用非化学修飾免疫グロブリンを不
活化させることなく、夾雑ウィルスを不活化する加熱処
理方法を提供することである。

本発明の他の目的は、静注用非化学修飾免疫グロブリン
の水に対する溶解性および）８状を良好に保ちうる静注
用非化学修飾免疫グロブリンのウィルス不活化加熱処理
方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、静注用非化学修飾免疫グロブリンを乾熱
処理することによって静注用非化学修飾免疫グロブリン
の活性を失うことなく、ウイ°ルスを不活化できること
、特に安定化剤の存在下に静注用非化学修飾免疫グロブ
リンの乾熱処理を行うと、更に静注用非化学修飾免疫グ
ロブリンが顕著に安定化され、しかも、かかる条件下に
乾熱処理を行った非化学修飾免疫グロブリンは水に対す
る溶解性および溶状が良いことを見出して本発明を完成
した。

即ち、本発明は、ウィルス夾雑静注用非化学修飾免疫グ
ロブリンを、乾燥状態にて、好ましくは特定の安定化剤
の存在下に、ウィルスが不活化されるまで加熱すること
を特徴とする静注用非化学修飾免疫グロブリンの加熱処
理方法に関するものであり、これによって夾雑するウィ
ルスが不活化され、かつ静注用非化学修飾免疫グロブリ
ンの安定性および水溶解性が改善される。

本発明の静注用非化学修飾（ガンマ）免疫グロブリンと
は、（１）　　自然のままで何らの修飾や変化も受けておら
ず、従ってガンマ・グロブリンのフラグメントであるＦ
　ａｂ、　Ｆ　（ａｂ’）ｚ、Ｆ（、等を含まず、（２
）抗体価の低下がなく、（３）　　抗補体作用（補体結合性）が静注に際して安
全とみなされる２０単位（Ｃ’Ｈ５０値）よりも十分に
低いという諸性状を備えたものをいう。

本発明において使用する静注用非化学修飾免疫グロブリ
ンは、自然状態のものでしかも抗補体価の低いものであ
れば、いかなる方法で得たものであってもよいが、既存
の設備で製造できる、既に医薬として使用されている筋
注用免疫グロブリンを用い、酸性処理でその凝集体を切
り離して得るのが最も効率的である。しかし製造上の複
雑さや収量の低下を問題としないならば、非イオン系界
面活性剤を用いる方法で抗補体作用の原因となる免疫グ
ロブリン凝集体を除去し、抗補体価の低い静注用免疫グ
ロブリンとしたものを使用することが好ましい。

かかる静注用非化学修飾免疫グロブリンとしては、たと
えばヒト、ウマ及びマウス由来のものが例示され、それ
はポリクローナル抗体、モノクロ−ナル抗体のいずれで
もよく、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＡ又またはＩｇＭであ
る。

本発明は、通常、静注用非化学修飾免疫グロブリン溶液
を凍結乾燥した後、含湿度３％以下（通常は、０．１〜
１．５％）の条件下で加熱することによって実施される
が、その際、安定化剤を添加しておくことによって、よ
り一層静注用非化学修飾免疫グロブリンの安定が促進さ
れ、また静注用非化学修飾免疫グロブリンの溶解性およ
び溶状が改善される。

本発明において安定化剤としては、塘アルコールおよび
二ｖＮ類から選ばれる少なくとも一種が必須条件であり
、その他に中性アミノ酸、中性の無機塩、有機酸塩、ア
ルブミン、非イオン界面活性剤等を併用しても良い。

中性アミノ酸としては、たとえばグリシンが例示される
。

中性塩の無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、リン酸ナトリウムなどが例示される。

有機カルボン酸としては、酢酸、クエン酸などの生理的
に許容される塩、特にアルカリ金属塩（ナトリウム塩、
カリウム塩）があげられる。

糖アルコールとしては、ソルビトール、マンニトール等
が例示されるがソルビトールが最良である。

二ｔＪ［とじては、サッカロース、マルトース等が例示
されるがサッカロースが最良である。

安定化剤の使用量は、たとえば次の通りである。

即ち、静注用非化学修飾免疫グロブリン１ｗ／ｖ％溶液
に対して、０．８〜５　ｗ　／　ｖ％程度の安定他剤濃
度となるに相当する量である。この添加量において、安
定化効果が最も良好である。

静注用非化学修飾免疫グロブリンは、通常凍結乾燥品と
して使用に供するが、安定化剤は、静注用非化学修飾免
疫グロブリンの凍結乾燥処理の前に添加しておくことが
好ましい。　− また、安定化剤は、本発明の乾熱処理後に除去してもよ
いが、当該静注用非化学修飾免疫グロブリン製剤中にそ
のまま配合しておくことが好ましい。かくして静注用非
化学修飾免疫グロブリン製剤の保存安定性が改善される
。

