CN106589113A - 一种从牛跟腱中提取胶原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从牛跟腱中提取胶原的方法。该方法包括以下步骤，先对牛跟腱进行切片；再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％‑0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4‑15℃下保持12‑24h；然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1‑2mol/L的盐溶液中，在4‑15℃下保持1‑4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4‑7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。采用本发明提供的从牛跟腱中提取胶原的方法获得胶原三股螺旋结构完整性好，纯度高，并且该方法简单，无需高端设备，提取成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种从牛跟腱中提取胶原的方法。
背景技术
胶原种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，胶原因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。在医学领域中，胶原由于具有低免疫原性、纤维的再形成性、机械性能高和生物可降解性等优点，可制成胶原海绵、胶原膜、人工皮肤和胶囊等。胶原中的Ⅰ型胶原是普遍存在于动物体内，约占动物体内胶原总量的90％，占总蛋白质量的将近20％，广泛分布在肌腱、韧带、角膜、骨、皮肤等组织中，对维持这些结缔组织的机械强度和生物学功能起关键作用。
在空间结构上，胶原显示出特殊的三股螺旋缠绕的结构，三条相互独立的肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构。胶原这种特殊的三股螺旋结构保证了它的机械强度。胶原纤维是胶原行使生理作用的基本形态，在生物体内胶原纤维交织成富有机械强度和弹性的网状结构成为结缔组织最基本的组成成分。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：在从原料中提取胶原的过程中，胶原单靠氢键维系的三股螺旋容易断裂，而很容易水解为胶原蛋白，而大大降低机械强度，不能满足很多医学用途。因此，需要一种能够保持胶原的三股螺旋结构完整性的提取胶原的方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种从牛跟腱中提取胶原的方法，能够获得完整的三股螺旋结构的胶原。技术方案如下：
本发明提供了一种从牛跟腱中提取胶原的方法，包括以下步骤，
先对牛跟腱进行切片；
再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；
然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；
最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。
在本发明的一种优选实施方式中，所述无花果蛋白酶的质量分数为0.05％-0.1％。
在本发明的一种优选实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5-7，磷酸根的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L。
在本发明的一种优选实施方式中，所述氧化剂为过氧化氢。
在本发明的一种优选实施方式中，所述氧化剂的加入体积为所述磷酸盐缓冲液的1‰-5‰。
在本发明的一种优选实施方式中，基于所述盐溶液的总质量，所述盐的质量分数为10％-30％。
在本发明的一种更优选实施方式中，所述盐溶液中的盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。
在本发明的一种优选实施方式中，在对牛跟腱进行切片之前，先对所述牛跟腱进行预处理；所述预处理为用水对牛跟腱进行反复冲洗，之后用质量分数为20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反复冲洗。
在本发明的一种优选实施方式中，先对牛跟腱进行切片，再用水反复冲洗，去除水分。
在本发明的一种优选实施方式中，所述切片为冷冻切片。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：采用本发明提供的从牛跟腱中提取胶原的方法获得胶原三股螺旋结构完整性好，纯度高，并且该方法简单，无需高端设备，提取成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种实施例提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法获得的胶原的SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明一种实施例提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法获得的胶原的红外光谱图；
图3为本发明一种实施例提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法获得的胶原的紫外光谱图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
一种从牛跟腱中提取胶原的方法，包括以下步骤，
先对牛跟腱进行切片；
再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；
然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；
最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。
