CN114032623B - 一种高产率胶原海绵的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,选取富含胶原的动物组织,切成片或块,形成组织片或组织块;经前处理、酶反应、粉碎、碱处理、得到的保持三股螺旋结构的胶原;然后经冻干过程制成胶原海绵。本发明的有益效果:本发明在去除端肽、弹性蛋白、灭活病毒的前提下,具有更高的提取效率,杂蛋白去除彻底,所制得的胶原纯度较高。与酸溶胶原海绵相比,本发明制备的胶原海绵具有更高的抗拉强度、胀破强度和更长的降解周期。同时,本发明工艺用水的使用量较少,反应装置的规模与其他酸或酶提取法相比较小,可大幅度节约生产场地。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白纤维,具体涉及一种用于医疗器械的高产率胶原海绵的制备工艺。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质主要成分之一,约占哺乳动物蛋白总质量的1/3,是构成皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官的主要成分,胶原具有独特的理化性质和优良的生物相容性、可降解性、低免疫性等优点,使得其在生物体内容易被吸收、亲水性强、无毒安全性好,成为生物医用材料的选择之一,一般从富含胶原纤维的动物组织进行提取,如皮肤、肌腱、骨骼等。胶原的提取方法通常有碱法、盐法、酸法、酶法,依照其溶解性,可将胶原分为:胶原纤维及酸溶性胶原、水溶性胶原等。
中国专利文献CN101569765A涉及到一种保持胶原特有三螺旋结构的Ⅰ型医用胶原材料以及提取方法,应用于组织修复方面,同时该材料具有一定的抗拉力强度,减少组织粘连,有利于组织的修复与再生。其方案如下:
前处理:牛跟腱组织经冷冻切割成0.1-3mm的薄片,在搅拌作用下将其浸泡在0.1%磷酸二氢钠/氢氧化钠溶液中1-3小时,保持中性条件。
酶反应:将1:5(w/w)的无花果酶加入上述溶液中充分反应,搅拌4h,之后用1%的硝酸铵反应6h,清洗。
盐析:加入1M的氯化钠处理并控制温度,调节酸碱度,4℃条件下静置过夜,取出后用2M氢氧化钠溶液反应,后用50%硫酸中和缓冲,使溶液呈偏酸性,取出沉淀物。
清洗:将沉淀物水洗浸泡6h后去除水分,冷冻干燥的方法制得保持胶原特有三螺旋结构的Ⅰ型医用胶原材料。
冻干成膜:将上述得到的材料溶于0.01-0.5M的冰醋酸中,得到0.5%-2%的溶液,在15000-30000rad/min、0-15℃条件下于1-8h加入0.05%-60%的氨基葡聚糖,制成复合悬浮液,经冷冻干燥后,再经物理或化学方法加强胶原分子间的链连接,通过低温环氧乙烷消毒灭菌,制成孔隙在160-350μm之间具有三维孔隙结构的膜片。
然而,上述方法得到的悬浮液并不能以很好的方式将各组分分散均匀,抗拉强度低、降解速率快。
发明内容
为了解决现有技术中提取工序周期长,规模化生产占地面积大,以及可能掺入杂蛋白等问题,本发明提供了一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,制备过程中并未破坏胶原结构,经过一系列条件处理,最终得到的是胶原纤维,采用胶原纤维制备的胶原海绵具有更高的抗拉强度、胀破强度和更长的降解周期。
本发明的目的是提供一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺。
根据本发明的具体实施方式的高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,所述制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取富含胶原的动物组织,切成片或块,形成组织片或组织块;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片或组织块浸泡在氯化钠溶液中,氯化钠溶液的浓度为0.5-1.5wt%,磁力搅拌进行第一次混合,然后水洗去除氯化钠溶液;然后向浸泡后组织中加入乙醇溶液,所述乙醇溶液的浓度为60-90wt%,磁力搅拌进行第二次混合,然后水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在酸性或弱碱性溶液中,加入10-20wt%步骤(2)得到的所述前处理组织,再加入蛋白酶进行酶解,酶解完成后中止反应;然后水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成粉碎后的动物组织;
(5)碱处理:在含有氢氧化钠和硫酸钠的溶液中,加入10-20wt%步骤(4)得到的所述粉碎后的动物组织进行反应;反应完成后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原;
(6)冻干成膜:在0.05 M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.4-0.6wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.04-0.06wt%;将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
一般的牛皮肤、跟腱等富含胶原的动物组织结构较为致密,不易打碎,本发明中先将这些组织进行切割和前处理,可去除弹性蛋白以及可使富含胶原的组织结构松散,这样更容易打碎。
