CN104107456B - 无抗原胶原聚集体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了无抗原胶原聚集体及其制备方法，其特点是以可溯源的动物皮或跟腱为原料，通过去肉、剥离筋膜、脱脂、除去杂蛋白以及脱细胞等工艺操作，对动物皮或跟腱进行高度纯化。接着应用酸蓬松化、匀浆、多次盐析、多次离心等手段对胶原聚集体进行分离纯化，最终得到一种无抗原胶原聚集体。这种胶原聚集体为胶原纤维、胶原纤维束的混合体，它具有周期性的明暗横纹结构，横纹间距大约为67nm。该材料既具有良好的生物相容性、可生物降解性、力学性能及止血性能，又具有低抗原性、生物活性等特点，可广泛地应用于止血材料、组织工程支架材料、生物敷料、可降解医用缝合线及整形材料等生物医学材料的制备。

Description

无抗原胶原聚集体及其制备方法

技术领域

本发明涉及了一种无抗原胶原聚集体及其制备方法，属于生物医用材料制备领域。

背景技术

胶原是细胞外基质的主要骨架成分，广泛存在于皮肤、骨、肌腱等中，具有支撑和保护作用。胶原聚集体是胶原分子的聚集体，在结缔组织中排列成束，彼此交织。胶原分子间通过侧向共价交联，相互呈阶梯式有序排列聚合成直径50～200nm、长280nm至数微米的原纤维，这些原纤维组成胶原纤维，胶原纤维又聚集形成胶原纤维束。目前大家公认的胶原分子空间排列方式是Smith提出的微纤维模型(詹怀宇，纤维化学与物理[M].科学出版社，2005：383)。按照这种模型，微纤维的断面呈正五角形。五角形的各个顶点既是胶原分子。这5个胶原分子按照4D交错的方式排列形成了微纤维，其中每个微纤维的直径是4.0nm。一个微纤维分子是胶原纤维的1个结构单位，多束微纤维集合就能形成原纤维。其中原纤维的断面呈扇形张开着，这些张开的细纤维即为微纤维。原纤维再集合在一起就形成了纤维，通过纤维再进一步缠绕在一起就形成了纤维束。因此胶原聚集体结构最为显著的特点为其具有明暗相间的横纹结构。

胶原应用于医用生物材料还存在着力学机械性能差、生物降解性差以及结构稳定性不高等问题。相比原胶原分子，胶原聚集体除拥有胶原的四级结构外，还保留有更多的天然胶原空间结构特征，因而其具有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能。同时胶原聚集体又能激活细胞的特性基团表达，维持细胞正常的特性表达，有利于细胞的黏附、生长，结构更加稳定易于保存，因而在医学领域的应用前景十分诱人。当将其制成海绵时，由于胶原聚集体是超分子，故其空间结构更复杂，遇到体液时，不易流失、变形和降解，稳定性更高(刘新华，但年华，胡杨，肖世维，但卫华.牛肌腱胶原纤维提取条件优化及其结构表征[J].2012,43:136-139)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种无抗原胶原聚集体，该材料既良好的生物降解性能、生物相容性和力学性能，结构稳定易于保存，又能够快速有效止血、促进创面愈合和修复，是生物医用材料的理想材料料。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

A）动物皮或跟腱预处理：取新鲜可溯源的动物皮或跟腱，清除动物皮或跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成1.0～5.0mm×1.0～5.0mm的薄片，室温下用生理盐水浸泡30～90min，再用双蒸水反复漂洗；

B）动物皮或跟腱脱脂处理：将10重量份的动物皮或跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入200～400体积份的丙酮中，在压力10.0-35.0Mpa、室温的条件下处理1～5h，结束后用双蒸水反复漂洗直至动物皮或跟腱无丙酮气味；

C）动物皮或跟腱除去非胶原成分、脱细胞处理：在超声波的条件下，将脱脂后的动物皮或跟腱浸泡在Tris-NaCl（Tris:0.05mol/L;NaCl:1mol/L;pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌10-24h，接着将其放于-80℃的速冻冰箱中反复冻融3～6次，双蒸水反复清洗；继续在超声波的条件下，将冻融后的动物皮或跟腱浸泡在1～1.5MNaCl，10～15mMEDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌12～24h，接着将动物皮或跟腱继续浸泡在0.5～1%的十二烷基硫酸钠溶液中，室温下搅拌2～5h，用蒸馏水反复清洗，最后将动物皮或跟腱浸泡在0.1～0.5%的胰酶和0.1～0.5%的EDTA混合溶液中，37℃下搅拌消化1～3h，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化动物皮或跟腱；

D）无抗原胶原聚集体的制备：取上述纯化动物皮或跟腱，将其浸渍2～10M醋酸溶液中2～14h，4～10℃恒温条件下用匀浆机匀浆20～30min，将浆液在15000～20000rpm下离心20～30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0～7.5，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12～20h，接着再次在15000～20000rpm离心20～30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3～5次，最后经冷冻干燥、剂量为6～30KGy/h⁶⁰Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。

