KR20160108599A - 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일종의 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법을 공개하였다. 상기 복합 콜라겐 스폰지는 콜라겐, 세포 생장인자 및 보호제를 함유하고, 그 흡수량은 52배 이상이며, 제조 방법 중 양이온크로마토그래프 정제화 단계, 및 유기용제/오염제거제 바이러스 비활성화와 건열 바이러스 비활성화의 투스텝 비활성화 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 통해 획득된 콜라겐 스폰지는 제품의 임상 응용에의 안전계수와 성능을 높였을 뿐만 아니라, 제품의 안정성과 유효기간 내의 생물 활성을 보장하였다.

Description

복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법 {COMPOSITE COLLAGEN SPONGE AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 생물 및 의학소재 분야에 속하며, 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 상기 복합 콜라겐 스폰지는 인체와 동물체의 상처 지혈에 사용되어 세포의 생장과 증식, 및 혈관과 기관조직의 수복(repair)을 촉진한다.
의학분야에서, 창상 수복과 임상 수술 후 신체 조직의 생장과 재생은 상호 관련이 있는 병리생리 과정으로서, 신체 조직의 일련의 생화학적, 생리적 형태의 변화를 포함한다. 따라서 신체 조직이 손상되었을 때, 흔히 피부와 장기 표면에 결손이 나타난다. 세포가 회복 불능한 경우, 신체 조직에 전이 피판과 이식 피부의 감염, 궤양, 괴사 등이 나타난다. 일반적으로 임상에서 이러한 현상이 발생할 확률을 낮추기 위해, 통상적으로 항생제를 주사하거나 또는 외부에서 중약, 양약 등 항감염 처리 방법을 이용하고 있으나, 그러나 창상의 신체 조직 세포의 생존률이 지극히 낮아 근육 결손, 흉터 생성, 상처부위의 유합 주기가 길다는 등 좋지 않은 상황이 발생하고, 심지어 재수술을 해야 하는 등의 특징이 있다.
상처부위에 불량한 상황이 발생하는 것을 방지하고 재수술률을 감소시키기 위한 기술적 난제는, 80년대 이래 생장인자를 이용한 신체의 창상 및 의료 수술 후의 신체에 대한 수복 작용에 관해 다량의 연구와 임상 응용을 실시하였으며, 신체 수복의 내재 의미를 단순한 체표면의 자연 유합으로부터 세포 조직의 수복 과정으로 발전시켰으며, 생장인자를 통해 상처면의 자연 유합에 인위적으로 개입하여 조직 세포가 살아나도록 촉진 또는 회복시키는 효과를 얻었다.
콜라겐은 세포외 기질을 구성하는 구조단백질로서, 다수의 당단백 분자로 구성된 백색의 투명한 무분지 원섬유이며, 4급 구조를 가진다. 콜라겐 단백질의 모노머는 프로콜라겐으로, 프로콜라겐 분자는 가늘고 긴 세 가닥의 나선형 사슬로 이루어져 있으며, 전자현미경으로 직경 1.5nm, 길이 약 300nm, 상대분자질량이 2.85×105인, 안정적인 3중 나선 공간 구조를 갖는 특수한 아미노산으로 구성되어 있는 것을 관측할 수 있다. 콜라겐은 지혈작용, 저항원성, 붕해성 및 생체적합성을 가지며, 임상 지혈 및 세포 생장 촉진용으로 생물의학소재에 사용되고 있다.
섬유세포 생장인자(FGF)는 상처 유합 과정 중의 모든 관련 세포의 유사분열 촉진인자, 케모카인 및 조절단백질로서, 중배엽과 외배엽으로부터의 세포(예를 들어 상피세포, 진피세포, 섬유세포, 혈관내피세포 등)에 대하여 수복 및 재생을 촉진하는 작용이 있다.
특허공보 US 2006/0236891, US 1978/4,066,083, US 20080268052 및 US 2010/7,854,258은 동물의 아킬레스 건 또는 피부에서 추출한 콜라겐으로 콜라겐 멤브레인을 제조하는 방법을 공개하였는데, 그러나 모두 바이러스 비활성화 조치는 제시하기 않아 임상 응용 과정에서 필연적으로 인간과 가축이 모두 병원성 미생물의 교차 감염을 일으킬 가능성이 존재한다. 예를 들어 B형 뇌염 바이러스(Encephalitis B virus EBV), E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus HEV), 가성 광견병 바이러스(Pseudorabies virus PRV), 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus VSV), 연주균(Streptococcus) 등은 모두 광범위한 인간 가축 교차감염 질병의 발생을 야기하여 매우 큰 재해를 초래한 적이 있다. 따라서 이러한 제조 공정으로 제조된 제품은 임상 응용 시 안전에 대한 우려가 반드시 존재한다.
특허공보 CN 1228339와 CN 1511592는 생물인자를 첨가한 복합 콜라겐 스폰지를 공개하였다. 그러나 제조 과정에서 방사선 조사 방식으로 멸균처리를 하기 때문에, 생물활성소제의 경우, 조사 과정에서 제품의 온도가 상승하면 생물 활성물질의 변성이 일어날 가능성이 있어, 생물활성 소재의 활성이 저하될 뿐만 아니라, 새로운 면역 활성 물질이 생성될 수 있는데, 이는 임상 응용 시 불필요한 번거로움을 가져올 수 있다.
또한, 제품을 장기간 보존하는 과정에서 활성이 저하될 수도 있어 임상응용 효과와 유효기간에 영향을 준다. 그러나 상기한 이러한 특허들은 모두 생물활성물질 첨가의 안정성에 대한 보호조치와 고찰이 명확하게 다루어지지 않았고, 바이러스 비활성화 효과에 대해서도 확인이 이루어지지 않았다.
상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 일종의 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 본 발명의 과제는 하기한 일종의 복합 콜라겐 스폰지 및 그의 제조방법에 의해 해결된다:
1. 본 발명은 콜라겐과 세포 생장인자를 포함하며, 질량대비 수분 흡수량이 52배 이상인 일종의 복합 콜라겐 스폰지를 제공한다.
2. 상기 1에 있어서, 상기 복합 콜라겐 스폰지는 70.0 N/cm의 탄성계수를 갖는다.