步骤(3)中,酶解可以采用无花果蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶,经多次试验表明采用无花果蛋白酶对前处理组织进行酶解,酶解效果更好,得到的胶原纯度更高。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为无花果蛋白酶,在pH为5.5-6.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,加入10-20wt%所述前处理组织,再加入所述前处理组织0.1-2wt%的无花果蛋白酶,在25-37℃磁力搅拌反应0.5-5h,反应完成后加入亚氯酸钠、硝酸铵、双氧水中的一种或几种组合,在25℃-37℃下反应0.5-2h,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为胃蛋白酶,在pH为2.5-4.5的酸性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胃蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入0.5-10M氢氧化钠中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。优选的,先用浓的碱溶液(10 M氢氧化钠)进行中和,快接近所需pH时,再用稀的碱溶液(0.5 M氢氧化钠)进行中和至pH为5.0,减少水的用量。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶,在pH为7.5-7.8的弱碱性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胰蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入1M盐酸溶液中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
一般终止酶反应采用高温灭酶的方法,本发明中若采用高温会让胶原变性。采用pH值变化不足以终止无花果蛋白酶反应,因此,加入亚氯酸钠、硝酸铵、双氧水中的一种或几种组合终止酶反应效果更好。进一步的,步骤(3)中,若酶解组织中只加入亚氯酸钠,则所述亚氯酸钠的添加量为所述前处理组织的0.05-0.5wt%;若酶解组织中只加入硝酸铵,则所述硝酸铵的添加量为所述前处理组织的1-10wt%;若酶解组织中只加入双氧水,则所述双氧水的添加量为所述前处理组织的1-10wt%。酶解过程可有效去除弹性蛋白。同时,酶反应阶段的另两个替代方案也可有效去除弹性蛋白,不会对胶原纤维的结构发生破坏。
进一步的,步骤(1)中,所述动物富含胶原的组织为牛或猪的皮肤、跟腱。
优选的,将所述动物富含胶原的组织切成0.3-1.5mm厚的薄片或0.3-1.0mm的立方小块。
进一步的,步骤(2)中,所述组织片或组织块浸泡在0.5-1.5%的氯化钠溶液中,以每克组织中加入5-10ml的氯化钠溶液的比例进行第一次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,然后水洗去除氯化钠溶液;以每克浸泡后组织中加入5-10ml浓度为60-90wt%的乙醇溶液的比例进行第二次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织。
进一步的,步骤(4)中,所述粉碎后动物组织的粒径为0-300µm。
进一步的,步骤(5)中,在含有1.0-2.0M氢氧化钠和1.0-2.0 M硫酸钠的混合溶液中,加入10-20wt%所述粉碎后动物组织,在25-37℃下反应36-72h;后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原蛋白。
碱处理阶段可以有效去除端肽并可得到病毒灭活的组织。混合溶液中氢氧化钠的浓度为1.0-2.0 M,硫酸钠的浓度为1.0-2.0 M,制备时先加硫酸钠,硫酸钠起到保护作用,没有硫酸钠溶液直接加碱溶液动物组织易变性。
进一步的,中和所用的酸为盐酸或硫酸;所用酸的浓度为0.5-10 M。
进一步的,步骤(6)中,在0.05 M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.5wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.05wt%;用均质机进行均质2h,将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
更进一步的,取步骤(5)制备的纯度高达99%的保持三股螺旋结构的胶原,并加入0.05%硫酸软骨素钠,用均质机在0.05 M醋酸溶液中混合2h。将所得的溶液倒入医用不锈钢冷冻盘中,用低温冷冻-冷凝-升华-升温的冷冻干燥的方式制成胶原海绵。本发明中醋酸的作用:胶原在酸性条件下溶胀,才能在均质后均匀分散,而醋酸在后续冻干过程中可完全挥发。本发明中硫酸软骨素钠的作用:硫酸软骨素钠是细胞外基质的主要功能组分,其本身也具有细胞相互作用,与胶原蛋白共混发生共价键结合,增强诱导组织再生能力,同时改善产品力学及抗降解性能。
冷冻干燥的步骤依次包括:
低温冷冻阶段:温度为-40℃,时间350min;
真空干燥阶段:温度为-18℃,720min,真空度为0.2bar;
第一干燥阶段:温度为-12℃,400min,真空度为0.2bar;
第二干燥阶段:温度为14℃,400min,真空度为0.2bar;
第三干燥阶段:温度为0℃,90min,真空度为0.2bar;
第四干燥阶段:温度为25℃,90min,真空度为0.2bar。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明在去除端肽、弹性蛋白、灭活病毒的前提下,具有更高的提取效率,杂蛋白去除彻底,所制得的胶原蛋白纯度较高。
(2)同时本发明动物组织或胶原蛋白占溶液的重量比决定了工艺用水的使用量以及反应装置的规模,本发明所有步骤中最低质量比与其他酸/酶提取法相比提高了近10倍,可大幅度节约生产场地。
(3)本发明所制得的胶原蛋白纯度较高,杂蛋白含量较低(<0.25%)。
与酸溶胶原海绵相比,本发明制备的胶原海绵具有更高的抗拉强度、胀破强度和更长的降解周期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示根据本发明的具体实施例3的胶原的SDS-PAGE图谱;其中line1、line3、line5为酸溶胶原;line2、line4、line6为胶原酶酶解解胶原;line7为胶原蛋白酶水溶液。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
以下实施例中采用的无花果蛋白酶均为植物提取的蛋白酶,采购自MPBiomedicals LLC;酶活≥200 Bapa U/g。