加熱処理は、夾雑するウィルスを不活化するに十分な温
度および時間行えばよく、通常は３０〜１００℃、好ま
しくは６０℃程度であり、加熱時間は、通常１０分〜２
００時間、好ましくはｌＯ〜１００時間程度である。こ
こに夾雑するウィルスを不活化するとは、ウィルスの感
染性を実質的になくすことを意味する。

本発明の加熱処理による不活化対象とされるウィルスは
、ヒト血漿蛋白に夾雑が危惧されるウィルスであり、特
に肝炎ウィルス、エイズウィルスなどである。

また、本発明の加熱処理は不活性ガス雰囲気下で行うこ
とにより、加熱時の安定性をより高めることが出来る。

不活性ガスとしては、たとえば窒素ガス、アルゴン、ヘ
リウムなどが挙げられる。

さらに、静注用非化学修飾免疫グロブリンの精製度が約
９０％以上のものについて、本発明に関する安定化剤に
よる安定化効果がより顕著である。

本発明乾燥処理における乾燥状態は実質的に無水の状態
であり、可及的に水分の少ない状態であることが好まし
い。水分の含量は、通常３％以下、好ましくは２％以下
であり、通常は０．１〜１．５％程度である。

本発明によるときは、貴重な血液製剤である静注用非化
学修飾免疫グロブリンの活性を大きくｔ置火することな
く、製剤中に混入が危惧されているウィルスを不活化で
きるから、静注用非化学修飾免疫グロブリンの工業的製
法として有益である。

〔作用・効果〕

本発明の処理を経た静注用非化学修飾免疫グロブリンは
、はとんど失活されておらず、そこに混入が危惧されて
いるウィルスが不活化されている。

従って、本発明の処理を経た静注用非化学修飾免疫グロ
ブリンの使用によってヒト血漿蛋白に夾雑が危惧される
ウィルス、特に肝炎ウィルス、エイズウィルス等による
感染の可能性が少ない。

また、本発明の処理を経た静注用非化学修飾免疫グロブ
リンは、水に対する溶解性に優れており、水溶屑物の溶
状が良好に保たれるものである。

〔実施例・実験例〕

以下、本発明を実験例および実施例により説明するが、
本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

以下の実施例および実験例の試験は次の方法によった。

（試験方法）溶解性、溶状に関する外観性状としては、濁りが問題と
なることから○、Ｄ、６゜。ｎ＋ｍの吸光度を測定した
。

重合体の定量は高速液体クロマトグラフィーで分析した
。

抗補体価の測定は、カパフトとマイヤーの方法（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋　２２５　（１９６１））および西岡、開田の方法〔
免疫の生化学、１０３、昭４６（共立出版）〕に準した
。即ち、１００単位の補体が試料を加えることによって
何単位に減少するかを測定し、その減少単位を抗補体価
として表わした。

麻疹抗体価はｌｌｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｉｏｎＴｅｓ　を法により測定し、国際単
位（１０／１５０■）で表わした。

ジフテリア抗毒素価はウサギ皮内法、ＨＢｓＡｇ抗体価
は赤血球凝集反応法、ＩｇＧ純度はセルロースアセテー
ト膜電気泳動で求めた。

実施例１正常ヒト血漿よりコーン氏の冷アルコール分画法に従い
、Ｆｒ−１１＋Ｉ［［（１６０画分）を得た。

このコーン画分１１＋Ｉ［１１にｇにＯ，ＯＯＩＭの塩
化ナトリウム溶液１０１を加え、ρ■を５．０に調整し
た後、ポリエチレングリコール、すなわちＰＥＧ＃４０
００を終濃度が８％になるように添加し、２℃で遠心分
離を行った。

得られた上清をｌＮ−水酸化ナトリウムを用いテｐＨ８
，ＯトＬ　タ後、ＰＥＧ＃４０００を終濃度が１２％に
なるように加え、２℃で遠心分離を行い、１６０画分を
集めた。

この１６０画分を０．６％塩化ナトリウム／８液を用い
ＩｇＧ濃度が７％になるように溶解せしめ、ｐｉ（を６
．５に調整した。この溶液をＤＥＡＥ−セファデックス
（そのｌ−当たり５〇−溶液量）で０〜４℃の条件下約
１時間接触処理し、処理後上清を遠心分離で回収した。

この回収したＩｇＧ溶液１００−を別途調整したベンズ
アミジンセファロース（登録商標、ファルマシア社製）
カラム５Ｉ１１７およびヒト血液型物質フォルミルセル
ロファイン力うム３ｆｆｉ７ヲｉｌ過１ヒト血液型抗体
を吸着除去した。この工程での吸着により血液型抗体は
（１：　３２）から（１：　２）に低下した。