3. 상기 2에 있어서, 상기 복합 콜라겐 스폰지는 복합 콜라겐 스폰지에 대하여, 함량이 10 중량% 내지 50 중량%이고, 중량비가 1 내지 11 : 1.25 내지 17.5 : 1 내지 7.5인 아미노산, 당 및 알부민을 함유하는 보호제를 더 함유하며, 상기 아미노산은 루이신, 이소루이신, 글리신, 알라닌 및 세린 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이고, 상기 당은 포도당, 락토오스, 수크로오스, 푸코오스 및 만니톨에서 선택된 적어도 하나 이상의 당이다.
4. 상기 3에 있어서, 상기 보호제는 하기한 방식으로 첨가된다: 콜라겐 용액에 최종농도가 2.0 내지 22 mg/ml, 바람직하게는 2.5 내지 15 mg/ml인 아미노산을 첨가하고; 콜라겐 용액에 최종농도가 2.5 내지 35 mg/ml, 바람직하게는 3.0 내지 15 mg/ml인 당을 첨가하며; 콜라겐 용액에 최종농도가 2 내지 15 mg/ml인 인간혈청 단백질을 첨가한다.
5. 상기 4에 있어서, 상기 보호제에 글리세린이 더 첨가되며, 콜라겐 용액에 최종농도가 1.0 내지 15 mg/ml인 글리세린을 첨가한다. 따라서 상기 복합 콜라겐 스폰지에 글리세린이 함유되는 경우, 글리세린과 보호제 중 당의 중량비는 0.5 내지 7.5 : 1.25 내지 17.5 이다.
6. 상기 복합 콜라겐 스폰지에 콜라겐, 세포 생장인자 및 상기 3 내지 5 중의 어느 하나의 보호제가 함유된다.
7. 본 발명은 또한 상기 1 내지 3 중 어느 하나의 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법을 더 제공하며, 상기 방법은 이온교환 크로마토그래프로 정제하는 공정을 갖는 콜라겐의 정제 단계를 포함하고, 상기 이온교환 크로마토그래프는 CM52 양이온 교환수지의 제조 크로마토그래프이고, 용리액은 염화나트륨과 아세트산나트륨을 함유한 pH 4.5 수용액이며, 그 중 염화나트륨의 농도는 0.2 내지 0.8 mol/L이고, 아세트산나트륨의 농도는 0.1 mol/L이다.
8. 상기 7의 제조방법에 있어서, 상기 방법은 투 스텝 바이러스 비활성화 과정을 갖는 바이러스 비활성화 단계를 포함한다:
제 1단계 바이러스 비활성화 과정은 오염제거제 및 유기용제의 바이러스 비활성화 과정이고;
제 2단계 바이러스 비활성화 과정은 90 내지 100 ℃에서 복합 콜라겐 스폰지 용액을 30 내지 120 분간 수욕 처리하는 과정이다.
9. 상기 8의 제조방법에 있어서, 상기 오염제거제 및 유기용제는 폴리소르베이트 80 및 트리부틸포스페이트의 혼합물이며, 상기 폴리소르베이트 80 및 트리부틸포스페이트의 콜라겐 용액에의 첨가량은 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1 중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3 중량%에 이르도록 하고, 바람직하게는, 콜라겐 농도가 30 내지 70 mg/ml, pH 값이 6.0 내지 8.0로 제어되는 조건 하에, 콜라겐 용액에 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트 혼합 멸균 수용액을 첨가하여, 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1 중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3 중량%에 이르도록 하고, 24 내지 26 ℃에서 6 내지 8시간 동안 바이러스를 비활성화한다.
10. 상기 1 내지 3 중 어느 하나의 제조방법에 있어서, 보호제가 존재하며, 상기 제 2단계의 바이러스 비활성화 과정에서, 콜라겐 용액 중의 보호제 첨가량은 보호제를 구성하는 아미노산의 최종농도가 2.0 내지 22 mg/ml이고, 당의 최종농도는 2.5 내지 35 mg/ml이며, 알부민의 최종농도는 2 내지 15 mg/ml에 이르도록 하고; 바람직하게는, 상기 보호제에 글리세린이 더 함유되며, 콜라겐 용액에 최종농도가 1.0 내지 15 ml/ml인 글리세린을 첨가한다.
본 발명의 복합 콜라겐 스폰지는 모세혈관의 재생을 촉진하고, 국부 혈액 순환을 개선하며, 창상의 유합을 가속화할 수 있어, 화상 창상(표재성 2도 화상, 심재성 2도 화상, 육아창), 만성 창상(체표 만성궤양 등) 및 신규 창상(외상, 피부 제공 부위, 수술창상 등 포함)에 응용될 수 있다. 본 발명의 복합 콜라겐 스폰지 제품은 장기 보존 과정에서 생물활성 물질의 안정성을 유지할 수 있으며, 높은 흡수력과 높은 탄성계수 및 우수한 유연성을 구비하여, 임상 응용에 탁월한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 콜라겐 전기영동도이다. 도 1 중의 a는 표준 상대분자질량 마커이고; b는 콜라겐 표준 샘플을 나타내며, c는 본 발명의 콜라겐 샘플을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 샘플과 대조 샘플의 흡수량 비교도이다.
도 3은 본 발명의 샘플과 대조 샘플의 탄성계수 비교도이다.
본 발명 중의 콜라겐은 신선한 포유동물의 결합조직 또는 돼지피부를 원료로 할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 콜라겐은 돼지피부로부터 I형 콜라겐을 추출하였으며, 추출 과정에서 염석과 크로마토그래프를 결합한 방식으로 정제하여 획득된 콜라겐은 순도가 높고, 면역원성이 없으며, 흡수력과 탄성계수가 대단히 향상되었다. 추출로 획득된 콜라겐에 대하여 투 스텝 바이러스 비활성화를 실시하여, 획득된 콜라겐 스폰지가 병원성 미생물에 의해 오염될 위험성을 낮추었고, 아울러 생물 활성 물질에 대한 영향을 감소시켰다. 이밖에, 유효 보호제의 첨가를 통해, 획득된 복합 콜라겐 스폰지 제품에 높은 안정성을 갖추었다.