在一些较为具体的实施方案中,所述高产率胶原蛋白纤维的制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取富含胶原的动物组织,切成片或块,形成组织片或组织块;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片或组织块浸泡在氯化钠溶液中,氯化钠溶液的浓度为0.5-1.5wt%,磁力搅拌进行第一次混合,然后水洗去除氯化钠溶液,洗净形成浸泡后组织;向所述浸泡后组织中加入乙醇溶液,所述乙醇溶液的浓度为60-90wt%,磁力搅拌进行第二次混合,然后水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在酸性或弱碱性溶液中,加入10-20wt%步骤(2)得到的所述前处理组织,再加入蛋白酶进行酶解,酶解完成后中止反应;然后水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成粉碎后动物组织;
(5)碱处理:在含有氢氧化钠和硫酸钠的溶液中,加入10-20wt%步骤(4)得到的所述粉碎后动物组织进行反应;反应完成后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原;
(6)冻干成膜:在0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.4-0.6wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.04-0.06wt%;将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为无花果蛋白酶,在pH为5.5-6.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,加入10-20wt%所述前处理组织,再加入所述前处理组织0.1-2wt%的无花果蛋白酶,在25-37℃磁力搅拌反应0.5-5h,反应完成后加入亚氯酸钠、硝酸铵、双氧水中的一种或几种组合,在25℃-37℃下反应0.5-2h,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为胃蛋白酶,在pH为2.5-4.5的酸性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胃蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入0.5-10M氢氧化钠中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
进一步的,步骤(3)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶,在pH为7.5-7.8的弱碱性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胰蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入0.5-10M盐酸中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
进一步的,步骤(3)中,若酶解组织中只加入亚氯酸钠,则所述亚氯酸钠的添加量为所述前处理组织的0.05-0.5wt%;若酶解组织中只加入硝酸铵,则所述硝酸铵的添加量为所述前处理组织的1-10wt%;若酶解组织中只加入双氧水,则所述双氧水的添加量为所述前处理组织的1-10wt%。
进一步的,步骤(1)中,所述动物富含胶原的组织为牛或猪的皮肤、跟腱;优选的,将所述动物富含胶原的组织切成0.3-1.5mm厚的薄片或0.3-1.0mm的立方小块。
进一步的,步骤(2)中,所述组织片或组织块浸泡在0.5-1.5%的氯化钠溶液中,以每克组织中加入5-10ml的氯化钠溶液的比例进行第一次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,然后水洗去除氯化钠溶液;以每克浸泡后组织中加入5-10ml浓度为60-90wt%的乙醇溶液的比例进行第二次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织。
进一步的,步骤(4)中,所述粉碎后动物组织的粒径为0-300µm。
进一步的,步骤(5)中,在含有1.0-2.0M氢氧化钠和1.0-2.0M硫酸钠的混合溶液中,加入10-20wt%所述粉碎后动物组织,在25-37℃下反应36-72h;后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原。
进一步的,中和所用的酸为盐酸或硫酸;所用酸的浓度为0.5-10M。
进一步的,步骤(6)中,向所述保持三股螺旋结构的胶原中加入0.05wt%的硫酸软骨素钠,混合均匀后加入到0.05M醋酸溶液中用均质机进行均质2h,将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原蛋白海绵。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而,所选的实施例仅用于说明本发明,而不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,所述制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取猪皮,切成薄片,形成组织片;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片浸泡在浓度为1.5%的氯化钠溶液中,磁力搅拌进行第一次混合,然后水洗去除氯化钠溶液,向浸泡后组织中加入乙醇溶液,所述乙醇溶液的浓度为90wt%,磁力搅拌进行第二次混合,然后水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在pH为7.6的弱碱性溶液中,加入15wt%前处理组织,再加入所述前处理组织10wt%的胰蛋白酶,在25℃下,反应10h,反应完成后加入1M盐酸溶液中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成粉碎后动物组织;
(5)碱处理:在含有氢氧化钠和硫酸钠的溶液中,加入10wt%步骤(4)得到的所述粉碎后动物组织进行反应;反应完成后用酸中和至pH为4.0,再用清水进行清洗5次,形成保持三股螺旋结构的胶原;