この未吸着画分を冷水で５％溶液とし、さらにサッカロ
ースを５　ｗ　／　ｖ％添加した。このＩｇＧ１８　／
＆のｐＨを６．３〜６．５に修正後、凍結乾燥を行った
。凍結乾燥後の含湿度は、０．８％であった。こ　。

の凍結乾燥されたＩｇＧ粉末を６０℃で７２時間加熱処
理し、加熱処理前の［ｇＣと比較しながら、溶解性、ｌ
ｌＢｓＡｇ抗体価、麻疹抗体価、ジフテリア抗毒素価、
セルロースアセテート膜電気泳動、ゲルｉｌ！過の項目
につき試験した結果、加熱処理後でも著明な変化はみら
れず、本加熱条件下ではヒト静注用非化学修飾免疫グロ
ブリンは安定であることがわかった。

実験例１　（安定化剤の添加ｉｔ）実施例１に準じて調製した静注用非化学修飾免疫グロブ
リン口ｇＧ）の５　ｗ　／　ｖ％水溶液に、第１表記載
の添加量で各安定化剤を添加し、ｐｉを６．３〜６．５
に調整後、凍結乾燥した。そのＩｇＧ粉末を６０℃で７
２時間加熱処理した後、溶解性、ジフテリア抗毒素価、
麻疹抗体価について試験した。その結果を第１表に示す
。試験方法は、「生物学的製剤基準」に従った。

この結果、安定化剤の使用により、無添加（コントロー
ル）の場合に比べて安定性が改善されることが判った。

また、本発明の乾熱処理による有効な添加量は、４〜２
５Ｗ／Ｖ％であることが判った。

実験例２実施例１に準じて調製した静注用非化学修飾免疫グロブ
リン（［ｇＧ）の５　ｗ　／　ｖ％水溶液に、サッカロ
ースをｌｏｗ／ｖ％加え、これに０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，１）のウィルス懸濁液を加え、均一に混和
した後に、凍結乾燥を行った。

凍結乾燥終了後、窒素ガスにて平圧に戻して密栓し、６
０℃の温浴中に浸漬し、加熱した。なお、瓶中の温度が
６０℃に達するまでｌＯ〜１５分要するので、実際は加
熱時間を３０分間延長して行った。

各ウィルスの怒染性はプラーク　フォーミング（ｐｌａ
ｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ）法にて測定した。

結果は第２表に示す通りである。

（以下余白）第１表Ａ：勅櫃（ｗ／ｖ％）Ｂ：溶解性（○：不零阿鳳Δ：やや不溶吻有、×：不ン
梢外（イ）Ｃニジフチリア抗毒素価（Ｉ　Ｕ／１００ｍ
ｇ）Ｄ：麻疹抗体価　　　　（１０／１００ｍｇ）Ｅ：
抗補体価　　　　　（Ｃｌｌｓｏ／ｌｍ７）手続主甫正
暑ｊ帽発）昭和６１年７月３０日昭和６１年特許願第１２６２９５号２、発明の名称静注用非化学修飾免疫グロブリンの加熱処理方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字４、代理人■５４１住所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号置　（０６）　２２７−１１５６６、補正の内容（１）　　明細書第７頁第２行、「または」を「は」に
訂正する。

（２）　　明細書第１６頁第１表中、「」に訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ウィルス夾雑が危惧される静注用非化学修飾免疫
グロブリンを乾燥状態にて、ウィルスが不活化されるま
で加熱することを特徴とする静注用非化学修飾免疫グロ
ブリンの加熱処理方法。
（２）安定化剤の存在下に、含湿度３％以下の乾燥状態
下で加熱することからなる特許請求の範囲第（１）項記
載の方法。
（３）静注用非化学修飾免疫グロブリンがヒト、ウマま
たはマウス由来であることを特徴とする特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。
（４）ヒトまたはマウス由来の静注用非化学修飾免疫グ
ロブリンがポリクローナルまたはモノクローナル抗体で
あることを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の
方法。
（５）静注用非化学修飾免疫グロブリンが、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＡまたはＩｇＭであることを特徴とする特許請求の範
囲第（１）項記載の方法。
（６）安定化剤が、糖アルコールおよび二糖類から選ば
れる少なくとも一種である特許請求の範囲第（１）項記
載の方法。
（７）静注用非化学修飾免疫グロブリンに加える安定化
剤の濃度が、静注用非化学修飾免疫グロブリンの１ｗ／
ｖ％溶液に対して、０．８〜５ｗ／ｖ％の濃度となるに
相当することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記
載の方法。