본 발명이 제공하는 복합 콜라겐 스폰지는 콜라겐을 기질로 하여, 그 중 생장인자, 예를 들어 알칼리성 섬유세포 생장인자(FGF)가 균일하게 분포되며, 평방센티미터당 복합 콜라겐 스폰지의 FGF 함량은 200 U 내지 1500 U이다.
본 발명으로 제조되는 복합 콜라겐 스폰지는 길이 2.5 내지 10 cm, 폭 2.5 내지 5.0 cm, 두께 0.3 내지 2.0 cm인 제품으로 제조할 수 있다.
본 발명이 제공하는 콜라겐 스폰지는 콜라겐 순도가 99.0 % 이상이고, 질량대비 수분 흡수량은 52 배 이상이며, 회분은 1.0 % 미만인 특징을 더 구비한다.
본 발명이 제공하는 콜라겐 스폰지의 탄성계수는 70.0 N/cm 이상이고, 형성되는 구경은 일반적으로 50 내지 100μm이며, 0 내지 100시간(h) 내에 연속적으로 FGF를 방출하여, 창상에 대한 치료효과를 높일 수 있다.
콜라겐 스폰지 제품이 바이러스를 지닐 위험을 감소시키고, 제품의 안전성을 확보하기 위하여, 원료의 선별과 제어를 강화하는 이외에, 본 발명의 콜라겐 스폰지의 제조 방법에서는 이하 투스텝 바이러스 비활성화 과정을 더 채택하였다:
제 1단계: S/D 바이러스 비활성화 과정: 추출로 획득된 콜라겐 용액에 바이러스 비활성화제, 예를 들어 오염제거제 및 유기용제를 첨가하여 지질함유 바이러스를 비활성화하는 단계로서, 구체적인 방법은 50 내지 200 rpm으로 연속 교반하는 상태에서, 콜라겐 용액에 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트를 함유한 수용액을 천천히 투입하고 고르게 교반하여, 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1 중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3 중량%에 이르도록 하고, 24 내지 26 ℃에서 6 내지 8 h 동안 바이러스를 비활성화한다.
유행성 B형 뇌염 바이러스와 가성 광견병 바이러스를 모델 바이러스로 채택하여, 상기 방법을 통해 모델 바이러스의 비활성화량이 4 logs 이상이 되도록 할 수 있어, 안전성 요구에 부합된다.
상기 바이러스 비활성화 과정 중, 콜라겐 농도가 너무 높으면 바이러스 비활성화 효과에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 일반적인 경우 콜라겐의 농도가 30 내지 70 mg/ml로, pH값이 6.0 내지 8.0으로 제어되는 조건 하에 상기 S/D 바이러스 비활성화 과정을 실시한다.
제 2단계: 바이러스 비활성화 과정: 제품을 90 내지 100 ℃에서 30 내지 120 min 동안 비활성화하는 단계로서, 예를 들어 제품을 알루미늄/플라스틱 포장하여 수욕 멸균기에 담아 90 내지 100 ℃, 30 내지 120 min 간 수욕 처리한다. 상기 수욕 멸균 방법은 방사선 조사 방식을 대체하여 바이러스를 비활성화 처리하며, DNA와 RNA 비지질함유 바이러스를 비활성화하는 효과를 얻을 수 있다.
제 2단계의 바이러스 비활성화 과정에서, 90 내지 100 ℃, 30 내지 120 min 의 비활성화 조건은 콜라겐과 생장인자의 생물 활성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제 2단계의 바이러스 비활성화 과정에서, 콜라겐 용액에 아미노산, 당과 알부민을 함유하는 보호제를 첨가하였다. 획득된 복합 콜라겐 스폰지가 더욱 부드럽고, 탄성력이 더욱 커지게 하기 위해, 상기 보호제에 적량의 글리세린을 첨가할 수도 있다.
상기 보호제에 사용되는 아미노산 또는 아미노산염은 루이신, 이소루이신, 글리신, 알라닌 및 세린 중에서 선택되는 적어도 하나 또는 두 종류의 아미노산 또는 아미노산염이다. 콜라겐 용액에 첨가되는 아미노산 또는 아미노산염의 최종농도는 일반적으로 2.0 내지 22 mg/ml, 바람직하게는 2.5 내지 15 mg/ml이다.
상기 보호제에 사용되는 당은 포도당, 락토오스, 수크로오스, 푸코오스 및 만니톨에서 선택된 적어도 하나 이상의 당이다. 콜라겐 용액에 첨가되는 당의 최종농도는 일반적으로 2.5 내지 35 mg/ml, 바람직하게는 3.0 내지 15 mg/ml이다.
상기 보호제에 글리세린이 함유되는 경우, 콜라겐 용액에 첨가되는 글리세린의 최종농도는 일반적으로 1.0 내지 15 mg/ml이다.
제품을 임상에 응용할 경우, 상기 보호제에 사용되는 알부민은 인간혈청 알부민인 것이 가장 바람직하다. 콜라겐 용액에 첨가되는 인간혈청 알부민의 최종농도는 2 mg/ml 이거나 또는 2 mg/ml 이상이며, 상한은 15 mg/ml이다.
본 발명 중의 콜라겐은 동물피부에서 추출되며, 제품을 임상에 응용할 경우, 돼지피부로부터 추출한 I형 콜라겐을 채택하는 것이 가장 바람직하다. 조제된 복합 콜라겐 스폰지 용액 중, 콜라겐의 함량은 일반적으로 30 mg/ml 이상이며, 섬유세포 생장인자의 농도는 일반적으로 400 내지 3000 U/ml이다.
S/D 바이러스 비활성화 방법은 일반적으로 혈액 제품에 적용된다. 혈액제품에 유기용제 및 오염제거제(Solvent 및 Detergent)를 첨가하는 방법으로 지질함유 바이러스를 비활성화하는 것은 통상적으로 이용되는 방법이며, 사용되는 유기용제 및 오염제거제는 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트이다. 그러나 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트는 어느 정도의 부작용이 있기 때문에, 후속되는 콜라겐 정제 과정에서, 폴리소르베이트 80의 잔류량을 100μg/ml 미만으로, 트리부틸포스페이트의 잔류량을 10μg/ml 미만으로 제어해야 한다.
본 발명에서는, 2회의 염석 및 크로마토그래피 정제 과정을 통해 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트를 효과적으로 제거하여, 폴리소르베이트 80의 잔류량이 10μg/ml 미만이고, 트리부틸포스페이트의 잔류량이 2μg/ml 미만이도록 할 수 있다.