(6)冻干成膜:在0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.6wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.04wt%;将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
实施例2
本实施例提供了一种高产率胶原蛋白纤维,制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取牛皮,切成长、宽均为0.3-1.5mm的薄片,形成组织块;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片浸泡在浓度为1.5%的氯化钠溶液中,以每克组织中加入10ml的氯化钠溶液的比例进行第一次混合,在25-37℃下磁力搅拌36h,然后水洗去除氯化钠溶液;以每克浸泡后组织中加入5ml浓度为60wt%的乙醇溶液的比例进行第二次混合,在25-37℃下磁力搅拌12h,水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在pH为2.5的酸性溶液中,加入15wt%前处理组织,再加入所述前处理组织10wt%的胃蛋白酶,在28℃下,反应10h,反应完成后加入1M氢氧化钠中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成0-300µm粉碎后的动物组织;
(5)碱处理:在含有2.0M氢氧化钠和1.0M硫酸钠的溶液中,加入10wt%步骤(4)得到的所述粉碎后动物组织,在25-37℃下反应72h;反应完成后用浓度为10M的盐酸溶液中和至pH为7.0,之后用0.5M的稀盐酸中和至pH为5.0,再用清水进行清洗10次,形成保持三股螺旋结构的胶原,碱处理阶段可以有效去除端肽并可得到病毒灭活的组织;
(6)冻干成膜:在100ml 0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.4wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.06wt%;用均质机进行均质2h,将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
实施例3
本实施例提供了一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,所述制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取牛跟腱,切成0.3-1.0mm的立方小块,形成组织块;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片或组织块浸泡在1.0%的氯化钠溶液中,以每克组织中加入10ml氯化钠溶液的比例进行第一次混合,在25-37℃下磁力搅拌24h,然后水洗去除氯化钠溶液,每克浸泡后组织中加入10ml浓度为75wt%的乙醇溶液进行第二次混合,在25-37℃下磁力搅拌24h,水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,加入15wt%步骤(2)得到的所述前处理组织,再加入1.0wt%无花果蛋白酶进行酶解,在25-37℃磁力搅拌反应3h,清水洗净,形成酶解组织;然后加入双氧水,双氧水的添加量为所述前处理组织的5%,在25℃-37℃下反应1h,中止反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成0-300µm的粉碎后动物组织;
(5)碱处理:在含有1.5M氢氧化钠和1.5M硫酸钠的溶液中,加入6wt%步骤(4)得到的所述粉碎后动物组织,在25-37℃下反应48h;反应完成后用浓度为10M的盐酸溶液中和至pH为6.5,之后用1M的硫酸溶液中和至pH为4.5,再用清水进行清洗8次,形成保持三股螺旋结构的胶原,碱处理阶段可以有效去除端肽并可得到病毒灭活的组织;
(6)冻干成膜:在0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.5wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.05wt%;用均质机进行均质2h,将均质后所得的溶液倒入医用不锈钢冷冻盘中,用低温冷冻-冷凝-升华-升温的冷冻干燥的方式制成胶原海绵。
冷冻干燥的步骤依次包括:
低温冷冻阶段:温度为-40℃,时间350min;
真空干燥阶段:温度为-18℃,720min,真空度为0.2bar;
第一干燥阶段:温度为-12℃,400min,真空度为0.2bar,
第二干燥阶段:温度为14℃,400min,真空度为0.2bar;
第三干燥阶段:温度为0℃,90min,真空度为0.2bar;
第四干燥阶段:温度为25℃,90min,真空度为0.2bar。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于:无花果蛋白酶的添加量不同,本实施例无花果蛋白酶的添加量为所述前处理组织的0.1wt%。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于:无花果蛋白酶的添加量不同,本实施例无花果蛋白酶的添加量为所述前处理组织的2wt%。
对比例1
本对比例提供了一种高产率胶原蛋白纤维的制备工艺,本对比例的参考文献:胃蛋白酶提取猪皮胶原的研究,所述制备工艺包括以下步骤:
(1)预处理与浸酸:称取干燥皮块(M0约5g),用pH7.4的Tris-HCl缓冲液(质量比1:20)浸泡2h,4℃保存,间隔搅拌;2h后倒去清液,加入一定量的0.5M的HAC溶液调节溶液pH值,静置浸泡2h;
(2)酶解:将步骤(1)得到的溶液准确加入4%的胃蛋白酶(1∶3000),连续搅拌26h。
(3)盐析:将步骤(2)得到的溶液离心分离(8000r/min,15min),小心吸取上清液,用氢氧化钠溶液调pH值为7.50左右,以(NH4)2SO4最终浓度为1.5mol/L,缓慢加入,搅拌使之溶解,静置过夜。
(4)酸解:将步骤(3)在步骤(2)离心的条件下进行离心,取沉淀,加入0.5M HAC溶液,在4℃下搅拌30min,得到胶原蛋白溶液母液。