本发明所得到的无抗原胶原聚集体的主要关键性能指标：

外观：白色絮状，无肉眼可见之杂质；

水分含量：≤20%（wt）；

重金属含量：≤10μg/g(m/m)；

羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的10%（m∕m）；

纤维长度（mm）:10-20;

断裂强度（cN/tex）:≥4.0;

断裂伸长率（%）:20~40;

细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；

无菌试验：无菌；

致敏试验：无迟发性超敏反应；

皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。

本技术与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明所制备的无抗原胶原聚集体，除拥有胶原的四级结构和保留有胶原本身的生物活性外，还继承了更多的天然组织中胶原空间结构特征，可更大程度地仿生天然组织结构；

（2）相比胶原材料，本发明所制备的无抗原胶原聚集体具有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能，结构更为稳定易于保存，又能激活细胞的特性基团表达、维持细胞正常的特性表达，有利于细胞的黏附、生长，是一种理想的生物医用材料；

（3）本发明专利在动物皮或跟腱除去非胶原成分、脱细胞处理中使用了超声波，充分发挥了超声波的空化效应、机械效应、热效应等作用，使得动物皮或跟腱中的非胶原成分更易被清除，细胞更易破损而被处理，对材料的制备产生了极大的影响；

（4）本发明所制备的无抗原胶原聚集体的取材丰富，成本低廉；

（5）本发明所制备的无抗原胶原聚集体为由纯化动物皮或跟腱直接制备得到的，技术可靠，工艺简便，易于形成规模化产业链。

附图说明

图1为牛腱（a）、猪腱（b）、猪皮(c)纯化后的组织HE染色切片图（×100）

由图1可见，牛腱(a)、猪腱（b）、猪皮(c)纯化后胶原纤维间洁净、不含杂质，纤维保持完整，确认为合格。

图2为本发明无抗原胶原聚集体的原子力显微镜（AFM）检测图

由图2可见，所得无抗原聚集体具有横纹结构，为胶原聚集体典型的结构特征。

具体实施方式

下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。

实施例1

A）牛跟腱预处理：取新鲜可溯源的牛跟腱，清除牛跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成1.0mm×1.0mm的薄片，室温下用生理盐水浸泡30min，再用双蒸水反复漂洗；

B）牛跟腱脱脂处理：将10重量份的牛跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入200体积份的丙酮中，在压力10.0Mpa、室温的条件下处理1h，结束后用双蒸水反复漂洗直至牛跟腱无丙酮气味；

C）牛跟腱除去非胶原成分、脱细胞处理：在超声波的条件下，将脱脂后的动物皮或跟腱浸泡在Tris-NaCl（Tris:0.05mol/L;NaCl:1mol/L;pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌10h，接着将其放于-80℃的速冻冰箱中反复冻融3次，双蒸水反复清洗；继续在超声波的条件下，将冻融后的牛跟腱浸泡在1MNaCl，10mMEDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌12h，接着将牛跟腱继续浸泡在0.5%的十二烷基硫酸钠溶液中，室温下搅拌2h，用蒸馏水反复清洗，最后将牛跟腱浸泡在0.1%的胰酶和0.1%的EDTA混合溶液中，37℃下搅拌消化1h，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化牛跟腱；

D）无抗原胶原聚集体的制备：取上述纯化的牛跟腱，将其浸渍2M醋酸溶液中2h，4℃恒温条件下用匀浆机匀浆20min，将浆液在15000rpm下离心30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12h，接着再次在15000rpm离心30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3次，最后经冷冻干燥、剂量为6KGy/h⁶⁰Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。

实施例2

A）猪皮预处理：取新鲜可溯源的猪皮，清除猪皮的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成3.0mm×3.0mm的薄片，室温下用生理盐水浸泡60min，再用双蒸水反复漂洗；

B）猪皮脱脂处理：将10重量份的猪皮的薄片放于超临界流体处理器内，加入300体积份的丙酮中，在压力20.0Mpa、室温的条件下处理3h，结束后用双蒸水反复漂洗直至猪皮无丙酮气味；

C）猪皮除去非胶原成分、脱细胞处理：在超声波的条件下，将脱脂后的猪皮浸泡在Tris-NaCl（Tris:0.05mol/L;NaCl:1mol/L;pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌15h，接着将其放于-80℃的速冻冰箱中反复冻融5次，双蒸水反复清洗；继续在超声波的条件下，将冻融后的猪皮浸泡在1.2MNaCl，13mMEDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌18h，接着将猪皮继续浸泡在0.8%的十二烷基硫酸钠溶液中，室温下搅拌4h，用蒸馏水反复清洗，最后将猪皮浸泡在0.3%的胰酶和0.2%的EDTA混合溶液中，37℃下搅拌消化2h，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化猪皮；

