CN107929815A - 一种制备高强度胶原支架材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备高强度胶原支架材料的方法。该方法以哺乳动物的跟腱为原料，经消毒、冷冻、切片、粉碎、脱细胞、胶质化和冷冻干燥等步骤制备高强度胶原支架材料。制备的胶原支架材料不经过化学交联，具有强度高、生物相容性好、可被机体吸收等特点，是一种良好的组织修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种制备高强度胶原支架材料的方法。
背景技术
胶原是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是细胞外基质的主要成分，约战胶原纤维固体物的85%，占体内蛋白质总量的25%～30%，相当于体重的6%。它作为一种天然的结构蛋白，胶原所具有的优秀的生物特性以及科学技术的发展使得它在生物医学领域的应用受到越来越广泛的关注。以胶原为主要或唯一成分制备的不同形式的胶原生物材料，应用于烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、人工构建血管。创面止血等。
目前制备胶原支架材料的方法一般是先通过酸溶法或酶法从动物组织中提取纯化胶原，然后将其溶解在酸性溶液中，通过冷冻干燥的方法制备。为了提高胶原支架材料的力学性质，再通过物理或化学的方式进行交联。采用这类方法制备胶原支架材料主要存在的问题是：1）胶原在酸性溶液中的溶解度很低，一般浓度为1g～10g/L，支架材料太疏松导致强度不够；2）物理交联对支架材料强度的提高程度有限且不均匀，而化学交联则存在化学试剂残留所导致的安全风险。跟腱的细胞外基质成分主要为天然交联的胶原，通过脱细胞的方法制备跟腱细胞外基质，即可得到天然交联的胶原材料。
发明内容
为了解决目前制备胶原支架材料的方法所存在的问题，本发明提供了一种制备高强度胶原支架材料的方法。本发明所提供的制备高强度胶原支架材料的方法如下：
（1）将动物跟腱用过氧乙酸溶液浸泡消毒，然后用纯化水漂洗跟腱组织至过氧乙酸残留小于1ppm；
（2）将上述步骤所得的跟腱组织纵向排列整齐，冰冻；
（3）在冰冻状态下，用切片机将跟腱组织切成薄片；
（4）将跟腱薄片用高速组织捣碎机在水介质中高速捣碎成纤维状；
（5）将纤维组织从高速组织捣碎机中取出转移至锥形瓶中，依次用胰蛋白酶/EDTA溶液、曲拉通X-100溶液和脱氧胆酸钠溶液震荡漂洗数小时，每次漂洗后将组织用滤袋过滤，挤压除去试剂，并用纯化水冲洗数次；
（6）将组织用过氧乙酸/乙醇溶液浸泡消毒数小时，然后搅拌下缓慢滴加碱溶液调节pH至中性，溶胀的胶原组织析出成纤维状，用滤袋过滤，挤压除去水分，纯化水冲洗数次；
（7）将组织取出，用低浓度碱溶液浸泡至成胶状组织；
（8）将胶状组织填入到模具中，冷冻干燥后用纯化水漂洗至pH值中性，再次冷冻干燥得到高强度胶原支架材料。
上述制备方法中，所述步骤（1）中过氧乙酸浓度为0.1%～0.5%，浸泡时间为10min～30min；
上述制备方法中，所述步骤（3）中薄片的厚度为1mm～3mm；
上述制备方法中，所述步骤（5）中胰蛋白酶/EDTA溶液为0.1%～0.5%胰蛋白酶/0.05%～0.2%EDTA的PBS溶液；
上述制备方法中，所述步骤（5）中曲拉通X-100溶液为1%～5%曲拉通X-100的PBS溶液；
上述制备方法中，所述步骤（5）中脱氧胆酸钠溶液为1%～5%脱氧胆酸钠的PBS溶液；
上述制备方法中，所述步骤（6）中过氧乙酸/乙醇溶液为0.1%～0.5%过氧乙酸/1%～10%乙醇的水溶液；
上述制备方法中，所述步骤（6）中碱溶液为0.1～1mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；
上述制备方法中，所述步骤（7）中低浓度碱溶液为0.01～0.1mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；
上述制备方法中，所述步骤（7）中胶状组织中固含量为50～100g/L。
本发明所提供的制备高强度胶原材料支架方法没有破坏胶原的天然交联位点，不引入化学交联试剂，其结构较为致密，具有强度高、生物相容性好、可被机体吸收等特点，是一种良好的组织修复材料。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
将100g猪跟腱用2000ml 0.1%过氧乙酸溶液浸泡10min，然后用纯化水冲洗数次至过氧乙酸残留小于1ppm，然后将其纵向排列整齐，放在冰箱中冷冻成一整体，用切片机将其切成厚度约1mm的跟腱薄片，将薄片放入高速组织捣碎机中，加入适量纯化水，高速捣碎成纤维状，将纤维组织取出放入锥形瓶，用2000ml 0.1%胰蛋白酶/0.05%EDTA的PBS溶液震荡处理1h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗3次，将组织从滤袋中取出转移至锥形瓶中，用2000ml 1%曲拉通X-100的PBS溶液震荡处理1h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗3次，将组织从滤袋中取出转移至锥形瓶中，用2000ml 1%脱氧胆酸钠的PBS溶液震荡处理1h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗3次，再将组织用2000ml 0.1%过氧乙酸/1%乙醇溶液浸泡1h，搅拌状态下缓慢滴加0.1mol/L的氢氧化钠溶液，至pH值中性，可将溶胀的胶原组织成纤维状析出，用滤袋过滤，挤压除去水分，纯化水冲洗3次，将组织取出，用400ml浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液浸泡5min成胶状，胶状组织中胶原固含量约50g/L，将胶状固体取出，放入平盘模具中，厚度为1mm，冷冻干燥后用纯化水漂洗至pH值中性，再次冷冻干燥得到致密的胶原膜状支架材料，可用于人工皮肤或硬脑膜。