(5)透析与干燥:将步骤(4)得到的溶液倒入透析分子质量为8~10KDa的透析袋中,先用0.04mol/L和0.02mol/L Na2HPO3溶液透析2d,然后用蒸馏水透析3d,将试样冷冻干燥,后密封。
将本发明实施例3的制备过程中的用水量和对比例1制备过程中的用水量进行比较,结果如表1。
表1 实施例3用水量与对比例1用水量比较
从表1结果中得知,实施例3每步用水量相较于对比例每步用水量都少,同时,实施例3所有步骤中最低质量比与对比例1相比高了近10倍,大幅度节约生产场地和工艺用水量,说明本发明的高产率胶原蛋白纤维的制备工艺更加节能,生产成本更低。
性能测试试验
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对本发明3个实施例步骤(5)得到的胶原进行分子量及杂蛋白含量的测定,结果如图1所示。
胶原相对分子质量的测定方法有很多种,但应用较多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳法,同时用胶原蛋白酶可以特异性地水解天然胶原的三股螺旋结构,检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白含量。通过考马斯亮蓝对牛血清白蛋白(BSA)染色极限的确定,检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白总量。具体可参考YY0954。图1是根据本发明的实施例3-5所制备得到的胶原的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)图。
样品中杂蛋白分析:Marker为一系列的已知相对分子质量的标准胶原蛋白样品,样品a:分别用3%的乙酸溶解本发明实施例3-5所制备的胶原样品,溶液的浓度为1mg/mL,分别命名为Line1(实施例3)、line3(实施例4)、line5(实施例5);样品b:超纯水溶解胶原蛋白酶得到胶原蛋白酶浓度水溶液,胶原蛋白酶水溶液的浓度为0.05mg/mL,分别取本发明实施例3-5所制备的胶原样品1mg,分别加入到1mL胶原蛋白酶水溶液,得到胶原样品溶液的浓度均为1mg/mL,于37℃水浴作用4h,分别命名为line2(实施例3)、line4(实施例4)、line6(实施例5);样品c:超纯水溶解胶原蛋白酶,其浓度与样品b中的浓度相同,胶原蛋白酶水溶液的浓度为0.05mg/mL,命名为line7。
纯度计算:当B-C≠0时,样品中胶原蛋白纯度(%)=A-(B-C);当B-C=0时,样品中胶原蛋白纯度(%)=(10000-BSA极限值)/100,(经检测,本预制胶的BSA极限值为20)。
A为样品a所有条带光密度之和,%;
B为样品b所有条带光密度之和,%;
C为样品c所有条带光密度之和,%;
通过计算可得知,本发明制得的胶原蛋白中的杂蛋白含量是0.2%,胶原蛋白的纯度高达99.8%。
结果表明,本发明的胶原的纯度较高,杂蛋白含量较低,杂蛋白<0.25%,从SDS-PAGE图的结果可知:本发明制备得到的胶原样品具有明显的α组分、β组分及γ组分,α组分即为α肽链,β组分为α肽链的二聚体,γ组分为α肽链的三聚体,很好的保持了胶原原有的结构。
2、将本发明实施例3得到的胶原海绵粉碎成不同尺寸标记为样品1、样品2和样品3,从市场购买的两种酸溶胶原分别为样品4、5;分别检测上述样品的胀破强度、抗拉强度及降解时间。
(1)测试方法
胀破强度:将试样夹在可延伸的膜片上,在膜片下面施加液体压力,并以恒定速度增加液体体积,使膜片和试样膨胀直至试样破裂即测得胀破强度。
抗拉强度:取样品5条,宽度为15mm,间距40mm,以10mm/min速度进行拉伸,记录断裂时的最大值,结果取平均值;
降解时间:称重各个样品1500mg,浸泡在100ml 5U/mL胶原酶的PBS缓冲溶液中,溶液放在37℃的摇床上,评估其降解时间;
(2)试验结果如下表2:
表2 胶原样品的胀破强度、抗拉强度和降解时间的比较
从表2可以看出,与市场购买的两种酸溶胶原海绵相比,本发明的胶原海绵具有更高的抗拉强度、涨破强度和更长的降解周期。纤维尺寸>150μm,抗拉强度为8.2N,纤维尺寸100μm-150μm,抗拉强度为10.3N,纤维尺寸<100μm,抗拉强度为9.7N。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,所述制备工艺包括以下步骤:
(1)切割:选取富含胶原的动物组织,切成片或块,形成组织片或组织块;所述富含胶原的动物组织为牛或猪的皮肤或跟腱;
(2)前处理:将步骤(1)得到的所述组织片或组织块浸泡在氯化钠溶液中,氯化钠溶液的浓度为0.5-1.5wt%,磁力搅拌进行第一次混合,然后水洗去除氯化钠溶液;然后向浸泡后组织中加入乙醇溶液,所述乙醇溶液的浓度为60-90wt%,磁力搅拌进行第二次混合,然后水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织;
(3)酶反应:在酸性或弱碱性溶液中,加入10-20wt%步骤(2)得到的所述前处理组织,再加入蛋白酶进行酶解,酶解完成后中止反应;然后水洗去除溶液,形成待粉碎组织;
(4)粉碎:将步骤(3)得到的所述待粉碎组织进行粉碎后过筛,形成粉碎后动物组织;
(5)碱处理:在含有氢氧化钠和硫酸钠的溶液中,加入10-20wt%步骤(4)得到的所述粉碎后动物组织进行反应;反应完成后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原;
(6)冻干成膜:在0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.4-0.6wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.04-0.06wt%;将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
2.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(3)中,所述蛋白酶为无花果蛋白酶,在pH为5.5-6.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,加入10-20wt%所述前处理组织,再加入所述前处理组织0.1-2wt%的无花果蛋白酶,在25-37℃磁力搅拌反应0.5-5h,反应完成后加入亚氯酸钠、硝酸铵、双氧水中的一种或几种组合,在25℃-37℃下反应0.5-2h,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