D）无抗原胶原聚集体的制备：取上述纯化猪皮，将其浸渍5M醋酸溶液中8h，5℃恒温条件下用匀浆机匀浆25min，将浆液在18000rpm下离心25min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.2，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置18h，接着再次在18000rpm离心25min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀4次，最后经冷冻干燥、剂量为25KGy/h⁶⁰Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。

实施例3

A）猪跟腱预处理：取新鲜可溯源的猪跟腱，清除猪跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成5.0mm×5.0mm的薄片，室温下用生理盐水浸泡90min，再用双蒸水反复漂洗；

B）猪跟腱脱脂处理：将10重量份的猪跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入400体积份的丙酮中，在压力35.0Mpa、室温的条件下处理5h，结束后用双蒸水反复漂洗直至猪跟腱无丙酮气味；

C）猪跟腱除去非胶原成分、脱细胞处理：在超声波的条件下，将脱脂后的猪跟腱浸泡在Tris-NaCl（Tris:0.05mol/L;NaCl:1mol/L;pH7.5）缓冲溶液中，室温搅拌24h，接着将其放于-80℃的速冻冰箱中反复冻融6次，双蒸水反复清洗；继续在超声波的条件下，将冻融后的猪跟腱浸泡在1.5MNaCl，15mMEDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌24h，接着将猪跟腱继续浸泡在1%的十二烷基硫酸钠溶液中，室温下搅拌5h，用蒸馏水反复清洗，最后将猪跟腱浸泡在0.1～0.5%的胰酶和0.1～0.5%的EDTA混合溶液中，37℃下搅拌消化1～3h，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化猪跟腱；

D）无抗原胶原聚集体的制备：取上述纯化猪跟腱，将其浸渍10M醋酸溶液中14h，10℃恒温条件下用匀浆机匀浆30min，将浆液在20000rpm下离心20min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.5，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置20h，接着再次在20000rpm离心20min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀5次，最后经冷冻干燥、剂量为30KGy/h⁶⁰Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体。

Claims (4)

1.一种无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A)动物皮或跟腱预处理：取新鲜可溯源的动物皮或跟腱，清除动物皮或跟腱表面的肌肉、边缘软骨、血管和筋膜组织，接着将其切成1.0～5.0mm×1.0～5.0mm的薄片，室温下用生理盐水浸泡30～90min，再用双蒸水反复漂洗；

B)动物皮或跟腱脱脂处理：将10重量份的动物皮或跟腱的薄片放于超临界流体处理器内，加入200～400体积份的丙酮中，在压力10.0-35.0MPa、室温的条件下处理1～5h，结束后用双蒸水反复漂洗直至动物皮或跟腱无丙酮气味；

C)动物皮或跟腱除去非胶原成分、脱细胞处理：在超声波的条件下，将脱脂后的动物皮或跟腱浸泡在Tris-NaCl缓冲溶液中，其中Tris浓度:0.05mol/L；NaCl浓度:1mol/L；pH＝7.5，室温搅拌10-24h；接着将其放于-80℃的速冻冰箱中反复冻融3～6次，双蒸水反复清洗；继续在超声波的条件下，将冻融后的动物皮或跟腱浸泡在1～1.5MNaCl，10～15mMEDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌12～24h，接着将动物皮或跟腱继续浸泡在0.5～1％的十二烷基硫酸钠溶液中，室温下搅拌2～5h，用蒸馏水反复清洗，最后将动物皮或跟腱浸泡在0.1～0.5％的胰酶和0.1～0.5％的EDTA混合溶液中，37℃下搅拌消化1～3h，用双蒸水反复清洗，冷冻干燥获得纯化动物皮或跟腱；

D)无抗原胶原聚集体的制备：取上述纯化动物皮或跟腱，将其浸渍2～10M醋酸溶液中2～14h，4～10℃恒温条件下用匀浆机匀浆20～30min，将浆液在15000～20000rpm下离心20～30min，除去上清液，收集浆液，调节浆液pH至7.0～7.5，加入最终浓度为1.5mol/L的氯化钠粉末，静置12～20h，接着再次在15000～20000rpm离心20～30min，除去上清液，最后以超纯水洗涤沉淀3～5次，最后经冷冻干燥、剂量为6～30KGy/h⁶⁰Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到无抗原胶原聚集体；所制得的无抗原胶原聚集体主要含有胶原纤维和胶原纤维束，其关键性能指标如下：

外观：白色絮状，无肉眼可见之杂质；

水分含量：≤20％(wt)；

重金属含量：≤10μg/g；

羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的10％(w/w)；

纤维长度:10-20mm；

断裂强度:≥4.0cN/tex；

断裂伸长率:20～40％；

细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；

无菌试验：无菌；

致敏试验：无迟发性超敏反应；

皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。

2.如权利要求1所述的一种无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于所述的动物皮或跟腱为新鲜、可溯源的，为猪、牛、驴的动物皮或跟腱。

3.如权利要求1所述的一种无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于所述的胰酶的活力单位为1：10～1：25。

4.如权利要求1所述的一种无抗原胶原聚集体的制备方法，其特征在于所述的超声波频率均为20～40kHz，功率为50～120w。