콜라겐의 항원성은 주로 콜라겐 분자사슬 말단의 비나선형 영역, 즉 C 말단 펩타이드와 N 말단 펩타이드로부터 얻어진다. 본 발명은 펩신을 통해 분자사슬 말단의 비나선형 영역을 분해시킨 다음, 추출 정제를 통해 말단 펩타이드를 제거하여 콜라겐 스폰지 제조용 고순도 콜라겐을 획득한다. 염석 정제를 실시할 때, 사용되는 염화나트륨 수용액의 농도는 2.0 내지 3.5 mol/L이고, 바람직한 농도는 2.0 내지 2.5 mol/L 이며, 0 내지 4 에서 4 내지 12 시간(h) 동안 유지시킨다. CM52 양이온교환 크로마토그래피로 정제할 경우, pH = 3.5 내지 4.5이고, 농도가 0.2 내지 0.8 mol/L인 염화나트륨 수용액으로 기울기 용리를 실시하며, 바람직하게는 염화나트륨 함유 농도가 0.2 mol/L, 0.4 mol/L, 0.6 mol/L인 0.1 mol/L의 pH 4.5인 아세트산나트륨 수용액으로 기울기 용리를 실시한다. SDS-PAGE 전기영동 검출을 거쳐, 본 발명의 콜라겐은 완전한 삼중 나선형 구조를 구비하며, 완전한 생물 활성을 유지할 뿐만 아니라, 검출을 통해 계산된 콜라겐의 순도는 96%(W/W) 이상, 심지어 99.0 % 이상에 달하여, 종래의 정제 방법으로 추출한 저순도 콜라겐에 야기되는 면역원성 반응 문제를 방지하였다.
제품을 동결 건조시킬 때, 먼저 -40 내지 -45 ℃에서 3 내지 5 h 동안 냉동한 다음, 진공 건조를 실시하되, 진동도가 20 Pa를 초과하지 않도록 제어하고, 제품의 온도 상승 속도를 제어하여, 10 내지 15 h 내에 제품 온도를 20 ℃까지 높이고 20 내지 25 ℃에서 2 내지 5 h 동안 유지시키며, 동결건조를 거친 제품의 수분을 5 % 이내로 제어하여 생물인자의 활성을 보장한다.
구체적으로, 본 발명의 복합 콜라겐 스폰지의 제조 단계는 다음과 같다:
단계 1: 원료 선별 및 탈지 처리:
검역 검사를 통과한 신선한 포유동물의 결합조직 또는 돼지피부를 원료로 취하여 처리하는 단계로서, 그 공정은 다음과 같다: 칼로 돼지피부로부터 털과 내측의 유지를 제거한 후, 처리 후의 돼지피부를 덜어 스테인리스 용기에 담고, 돼지피부 원료와 10 내지 35 %(W/W)(바람직하게는 25 %)의 탄산나트륨 수용액을 1:1 내지 10의 중량비(바람직하게는 1:5)에 따라, 탄산나트륨 수용액을 첨가하고 20 내지 60 min(바람직하게는 20 min) 동안 침지시키며, 5분마다 1회 교반한다. 침지 후 건져내어 정제수로 10회 세척한다. 수분을 깨끗이 제거하고, 스테인리스 커터로 원료 상의 유지 또는 모낭 등 이물질을 깨끗이 긁어낸다.
단계2: 분쇄 공정: 단계 1에서 처리한 돼지피부를 덜어, 파쇄기를 이용하여 스트립 형태로 자른 후, 저온분쇄기로 0.2 내지 0.5 cm2의 블록형태로 잘라, 스테인리스 용기에 담고, 75 %의 에탄올 용액에 20 min간 침지시킨 후 건져내어, 정제수로 10회 반복 세척한 다음, 냉각 후의 주사용수로 5회 반복 세정하고 건조시킨다.
단계 3: 효소분해 공정: 1: 5 내지 30의 중량비로 단계 2에서 처리한 돼지피부 원료를 0 내지 4 ℃의 주사용수에 투입하여(예를 들어 돼지피부와 물의 비율은 1kg: 10kg) 균일하게 혼합한 후, 연동펌프를 이용하여 콜로이드 분쇄기에 투입하고, 콜로이드 분쇄기는 미리 냉각순환 시스템을 가동시켜 온도를 0 내지 4 ℃로 제어하여 균질화를 실시한다. 균질 현탁액을 효소분해탱크로 옮겨 담고, 1.0 M의 초산수용액을 천천히 적가하여 pH값을 2.5 내지 3.5, 바람직하게는 2.5로 조절한다. 펩신을 첨가하고(단계 2의 원료 1kg당 5g 내지 10g의 펩신 첨가), 효소분해 온도를 10 내지 20℃ 사이로 제어하여 20 내지 24 h 동안 효소분해하며, 이때 효소분해액은 점성이 있고, 균일한 펩타이드 형태의 유동체이다.
단계 4: 펩신 비활성화: 단계 3에서 처리된 효소분해액에 중량비가 20%인 수산화나트륨 수용액을 천천히 투입하여 pH값을 9.0으로 조절하고, 0 내지 4 ℃에서 10 h 동안 유지시킨 다음, 1.0 M의 초산수용액으로 pH값을 6.5로 조절한다.
단계 5: 여과: 단계 4에서 처리된 효소분해액에 주사용수를 투입하고(효소분해액과 주사용수는 중량비가 1:1 내지 10인 비율로 희석한다), 혼합하여 콜라겐 농도가 30 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 30 mg/ml이 되도록 하고, 구경이 40μm인 필터 엘리먼트로 예비여과한 다음, 구경이 1.0μm인 필터 엘리먼트로 정밀여과하여 바이러스 비활성화 전용용기에 담는다.
단계 6: S/D 바이러스 비활성화 공정: 50 내지 200 rpm으로 연속 교반하는 상태에서, 단계 5에서 처리된 용액에 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이스가 함유된 수용액을 천천히 투입하고 균일하게 교반하여, 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1%(중량백분비), 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3%(중량백분비)에 이르도록 한 후, 24 내지 26 ℃에서 6 내지 8h, 바람직하게는 6h 동안 바이러스를 비활성화한다.