3.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(3)中,所述蛋白酶为胃蛋白酶,在pH为2.5-4.5的酸性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胃蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入0.5-10M氢氧化钠中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
4.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(3)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶,在pH为7.5-7.8的弱碱性溶液中,加入10-20wt%前处理组织,再加入所述前处理组织1.0-15wt%的胰蛋白酶,在25-37℃下,反应2-12h,反应完成后加入0.5-10M盐酸溶液中和溶液至pH为5.0,中止酶反应,水洗去除溶液,形成待粉碎组织。
5.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(2)中,所述组织片或组织块浸泡在0.5-1.5%的氯化钠溶液中,以每克组织中加入5-10ml的氯化钠溶液的比例进行第一次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,然后水洗去除氯化钠溶液,以每克浸泡后组织中加入5-10ml浓度为60-90wt%的乙醇溶液的比例进行第二次混合,在25-37℃下磁力搅拌12-36h,水洗去除乙醇溶液,形成前处理组织。
6.根据权利要求2所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(3)中,若酶解组织中只加入亚氯酸钠,则所述亚氯酸钠的添加量为所述前处理组织的0.05-0.5wt%;若酶解组织中只加入硝酸铵,则所述硝酸铵的添加量为所述前处理组织的1-10wt%;若酶解组织中只加入双氧水,则所述双氧水的添加量为所述前处理组织的1-10wt%。
7.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(4)中,所述粉碎后动物组织的粒径为0-300µm。
8.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(5)中,在含有1.0-2.0 M氢氧化钠和1.0-2.0 M硫酸钠的溶液中,加入10-20wt%所述粉碎后动物组织,在25-37℃下反应36-72h;后用酸中和至pH为4.0-5.0,再用清水进行清洗,形成保持三股螺旋结构的胶原。
9.根据权利要求1所述的高产率胶原海绵的制备工艺,其特征在于,步骤(6)中,在0.05M的醋酸溶液中,加入步骤(5)得到的所述保持三股螺旋结构的胶原和硫酸软骨素钠进行均质,所述保持三股螺旋结构的胶原的添加量为所述醋酸溶液0.5wt%,所述硫酸软骨素钠的添加量为所述醋酸溶液0.05wt%;用均质机进行均质2h,将均质后所得的溶液进行冷冻干燥,制成胶原海绵。
10.一种根据权利要求1-9任一所述的高产率胶原海绵的制备工艺制成的高产率胶原海绵。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114032623B (zh) * | 2022-01-10 | 2022-03-29 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 一种高产率胶原海绵的制备工艺 |
CN117487782A (zh) * | 2023-09-19 | 2024-02-02 | 广州旭朗生物科技有限公司 | 一种水解海绵及其提取和应用 |
Citations (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1511592A (zh) * | 2002-12-30 | 2004-07-14 | 中国皮革和制鞋工业研究院 | 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法 |
WO2005039607A1 (fr) * | 2003-08-28 | 2005-05-06 | Nanjing Besson Pharmacy Co., Ltd | Utilisation de l'extrait de collagene de type i du diodon tachete dans les soins medicaux et procede de preparation correspondant |
JP2006257014A (ja) * | 2005-03-16 | 2006-09-28 | National Institute For Materials Science | 魚鱗由来コラーゲンおよびその取得方法 |
CN104857561A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-08-26 | 世科志扬(北京)医疗科技有限公司 | 高强度的仿生胶原膜及其制备方法 |
CN105177094A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-23 | 重庆海默尼生物技术有限公司 | 一种胶原蛋白纤维的提取方法 |
CN106139237A (zh) * | 2016-08-17 | 2016-11-23 | 沈阳尚贤微创医疗器械股份有限公司 | 一种新型高效复合止血海绵及其制备方法 |
CN106242770A (zh) * | 2016-08-09 | 2016-12-21 | 全椒县香妃农业专业合作社 | 一种利用酵母提取废料制备的香菇胶原栽培基质 |
CN106589113A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-04-26 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种从牛跟腱中提取胶原的方法 |
