CN113244439A - 一种无抗原胶原聚集体及其制备方法 - Google Patents

一种无抗原胶原聚集体及其制备方法 Download PDF

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Shandong Qianfoshan Hospital
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Abstract

本发明公开了一种无抗原胶原聚集体及其制备方法，其通过对哺乳动物的跟腱加工处理制得了高度纯化的无抗原胶原聚集体。该无抗原胶原聚集体的制备方法具有原材料来源广、成本低、工艺简单等特点。该无抗原胶原聚集体不仅保留有胶原本身的生物活性，还具有较高的力学强度，可广泛应用于手术止血材料、敷料和其它生物医学材料。

Description

一种无抗原胶原聚集体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种无抗原胶原聚集体及其制备方法，属于生物医用材料制备领域。
背景技术
胸外科疾病手术后伤口缝合所用的手术缝合线选择胶原蛋白缝合线较为适合。胶原蛋白缝合线取材于动物肌腱部位，纯天然胶原蛋白含量高，具备胶原蛋白应有的特性，具有吸收完全、抗拉强度高、生物相容性好、促进细胞生长等优点。
用于制备胶原蛋白缝合线的主要原料为胶原蛋白。胶原蛋白(Collagen)又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质。胶原蛋白是动物结缔组织重要的蛋白质，结缔组织除了含60～70%的水分外，胶原蛋白占了约20～30%，因为有高含量的胶原蛋白，结缔组织具有了一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑、保护的功能。
胶原蛋白与机体的生长、衰老和疾病有着极其密切的联系。因其具有良好的生物相容性、营养性、修复性、保湿性、配伍性和亲和性，所以被广泛应用于生物医学材料、化妆品、食品及保健品等功能性产品。
现有的胶原制备方法存在工艺复杂、成本高的问题，制得的胶原存在生物活性低、力学性能低和抗原性高的缺陷，会影响采用其生产的胶原蛋白缝合线的性能。
中国专利申请CN200810044399.8公开了一种胶原基生物医用材料的制备方法，其通过在一定条件下用水溶性碳化二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)改性，制成具有独特效果的纯胶原基生物医用材料。
中国专利申请CN201010149791.6公开了一种脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料及其制备方法，保留有肌腱/韧带胶原纤维或纤维束固有的力学结构单位和细胞附着结构，采用低温干燥的方法处理肌腱/韧带纤维，分离的纤维保留一定的力学强度，通过物理开松和梳理的方法，选出可胶原纤维和纤维束，再进行脱细胞处理。
中国专利申请CN201410450387.0公开了一种高纯度天然胶原纤维及其制备方法，其以新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱为原料，通过预处理、浸水、超临界二氧化碳流体脱脂、浸碱、第一次酶处理、浸酸、第二次酶处理、盐析、离心纯化等工艺，得到高纯度天然胶原纤维。
中国专利申请CN201410324893.5公开了一种无抗原胶原聚集体及其制备方法，以可溯源的动物皮或跟腱为原料，通过去肉、剥离筋膜、脱脂、除去杂蛋白以及脱细胞等工艺操作，对动物皮或跟腱进行高度纯化，接着应用酸蓬松化、匀浆、多次盐析、多次离心等手段对胶原聚集体进行分离纯化，最终得到一种无抗原胶原聚集体。
上述胶原的制备方法存在工艺过于繁复、耗时耗力、成本高等缺陷，制得的无抗原胶原聚集体的断裂强度不能满足一定的应用需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种无抗原胶原聚集体的制备方法，该方法具有原材料来源广、成本低、工艺简单等特点，由该方法制得的无抗原胶原聚集体具有更高的力学强度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种无抗原胶原聚集体的制备方法，包括如下步骤：
A）取新鲜可溯源的哺乳动物的跟腱，清除跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成薄片，室温下用生理盐水浸泡30-60min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的跟腱薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.05-0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至跟腱无甲苯气味即得脱脂跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入5-10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化跟腱；
D）将上述纯化跟腱浸入2M醋酸溶液中1-3小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12-20小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。
进一步优选，所述哺乳动物为牛、羊、马、狗、驴或猪。
进一步优选，所述薄片的厚度为0.1-0.2毫米。
进一步优选，所述室温下用生理盐水浸泡的时间为40-50min。
进一步优选，所述聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.06-0.08重量份。
进一步优选，所述聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.07重量份。
进一步优选，所述1g/L的胰蛋白酶的加入量为7-8重量份。
进一步优选，浸入2M醋酸溶液的时间为2小时。
进一步优选，所述静置时间为16小时。
本发明还进一步包括一种无抗原胶原聚集体，由上述无抗原胶原聚集体的制备方法制得。
对本发明制得的无抗原胶原聚集体进行检测：
外观：白色絮状；
水分含量：≤22%（wt）；
重金属含量：≤8μg/g(m/m)；
羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的10%（m∕m）；
纤维长度（mm）：9-25；
断裂强度（cN/tex）：≥4.7；
断裂伸长率（%）：25~47；
细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；
无菌试验：无菌；
致敏试验：无迟发性超敏反应；
皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）与中国专利申请CN201410324893.5公开的无抗原胶原聚集体的制备方法相比，本发明的制备方法大大简化了制备工艺，降低了生产成本和生产周期，并且制得的无抗原胶原聚集体在外观、水分含量、重金属含量、羟脯氨酸含量、纤维长度、断裂伸长率、细胞毒性、无菌试验、致敏试验、皮内反应试验等性能指标方面与中国专利申请CN201410324893.5水平相当。
（2）与中国专利申请CN201410324893.5公开的无抗原胶原聚集体的制备方法相比，本发明制得的无抗原胶原聚集体具有更优的断裂强度。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
A）取新鲜可溯源的牛跟腱，清除牛跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成厚度为0.2毫米的薄片，室温下用生理盐水浸泡30min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的牛跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至牛跟腱无甲苯气味即得脱脂牛跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂牛跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化牛跟腱；