단계 7: 염석 공정: 단계 6에서 처리된 용액에 염화나트륨을 첨가하고, 이와 동시에 100 내지 500rpm의 회전속도로 교반기로 교반하여, 염화나트륨의 최종농도가 2.0 내지 2.5 mol/L, 바람직하게는 2.5 mol/L에 이르도록 하고, 0 내지 4 ℃에서 4h 동안 유지시킨다. 연속냉동원심분리기로 14000 내지 16000 rpm으로, 0 내지 4 ℃로 60 내지 30 min 동안 원심분리하여 상청액을 제거한다. 침전물: 0.3 M의 초산수용액의 중량비 = 1 : 10 내지 15인 비율에 따라, 침전물을 취하여 0.3 M의 초산수용액을 첨가하고, 고르게 교반하여 침전물을 완전히 용해시킨 다음 염화나트륨을 투입하여, 염화나트륨의 최종농도가 2.05 내지 2.5 mol/L, 바람직하게는 2.5 mol/L에 이르도록 한 후, 원심분리하여 콜라겐 침전을 획득한다.
단계 8: 탈염 공정: 콜라겐 침전과 95%의 냉에탄올 중량비 = 1 : 3 내지 8인 비율에 따라, 단계 7에서 획득된 콜라겐 침전물에 95%의 냉에탄올을 첨가하고 고르게 교반한 후, 8000 rpm으로, 0 내지 4 ℃에서 30 min 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고 침전물을 수집하며, 1회 반복한다. 콜라겐 침전물 : 아세트산나트륨 용액의 중량비 = 1 : 8 내지 20인 비율에 따라, 콜라겐 침전물에 0.1 mol/L의 pH 4.5인 아세트산 용액을 첨가하고 고르게 교반한 다음, 필터 엘리먼트 구경이 0.45μm인 필터로 여과하고, CM 양이온 크로마토그래프 정제 공정으로 전입한다.
단계 9: CM52 양이온교환 크로마토그래프 정제 공정: CM52 양이온교환 수지가 담긴 제조 크로마토그래프 칼럼(10×10 CM)에서 0.1 mol/L의 pH 4.5인 아세트산나트륨 완충액으로 10개의 칼럼부피를 균등 처리한 다음, 샘플을 투입하며, 샘플 투입 속도는 20.0 내지 30.0 ml/min, 바람직하게는 23.0 ml/min이며, 각각 염화나트륨 함유 농도가 0.2 mol/L인 0.1 mol/L의 pH 4.5 아세트산나트륨 수용액과 염화나트륨 함유 농도가 0.4 mol/L인 0.1 mol/L의 pH 4.5 아세트산나트륨 수용액으로 용리하고, 피크가 나타나기 시작할 때 단백질 용리액을 수집한 다음, 0.6mol/L의 염화나트륨을 함유한 0.1 mol/L의 pH 4.5 아세트산나트륨 수용액으로 5개의 칼럼부피를 용리시키며, 검출 파장은 215 nm이다.
단계 10: 초여과 공정: 수집된 콜라겐 용리액을 구경이 10 kD이고, 막 면적이 4 m2인 횡류초여과기(Millipore)로 초여과하여 농축 탈염 처리를 실시하며, 먼저 원 부피의 1/3까지 농축한 다음, 2/3의 주사용수로 보충하고, 다시 원 부피의 1/3까지 농축하고, 2/3의 주사용수로 보충한 다음, 원 부피의 1/3까지 농축하며, 농축 과정에서 초여과기의 주입구 압력을 0.15 Mpa 미만으로 하여 콜라겐 보류액을 수집한다.
단계 11: 배합 제조 공정: 단계 10에서 획득된 콜라겐 용액의 농도를 40 내지 70 mg/ml로 조절하며, 표 1의 배합 방법에 따라 1000 ml의 복합 콜라겐 스폰지 용액을 제조한다.
단계 12: 여과 제균 공정: 제조된 용액을 순서대로 재질이 폴리에테르설폰이고, 구경이 0.45μm 및 0.22μm인 필터 엘리먼트(PALL)가 장착된 필터로 여과한다.
단계 13 냉동건조 공정: 단계 12에서 처리된 용액을 규격이 15cm×5cm인 스테인리스 금형에 주입하고, 액체를 37 ml씩 나누어 담은 후, 냉동건조기에 넣고 냉동 건조시키며, 저온 냉동건조방법을 통해 용액 중의 수분을 제거하고, 먼저 -40 ℃에서 4h 동안 냉동시키고, 다시 진공 건조시키되, 진공도는 20 Pa를 넘지 않도록 제어하고, 제품 온도 상승 속도를 제어하며, 15 시간 내에 제품의 온도를 20 ℃까지 상승시킴과 아울러 25 ℃에서 4h 동안 유지시킨다.
단계 14: 2회 바이러스 비활성화 공정: 냉동건조 후의 제품을 알루미늄/플라스틱 포장기를 이용하여 포장한 다음, 수욕 멸균기에 넣어 수욕으로 바이러스를 비활성화한다. 바이러스의 비활성화가 완료되면 제품을 2 내지 8℃의 조건 하에 빛을 차단하여 보관한다.