CN106701879A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-05-24 | 武汉医佳宝生物材料有限公司 | 一种提取i型胶原蛋白的方法 |
CN107058461A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-08-18 | 四川大学 | 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法 |
CN107217085A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-09-29 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种中性蛋白酶提取胶原的方法 |
CN107469145A (zh) * | 2017-09-22 | 2017-12-15 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种硬膜修补材料的制备及其应用 |
CN107551324A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-09 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用 |
CN107596428A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-01-19 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种胶原止血海绵及其制备方法 |
KR101864816B1 (ko) * | 2017-01-31 | 2018-06-05 | 주식회사 마린테크노 | 어피로부터 마린콜라겐의 추출방법 |
CN109554422A (zh) * | 2017-09-26 | 2019-04-02 | 谢玮 | 一种猪皮胶原蛋白提取方法 |
CN109602943A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-12 | 杭州易文赛生物技术有限公司 | 一种牛腱来源的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法 |
CN111793145A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-20 | 湖南伍星生物科技有限公司 | 一种提高硫酸软骨素钠联产胶原蛋白肽质量与收率的工艺 |
CN112625122A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-09 | 福建纽伯尔生物科技有限公司 | 一种胶原蛋白纤维提取方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999013902A1 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Integra Lifesciences Corporation | Product for promoting dural or meningeal tissue growth comprising collagen |
AUPS242702A0 (en) * | 2002-05-21 | 2002-06-13 | Colltech Australia Limited | Improved method for the extraction and purification of collagen |
CN101569765B (zh) * | 2009-06-23 | 2012-12-05 | 许和平 | 保持胶原特有三螺旋结构的i型医用胶原材料及其产品和应用 |
JP5521190B2 (ja) * | 2009-10-01 | 2014-06-11 | 国立大学法人東京工業大学 | コラーゲン組成物及びその製造方法 |
CN102091057B (zh) * | 2011-01-07 | 2013-03-13 | 北京天新福医疗器材有限公司 | 一种制备载药生物膜的方法 |
KR101531479B1 (ko) * | 2014-11-21 | 2015-06-26 | 세원셀론텍(주) | 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법 |
US10716876B2 (en) * | 2017-01-12 | 2020-07-21 | Collplant Ltd. | Method of generating collagen fibers |
CN114032623B (zh) * | 2022-01-10 | 2022-03-29 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 一种高产率胶原海绵的制备工艺 |
-
2022
- 2022-01-10 CN CN202210018910.7A patent/CN114032623B/zh active Active
- 2022-11-28 WO PCT/CN2022/134658 patent/WO2023130855A1/zh unknown
Patent Citations (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1511592A (zh) * | 2002-12-30 | 2004-07-14 | 中国皮革和制鞋工业研究院 | 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法 |
WO2005039607A1 (fr) * | 2003-08-28 | 2005-05-06 | Nanjing Besson Pharmacy Co., Ltd | Utilisation de l'extrait de collagene de type i du diodon tachete dans les soins medicaux et procede de preparation correspondant |