本发明提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法，先将牛跟腱切成薄片，使胶原容易从牛跟腱中释放出来，再用无花果蛋白酶进行酶水解，使紧致的切片的牛跟腱变得松散，对其中的胶原进行初步提取，无花果蛋白酶是植物来源的蛋白酶不但具有很好的提取胶原的效果，人体对其不具有排异性，而且相对于动物来源的蛋白酶避免了免疫原干扰。磷酸盐缓冲溶液为无花果蛋白酶的活性提供适宜条件。然后用氢氧化钠进行碱水解，一定浓度的氢氧化钠可以去除牛跟腱自身携带的朊病毒等致病因素，并能进一步使胶原从牛跟腱中解离出来，一定浓度的盐溶液使解离出的胶原处于不溶状态，并容易与其它杂质和溶液分离，而且有效地防止胶原水解成胶原蛋白。将温度严格控制在4-15℃是为了防止高温时胶原降解。对产物反复清洗是除去胶原上的各种离子，再脱水，获得高纯度的三股螺旋结构完整的胶原。
从整个提取过程来看，该方法操作简单，使用的试剂比较廉价，该方法提取胶原的成本低。
需要说明的是，在碱水解疏松的牛跟腱的过程中可以轻微振荡或晃动，但不能用力搅拌，防止机械外力使胶原的肽链断裂。
需要进一步说明的是，将盐溶液的pH值调节至4-7，优选为6-7，具体操作，向盐溶液中滴加酸来调节pH值，摩尔浓度为0.05-2mol/L的硫酸溶液、盐酸溶液或乙酸溶液等。
在实际应用中，先对牛跟腱进行切片，再用水反复冲洗，去除杂质。将牛跟腱切片是为了更容易提取其中的胶原。用水反复冲洗，是为了进一步去除切片牛跟腱含有的杂质。
还有，在对牛跟腱进行切片之前，先对牛跟腱进行预处理，预处理的步骤具体可以为：用水对牛跟腱进行反复冲洗，之后用质量分数为20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反复冲洗。对整根的牛跟腱初步进行除杂，洗去表面的血污尘土等杂质，质量分数为20％-75％乙醇溶液对血污去除效果比较好，并且还能消毒杀菌，优选为质量分数为65％-75％的乙醇溶液，更优选为质量分数75％的乙醇溶液。经过漂洗，牛跟腱会变得更白，后续获得的胶原也会更白更纯。
再有，切片可以为冷冻切片，将牛跟腱于-20℃冷冻过夜，大致为7-12h，更容易将牛跟腱切成薄片，具体可以使用切片机将牛跟腱切成厚度为1-3mm的薄片。
此外，亚氯酸盐优选为亚氯酸钠。亚氯酸钠更容易在后续水洗过程中去掉。
为了增强无花果蛋白酶的水解效果，同时减少试剂成本，优选地，无花果蛋白酶在磷酸盐缓冲液中的质量分数为0.05％-0.1％。
为了进一步增强无花果蛋白酶的水解效果，为无花果蛋白酶发挥其酶水解作用提供更适宜的条件和环境，磷酸盐缓冲溶液的pH值为5-7，优选为pH值5.8-6.5，更优选为pH值6.4；磷酸根的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L，更优选为0.02-0.06，更优选为0.03mol/L。磷酸盐缓冲液可以由磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠和磷酸一氢钠中的至少一种配制而成。
作为本发明的一种改进的实施方式，氧化剂优选为过氧化氢。过氧化氢是一种氧化性很强的氧化剂，可将无花果蛋白酶灭活，同时分解成氧气和水，不会向胶原中引入其他离子。
作为本发明的一种进一步改进的实施方式，过氧化氢的加入体积为磷酸盐缓冲液的1‰-5‰。此加入量即可使无花果蛋白酶完全灭活。
作为本发明的另一种改进的实施方式，基于所述盐溶液的总质量，所述盐的质量分数为10％-30％。此浓度范围，更有利于胶原从盐溶液中析出，防止胶原发生水解而生成胶原蛋白。
作为本发明的再一种改进的实施方式，盐溶液中的盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。
需要说明的是，本发明所使用的水均为医药行业所用的纯化水，满足药典标准。
试剂和仪器
试剂均市售可得。
实施例1-4提取胶原
实施例1
选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗6次，75％酒精漂洗20min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约1mm，备用；
称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡5h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；
清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.05％无花果蛋白酶的pH值为6的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，在4℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的3‰的过氧化氢混匀后静置4h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在4℃条件下，1M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的盐酸，调整pH至6；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原5次，4000转/min离心20min，得到胶原样品，样品中固含量在30-40％。
如图1所示，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。
实施例2
选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗9次，45％酒精漂洗30min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约2mm，备用；
称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；
清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.005％无花果蛋白酶的pH值为5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，在4℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的1‰的亚氯酸钠混匀后静置4h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在4℃条件下，1.5M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的盐酸，调整pH至5；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原9次，4000转/min离心20min，得到胶原样品，样品中固含量在30-40％。