실시예 1-3
아래 표1에 열거된 조건에 따라 상기 복합 콜라겐 스폰지의 제조 단계를 실시하여 샘플 1-3을 획득한다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3
단계 1
돼지피부(kg) 0.5 1.5 2.5
탄산나트륨 수용액 농도(중량%) 10% 25% 30%
돼지피부와 탄산나트륨 수용액의 중량비 1:1 1:5 1:10
시간(분) 20 40 60
단계 3
돼지피부와 주사용수의 중량비 1:5 1:10 1:30
초산으로 pH값 조절 2.5 3.0 3.5
펩신 첨가량 1:0.005 1:0.008 1:0.01
효소분해 온도℃ 10 15 20
효소분해 시간(시간) 24 22 20
단계 5
효수분해액과 주사용수의 중량비 1:10 1:5 1:1
콜라겐 농도 40 45 60
단계 6
11%의 폴리소르베이트 80 첨가 최종농도 1% 1% 1%
3.3%의 트리부틸포스페이트 수용액의 최종농도 0.3% 0.3% 0.3%
바이러스 비활성화 온도℃ 24 25 26
바이러스 비활성화 시간(시간) 6 7 8
단계 7
염화나트륨 첨가 최종농도 2.0 2.0 2.5
원심분리 속도 14000 15000 16000
원심분리 시간 60 50 30
침전물과 0.3M 초산수용액의 중량비 1:10 1:12 1:15
단계 8 콜라겐침전과 95% 에탄올의 중량비 1:3 1:5 1:8
콜라겐 침전물과 0.1mol/L의 아세트산나트륨 용액의 중량비 1:8 1:10 1:20
단계 9
샘플 투입 속도ml/min 20.0 23.0 30.0
농도 0.2,
0.4,
0.6		 0.2,
0.4,
0.6		 0.2,
0.4,
0.6
기울기용리의 염화나트륨 용액 농도 4.5 4.5 4.5
단계 11 1000ml 용액에 각 성분을 첨가하는 양
콜라겐(mg) 40000 50000 70000
성섬유세포인자(U) 3000000 1000000 400000
글리세린(mg) 1500 10000 15000
당 용량(mg) 3000 10000 15000
아미노산 용량(mg) 2500 10000 15000
20%w/v의 인간혈액 알부민 용량ml 10 40 75
단계 14
온도℃ 100 95 90
시간 min 30 60 120
획득 샘플 샘플1 샘플2 샘플3
콜라겐 순도(%) 99.0 99.4 99.6
흡수량(배) 55 60 58
탄성계수(N/cm) 75 80 78
실시예 1의 보호제로 사용되는 아미노산은 글리신이고, 당은 수크로오스이며; 실시예 2의 보호제로 사용되는 아미노산은 중량비가 1:1인 루이신과 이소루이신이고, 당은 중량비가 1:2인 포도당과 푸코오스이며; 실시예 3의 보호제로 사용되는 아미노산은 중량비가 1:1인 알라닌과 세린이고, 당은 중량비가 1:2인 락토오스와 만니톨이다.
검출 결과
(1) S/D 바이러스 비활성화 효과 검증
S/D 바이러스 비활성화 효과에 대한 검증을 실시하였다. 유행성 B형 뇌염 바이러스와 가성 광견병 바이러스를 모델 바이러스로 채택하였고, 배양세포는 BHK21세포이며, 96웰 세포병변법을 이용하여, Karber법으로 계산하였다. 결과는 표 2와 표 3을 참조한다.
표2: 효소분해액 S/D 처리로 유행성 B형 뇌염 바이러스를 비활성화한 결과
잔여 유행성 B형 뇌염 바이러스 적정도(LgTCID50/0.1ml)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
대조샘플 6.063 6.313 6.063
처리 후 샘플 0.500 0.500 0.500
바이러스 감소량 5.563 5.813 5.563
결과:실시예 1의 바이러스 감소량≥5.563 LgTCID50/0.1ml
실시예 2의 바이러스 감소량≥5.813 LgTCID50/0.1ml
실시예 3의 바이러스 감소량≥5.563 LgTCID50/0.1ml
표 3: 효소분해액 S/D 처리로 가성 광견병 바이러스를 비활성화한 결과
잔여 가성광견병 바이러스 적정도(LgTCID50/0.1ml)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
대조샘플 5.563 5.313 4.875
처리 후 샘플 0.500 0.500 0.500
바이러스 감소량 5.063 4.813 4.375
결과:실시예 1≥5.063 LgTCID50/0.1ml
실시예 2≥4.813 LgTCID50/0.1ml
실시예 3≥4.375 LgTCID50/0.1ml
검증 결과, 콜라겐 용액은 S/D 처리를 거친 후, 모델 바이러스의 비활성화량이 4logs 이상으로 안전성 요구에 부합되는 것으로 나타났다. 즉 단백질 농도를 30 내지 70 ml/ml, pH 값을 6.5 내지 7.5로 제어하는 조건 하에, 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3중량%에 이르도록 하고, 24 내지 26℃에서 6h 내지 8h 동안 바이러스 비활성화한 결과는 유효하였다.
(2) 바이러스를 수욕으로 비활성화시킨 후, 샘플을 취하여 비활성화 효과 검증을 하였다. 유행성 B형 뇌염 바이러스, 가성 광견병 바이러스와 돼지 파보바이러스를 모델 바이러스로 채택하였고, 배양세포는 BHK21세포이며, 96웰 세포병변법을 이용하여 Karber법에 따라 계산하였다. 결과는 표 4, 표 5, 표 6을 참조한다.
표 4: 유행성 B형 뇌염 바이러스를 수욕으로 비활성화한 결과
잔여 유행성 B형 뇌염 바이러스 적정도(LgTCID50/0.1ml)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
대조샘플 5.438 5.688 5.563
처리 후 샘플 0.500 0.500 0.500
바이러스 감소량 4.938 5.188 5.063
결과:실시예 1≥4.938 LgTCID50/0.1ml
실시예 2≥5.188 LgTCID50/0.1ml
실시예 3≥5.063 LgTCID50/0.1ml
표 5: 가성광견병 바이러스를 수욕으로 비활성화한 결과
잔여 가성광견병 바이러스 적정도(LgTCID50/0.1ml)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
대조샘플 5.063 5.563 5.688
처리 후 샘플 0.500 0.500 0.500
바이러스 감소량 4.563 5.063 5.188
결과:실시예 1≥4.563 LgTCID50/0.1ml
실시예 2≥5.063 LgTCID50/0.1ml
실시예 3≥5.188 LgTCID50/0.1ml
표 6: 돼지 파보바이러스를 수욕으로 비활성화한 결과
잔여 돼지 파보바이러스 적정도(LgTCID50/0.1ml)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
대조샘플 5.313 5.250 5.625
처리 후 샘플 0.500 0.500 0.500
바이러스 감소량 4.813 4.750 5.125
결과:실시예 1≥4.183 LgTCID50/0.1ml
실시예 2≥4.750 LgTCID50/0.1ml
실시예 3≥5.125 LgTCID50/0.1ml
검증 결과, 샘플을 수욕 비활성화 처리를 거친 후, 모델 바이러스의 비활성화량이 4logs 이상으로, 안전성 요구에 부합되는 것으로 나타났다.