JP2006257014A (ja) * | 2005-03-16 | 2006-09-28 | National Institute For Materials Science | 魚鱗由来コラーゲンおよびその取得方法 |
CN104857561A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-08-26 | 世科志扬(北京)医疗科技有限公司 | 高强度的仿生胶原膜及其制备方法 |
CN105177094A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-23 | 重庆海默尼生物技术有限公司 | 一种胶原蛋白纤维的提取方法 |
CN106242770A (zh) * | 2016-08-09 | 2016-12-21 | 全椒县香妃农业专业合作社 | 一种利用酵母提取废料制备的香菇胶原栽培基质 |
CN106139237A (zh) * | 2016-08-17 | 2016-11-23 | 沈阳尚贤微创医疗器械股份有限公司 | 一种新型高效复合止血海绵及其制备方法 |
CN106589113A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-04-26 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种从牛跟腱中提取胶原的方法 |
CN107058461A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-08-18 | 四川大学 | 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法 |
KR101864816B1 (ko) * | 2017-01-31 | 2018-06-05 | 주식회사 마린테크노 | 어피로부터 마린콜라겐의 추출방법 |
CN106701879A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-05-24 | 武汉医佳宝生物材料有限公司 | 一种提取i型胶原蛋白的方法 |
CN107217085A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-09-29 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种中性蛋白酶提取胶原的方法 |
CN107469145A (zh) * | 2017-09-22 | 2017-12-15 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种硬膜修补材料的制备及其应用 |
CN107596428A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-01-19 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种胶原止血海绵及其制备方法 |
CN109554422A (zh) * | 2017-09-26 | 2019-04-02 | 谢玮 | 一种猪皮胶原蛋白提取方法 |
CN107551324A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-09 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种可缝合硬膜修补材料的制备及其应用 |
CN109602943A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-12 | 杭州易文赛生物技术有限公司 | 一种牛腱来源的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法 |
CN111793145A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-20 | 湖南伍星生物科技有限公司 | 一种提高硫酸软骨素钠联产胶原蛋白肽质量与收率的工艺 |
CN112625122A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-09 | 福建纽伯尔生物科技有限公司 | 一种胶原蛋白纤维提取方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Digestive aspartic proteases from sabalo (Prochilodus lineatus): Characterization and application for collagen extraction;Acevedo Gomez, Antonella Valeria等;《FOOD CHEMISTRY 》;20181215;第269卷;第610-617页 * |
牛肌腱胶原的提取及生物相容性的研究;宋维旭;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (医药卫生科技辑)》;20080315(第3期);E080-15 * |
牛跟腱胶原蛋白的制备及生物学评价;许婷;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (工程科技Ⅰ辑)》;20190115(第1期);B018-281 * |
猪皮胶原蛋白提取过程中酶解条件优化及其结构鉴定;于玮等;《西南大学学报(自然科学版)》;20150430;第37卷(第4期);第106-113页 * |
草鱼不同部位胶原蛋白的提取及特性研究;黄石溪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20140715(第7期);B024-161 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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