D）将上述纯化牛跟腱浸入2M醋酸溶液中1小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。无抗原胶原聚集体的性能指标见表1。
实施例2
A）取新鲜可溯源的羊跟腱，清除羊跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成厚度为0.2毫米的薄片，室温下用生理盐水浸泡30min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的羊跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至羊跟腱无甲苯气味即得脱脂羊跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂羊跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化羊跟腱；
D）将上述纯化羊跟腱浸入2M醋酸溶液中1小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。无抗原胶原聚集体的性能指标见表1。
实施例3
A）取新鲜可溯源的狗跟腱，清除狗跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成厚度为0.2毫米的薄片，室温下用生理盐水浸泡30min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的狗跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至狗跟腱无甲苯气味即得脱脂狗跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂狗跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化狗跟腱；
D）将上述纯化狗跟腱浸入2M醋酸溶液中1小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。无抗原胶原聚集体的性能指标见表1。
实施例4
A）取新鲜可溯源的猪跟腱，清除猪跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成厚度为0.2毫米的薄片，室温下用生理盐水浸泡30min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的猪跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至猪跟腱无甲苯气味即得脱脂猪跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂猪跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化猪跟腱；
D）将上述纯化猪跟腱浸入2M醋酸溶液中1小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。无抗原胶原聚集体的性能指标见表1。
实施例5
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是跟腱薄片的厚度为0.1毫米。
实施例6
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是室温下用生理盐水浸泡的时间为45min。
实施例7
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.05重量份。
实施例8
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.07重量份。
实施例9
与实施例4的制备步骤相同，唯一不同的是胰蛋白酶的加入量为5重量份。
实施例10
与实施例4的制备步骤相同，唯一不同的是胰蛋白酶的加入量为7重量份。
实施例11
与实施例3的制备步骤相同，唯一不同的是静置时间为16小时。
实施例12
与实施例3的制备步骤相同，唯一不同的是浸入2M醋酸溶液的时间为2小时。
对比例1
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0。
对比例2
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.04。
对比例3
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是胰蛋白酶的加入量为0重量份。
对比例4
与实施例1的制备步骤相同，唯一不同的是胰蛋白酶的加入量为4.5重量份。
对比例5
按照专利申请CN201410324893.5的实施例1制得的无抗原胶原聚集体。
表1 胶原聚集体的性能指标
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A）取新鲜可溯源的哺乳动物的跟腱，清除跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成薄片，室温下用生理盐水浸泡30-60min，再用双蒸水反复漂洗；
B）将10重量份的跟腱薄片放于超临界流体处理器内，加入100重量份的甲苯和0.05-0.1重量份的聚乙二醇对异辛基苯基醚，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至跟腱无甲苯气味即得脱脂跟腱；
C）在超声波的条件下，将步骤B)制得的脱脂跟腱浸泡在100重量份的Tris-NaCl（Tris：0.05mol/L；NaCl：2mol/L；pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌2小时，然后加入5-10重量份的1g/L的胰蛋白酶，继续搅拌2小时，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化跟腱；
D）将上述纯化跟腱浸入2M醋酸溶液中1-3小时，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12-20小时，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。
2.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物为牛、羊、马、狗、驴或猪。
3.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述薄片的厚度为0.1-0.2毫米。
4.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述室温下用生理盐水浸泡的时间为40-50min。
5.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.06-0.08重量份。
6.根据权利要求5所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇对异辛基苯基醚的加入量为0.07重量份。
7.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述1g/L的胰蛋白酶的加入量为7-8重量份。
8.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，浸入2M醋酸溶液的时间为2小时。
9.根据权利要求1所述的无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，所述静置时间为16小时。
10.一种无抗原胶原聚集体，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的无抗原胶原聚集体的制备方法制得。
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