(3) 콜라겐 순도 검출
콜라겐을 크로마토그래프로 정제한 후 샘플을 취하여 콜라겐 순도 검출을 실시하였다. 동일한 질량 농도의 콜라겐 대조품, 크로마토그래프 정제 샘플, 크로마토그래프 정제를 거치지 않은 샘플을 제조하여, 샘플처리액과 혼합하고, 비등수욕에서 5min 동안 가열하여, 농축겔 5%, 분리겔 10%를 전기영동한 후, 쿠마씨 브릴리언트 블루 R250으로 염색하고, 7.5%의 초산 및 5%의 메탄올로 탈색하였다. 샘플 투입량은 10 μl이며, I형 콜라겐 대조품은 Sigma사에서 구입하였다. 콜라겐을 크로마토그래프로 처리한 후 전기영동 분석을 거친 결과, 대조품과 비교하여 스펙트럼 띠가 일치하는 전형적인 I형 콜라겐이었으며, 또한 기타 이물 띠가 없어, 추출한 샘플의 순도가 높음을 나타내었다. 전기영동도는 도 1을 참조한다. 도 1 중의 a는 표준 상대분자질량 Marker이고, b는 콜라겐 표준샘플을 나타내며, c는 본 발명의 실시예 2로 획득된 콜라겐 샘플을 나타낸다.
(4) 콜라겐 함량 검출
켈달측정법으로 총단백질을 검출한 다음, Woessener법으로 가수분해액 중 히드록시프롤린의 함량을 측정하였다. 공식 M1-M0/14%에 따라 콜라겐 함량을 계산한 후, 총 단백과 비교하여 콜라겐 순도를 계산하였다. 본 발명의 실시예 2의 콜라겐 함량은 대조품의 함량 이상이었으며, 이는 순도가 매우 높음을 설명해준다. 결과는 표 7을 참조한다.
표 7: 콜라겐 함량 검출 결과
크로마토그래프 정제 전 크로마토그래프 정제 후 대조품
콜라겐 91.5%(m/m) 99.4%(m/m) 99.0%(m/m)
(5) 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트의 잔류량
크로마토그래프 정제 후, 샘플을 취하여 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트의 잔류량을 검출하여 제거 효과의 유효성을 확인하였다.
폴리소르베이트 80 중의 폴리에톡실레이티드(Polyethoxylated) 및 암모늄코발트 티오시아네이트 반응에 따라 형성된 청색 복합물은 디클로로메탄에 용해되며, 비색법으로 620nm 부위에서 폴리소르베이트 80을 측정하였다. 폴리소르베이트 80 대조품은 CASRestry Nμmber: 9005-65-6(미국 USP 약전 표준)이다. 기체상 크로마토그래프 측정법을 사용하여 시료 중의 트리부틸포스페이트 잔류량을 측정하였다. 트리부틸포스페이트 대조품은 CASRestryNμmber: 126-73-8(유럽 EP 약전 표준품)이며, 크로마토그래프 측정기는 Shimadzu GC-14C이고, 산변성 폴리에틸렌글리콜 모세관 칼럼, 화염이온화 검출기를 이용하였으며, 샘플 투입량은 0.1μl이다. 결과, 크로마토그래프 정제 후 제품 중 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트의 잔류량이 매우 낮아 안전 요구에 부합되는 것으로 나타났다. 검출 결과는 표 8을 참조한다.
표 8: 크로마토그래프 정제 후 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트의 잔류량 검출 결과
조 성 폴리소르베이트 80(μg/ml) 트리부틸포스페이트(μg/ml)
실시예 1 5 미검출
실시예 2 6 미검출
실시예 3 3 미검출
(6) 수욕 비활성화 전후의 FGF 활성 변화
실시예 1과 동일한 방법을 채택하되, 단지 복합 콜라겐 스폰지의 조성은 표 9에 도시된 바와 같이, 샘플 4, 5와 6만 획득하였다.
세포증식법/MTT 비색법으로 섬유세포 생장인자(FGF)를 검출하였다. 세포는 NIH3T3이고, 섬유세포 생장인자는 NIH3T3 세포의 생장에 대하여 자극 작용이 있어, NIH3T3 세포의 생장 상황이 섬유세포 생장인자의 생물활성이 다름에 따라 상이하였으며, 이로써 섬유세포 생장인자의 활성을 검출하였다. FGF 표준 샘플은 중국약품생물제품감정소에서 구입하였고, NIH3T3 세포는 중국 과학원 전형 배양물 위원회 세포은행에서 구입하였다. 검출 결과는 표 10, 표 11을 참조한다.
검출 결과, Co60으로 10kG 조사 시 FGF의 활성에 대한 손상이 비교적 컸으며, Co60으로 10kG 조사한 경우를 100℃, 30min과 비교하여, 데이터를 SPSS 소프트웨어 처리한 결과, P<0.01로서, 비교가능성을 가지는 것으로 나타났다.
실시예 1과 동일한 방법으로 콜라겐 스폰지를 제조하되, 단지 섬유세포 생장인자의 첨가량만 달리하여 샘플 7, 8을 획득하고, 샘플 4와 장기간 안정성 고찰 실험을 실시하한 결과, 배합 중 아미노산, 알부민, 당과 글리세린을 보호제로 첨가하였을 때 제품의 유효기간 내의 생물활성을 효과적으로 보장할 수 있었다.