实施例2
将200g牛跟腱用5000ml 0.5%过氧乙酸溶液浸泡30min，然后用纯化水冲洗数次至过氧乙酸残留小于1ppm，然后将其纵向排列整齐，放在冰箱中冷冻成一整体，用切片机将其切成厚度约3mm的跟腱薄片，将薄片放入高速组织捣碎机中，加入适量纯化水，高速捣碎成纤维状，将纤维组织取出放入锥形瓶，用5000ml 0.5%胰蛋白酶/0.2%EDTA的PBS溶液震荡处理2h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗5次，将组织从滤袋中取出转移至锥形瓶中，用5000ml 5%曲拉通X-100的PBS溶液震荡处理2h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗5次，将组织从滤袋中取出转移至锥形瓶中，用5000ml 1%脱氧胆酸钠的PBS溶液震荡处理2h，滤袋过滤，挤压除去试剂，然后用纯化水冲洗5次，再将组织用5000ml 0.5%过氧乙酸/10%乙醇溶液浸泡2h，搅拌状态下缓慢滴加1mol/L的氢氧化钾溶液，至pH值中性，可将溶胀的胶原组织成纤维状析出，用滤袋过滤，挤压除去水分，纯化水冲洗5次，将组织取出，用500ml浓度为0.1mol/L的氢氧化钾溶液浸泡30min成胶状，将胶状固体取出，放入块状模具中，冷冻干燥后用纯化水漂洗至pH值中性，再次冷冻干燥得到致密的胶原块状支架材料，可用于组织填充或软骨修复。
Claims (9)
1.一种制备高强度胶原支架材料的方法，其特征在于包括如下步骤：
将动物跟腱用过氧乙酸溶液浸泡消毒，然后用纯化水漂洗跟腱组织至过氧乙酸残留小于1ppm；
将上述步骤所得的跟腱组织纵向排列整齐，冰冻；
在冰冻状态下，用切片机将跟腱组织切成薄片；
将跟腱薄片用高速组织捣碎机在水介质中高速捣碎成纤维状；
将纤维组织从高速组织捣碎机中取出转移至锥形瓶中，依次用胰蛋白酶/EDTA溶液、曲拉通X-100溶液和脱氧胆酸钠溶液震荡漂洗数小时，每次漂洗后将组织用滤袋过滤，挤压除去试剂，并用纯化水冲洗数次；
将组织用过氧乙酸/乙醇溶液浸泡消毒数小时，然后搅拌下缓慢滴加碱溶液调节pH至中性，溶胀的胶原组织析出成纤维状，用滤袋过滤，挤压除去水分，纯化水冲洗数次；
将组织取出，用低浓度碱溶液浸泡至成胶状组织；
将胶状组织填入到模具中，冷冻干燥后用纯化水漂洗至pH值中性，再次冷冻干燥得到高强度胶原支架材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中过氧乙酸浓度为0.1%～0.5%，浸泡时间为10min～30min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中薄片的厚度为1mm～3mm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中胰蛋白酶/EDTA溶液为0.1%～0.5%胰蛋白酶/0.05%～0.2%EDTA的PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中曲拉通X-100溶液为1%～5%曲拉通X-100的PBS溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中脱氧胆酸钠溶液为1%～5%脱氧胆酸钠的PBS溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（6）中过氧乙酸/乙醇溶液为0.1%～0.5%过氧乙酸/1%～10%乙醇的水溶液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（6）中碱溶液为0.1～1mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（7）中低浓度碱溶液为0.01～0.1mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述浸泡时间为5～30min;所述胶状组织中固含量为50～100g/L。
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| CN105169461A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-23 | 重庆海默尼生物技术有限公司 | 一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法 |
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2017
- 2017-12-07 CN CN201711282305.6A patent/CN107929815A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| CN109529106A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-03-29 | 山东隽秀生物科技股份有限公司 | 一种慢性创面修复基质的制备方法 |
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