표 9: 복합 콜라겐 스폰지의 조성
조 성 샘플 4 샘플 5 샘플 6
콜라겐 35.0 mg/ml 30.0 mg/ml 32.0 mg/ml
FGF 3000 U/ml 3000 U/ml 3000 U/ml
글리세린 1.5 mg/ml 1.5 mg/ml 1.5 mg/ml
수크로오스 3.0 mg/ml 3.0 mg/ml 3.0 mg/ml
만니톨 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml ----
인간혈청 알부민 2.0 mg/ml ---- ----
표 10: FGF 활성 검출 결과
샘플 4 샘플 5 샘플 6
비활성화 전 비활성화 후 비활성화 전 비활성화 후 비활성화 전 비활성화 후
Co60으로
10kG 조사		 1500 U/cm2 1200 U/cm2 1450 U/cm2 1250 U/cm2 1500 U/cm2 1280 U/cm2
100℃,
30min		 1500 U/cm2 1460 U/cm2 1450 U/cm2 1380 U/cm2 1500 U/cm2 1390 U/cm2
표 11: 섬유세포 생장인자의 장기간 안정성 검출 결과
조 성 1월 6월 12월 24월 수율%
샘플 4 1500 U/cm2 1450 U/cm2 1420 U/cm2 1390 U/cm2 92.67
샘플 7 1480 U/cm2 1420 U/cm2 1380 U/cm2 1360 U/cm2 91.89
샘플 8 1420U/cm2 1400 U/cm2 1350 U/cm2 1300 U/cm2 91.54
(7) 흡수력 대비
실시예 1, 2, 3으로 획득된 샘플 1, 2, 및 3의 흡수력을 검출하고 대조샘플과 비교하였으며, 스폰지 1매를 취하여 정밀하게 무게를 재고(0.1mg까지 정확하게), 20℃의 정제수에 침지시켜 가볍게 주물러 파손되지 않도록 하면서 수분을 충분히 흡수하게 한 다음, 소형 핀셋으로 가볍게 모서리를 집어 수면에 2분 동안 머무르게 한 후 무게를 재고, 콜라겐 스폰지 질량과 비교하였다. 검출 및 대비 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
도 2에서, Y축은 수분 흡수량(질량/질량)이고, 대조 1은 미국약전(USP32-NF27) 중 흡수성 젤라틴 스폰지의 흡수량 표준이며, 대조 2는 중국특허 CN101279104의 실시예 1에 따라 제조된 콜라겐 스폰지이고, 대조 3은 중국 특허 CN1915437의 실시예에 따라 제조된 콜라겐 스폰지이다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 복합 콜라겐 스폰지의 흡수량은 모두 52배 이상이며, 종래 기술로 제조된 콜라겐 스폰지와 기존 콜라겐 스폰지는 본 발명의 흡수량에 미치지 못하였다.
(8) 탄성계수 대비
시료 양단을 각각 인장력 시험기의 클램프에 고정시키고, 시험기가 일정한 속도로 분리되도록 가동시켜 시료가 파괴될 때까지 시료를 당겨 시료에서의 응력 변화를 측정하였다. 검출 및 대비 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 도 3 중 Y축은 탄성계수(N/cm)이고, 대조 4는 CN1487967A에 공개된 방법으로 제조된 콜라겐 스폰지이다. 도 3을 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 샘플은 70.0 N/cm 이상의 탄성계수를 가지며, 종래 기술로 제조된 콜라겐 스폰지는 50.0 N/cm 미만이다.

Claims (9)

  1. 콜라겐과 세포 생장인자를 포함하며, 질량대비 수분 흡수량은 52배 이상이고, 탄성계수는 70.0 N/㎝보다 크고, 그리고 복합 콜라겐 스폰지에 대하여, 함량이 10중량% 내지 50 중량%이고, 중량비가 1 내지 11 : 1.25 내지 17.5 : 1 내지 7.5인 아미노산, 당 및 알부민을 함유하는 보호제를 더 포함하며, 상기 아미노산은 루이신, 이소루이신, 글리신, 알라닌 및 세린 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이고, 상기 당은 포도당, 락토오스, 수크로오스, 푸코오스 및 만니톨에서 선택된 적어도 하나 이상의 당인 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 보호제는 글리세린이 더 첨가된 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지.
  3. 콜라겐, 세포 생장인자 및 제 1항 또는 제 2항의 보호제가 함유되는 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법이,
    이온교환 크로마토그래프로 정제하는 공정을 갖는 콜라겐의 정제 단계를 포함하며, 상기 이온교환 크로마토그래프는 CM52 양이온교환수지의 제조 크로마토그래프이고, 상기 이온교환 크로마토그래프에 사용된 용리액은 염화나트륨과 아세트산나트륨을 함유한 pH4.5 용액이며, 그 용액 중 염화나트륨의 농도는 0.2mol/L 내지 0.8mol/L이고, 아세트산나트륨의 농도는 0.1mol/L인 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제조방법은 투스텝 바이러스 비활성화 과정을 갖는 바이러스 비활성화 단계를 포함하며:
    제1단계 바이러스 비활성화 과정은 오염제거제 및 유기용제의 바이러스 비활성화 과정이고;
    제2단계 바이러스 비활성화 과정은 90℃ 내지 100℃에서 복합 콜라겐 스폰지 용액을 30분 내지 120분간 수욕 처리하는 과정;인 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 오염제거제 및 유기용제는 폴리소르베이트 80 및 트리부틸포스페이트의 혼합물이며, 상기 폴리소르베이트 80 및 트리부틸포스페이트의 콜라겐 용액에의 첨가량은 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3중량%에 이르도록 한 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 콜라겐 농도가 30mg/ml 내지 70mg/ml로 유지되는 상태에서, 콜라겐 용액에 폴리소르베이트 80과 트리부틸포스페이트 혼합 멸균 수용액을 첨가하여, 폴리소르베이트 80의 최종농도가 1중량%, 트리부틸포스페이트의 최종농도가 0.3중량%에 이르도록 하고, 24℃ 내지 26℃에서 6시간 내지 8시간 동안 바이러스를 비활성화하는 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
  8. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2단계의 바이러스 비활성화 과정은, 콜라겐 용액 중에 보호제의 첨가량이 보호제를 구성하는 아미노산의 최종농도가 2.0mg/ml 내지 22mg/ml이고, 당의 최종농도는 2.5mg/ml 내지 35mg/ml이며, 알부민의 최종농도는 2mg/ml 내지 15mg/ml에 이르는 상태에서 수행되고, 상기 보호제는 중량비가 1 내지 11 : 1.25 내지 17.5 : 1 내지 7.5인 아미노산, 당 및 알부민을 포함하며, 상기 아미노산은 루이신, 이소루이신, 글리신, 알라닌 및 세린 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이고, 상기 당은 포도당, 락토오스, 수크로오스, 푸코오스 및 만니톨에서 선택된 적어도 하나 이상의 당인 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 보호제는 콜라겐 용액에 최종농도가 1.0mg/ml 내지 15ml/ml가 되도록 한 글리세린이 더 첨가되는 것을 특징으로 하는 복합 콜라겐 스폰지의 제조방법.
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