十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。
实施例3
选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗3次，20％酒精漂洗40min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约3mm，备用；
称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；
清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.1％无花果蛋白酶的pH值为5的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，在15℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的4‰的过氧化氢混匀后静置5h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在15℃条件下，1.5M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的硫酸，调整pH至4；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原10次，4000转/min离心20min，得到胶原样品，样品中固含量在30-40％。
十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。
实施例4
选取新鲜的牛跟腱组织1kg，水冲洗3次，65％酒精漂洗25min；用剪刀剔除筋膜和杂质，水洗后，-20℃冷冻过夜；切片机切片至约3mm，备用；
称取100g腱片，纯化水冲洗5次；5L的纯化水室温浸泡3h；纯化水冲洗5次，滤干水分备用；
清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.2％无花果蛋白酶的pH值为7的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，在10℃下浸泡24小时后；向其中加入体积为磷酸盐缓冲液体积的5‰的过氧化氢混匀后静置5h灭活无花果蛋白酶，纯化水冲洗；然后在10℃条件下，2M的氢氧化钠的氯化钠溶液中浸泡4天，静置中间轻轻晃动；滴加0.05mol/L的硫酸，调整pH至7；过滤收集胶原沉淀；纯化水冲洗胶原8次，4000转/min离心20min，得到胶原样品，样品中固含量在30-40％。
十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测胶原的分子量约为30万道尔顿。
实施例5胶原的结构检测
图2为实施例1提取的胶原样品的红外光谱图。从图2可知，1653.9cm-1为酰胺I带的C＝O伸缩振动吸收峰，说明样品中都存在形成三股螺旋内氢键的C＝O；1552.6cm-1为酰胺II带的N-H弯曲振动吸收峰；1239.1cm-1为酰胺III带的N-H变形峰；1239.1cm-1～1452.2cm-1范围存在的吸收峰表明胶原三螺旋结构的完整性；3422.8cm-1为胶原的N-H伸缩振动峰，说明肽链间氢键的存在；1239.1cm-1与1452.4cm-1的吸收峰强度比值为1.02，非常接近胶原特征值1.0。由此可见，本发明所制备的胶原主要为Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原的三股螺旋结构是保持较完整的。本发明提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法可保持胶原的三股螺旋结构的完整。
实施例6胶原的纯度检测
图3为实施例1提取的I型胶原样品的紫外吸收光谱图。从图3中可以看出，纯化得样品在波长217nm处有紫外光谱最大吸收峰值，说明本发明提供的一种从牛跟腱中提取胶原的方法。
由上述实施例可知，采用本发明提供的从牛跟腱中提取胶原的方法获得胶原三股螺旋结构完整性好，纯度高，并且该方法简单，无需高端设备，提取成本低。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从牛跟腱中提取胶原的方法，其特征在于，包括以下步骤，
先对牛跟腱进行切片；
再将切片的牛跟腱浸泡在无花果蛋白酶的质量分数为0.005％-0.2％的磷酸盐缓冲液中，在4-15℃下保持12-24h；
然后向所述磷酸盐缓冲液中加入氧化剂，用水冲洗所述切片的牛跟腱；所述氧化剂选自亚氯酸盐和过氧化氢中的至少一种；
最后将所述切片的牛跟腱浸泡在氢氧化钠摩尔浓度为1-2mol/L的盐溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后调节所述盐溶液的pH值为4-7，收集产物，对产物进行反复清洗，脱水处理，获得胶原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无花果蛋白酶的质量分数为0.05％-0.1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为5-7，磷酸根的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为过氧化氢。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂的加入体积为所述磷酸盐缓冲液的1‰-5‰。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述盐溶液的总质量，所述盐的质量分数为10％-30％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述盐溶液中的盐选自氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对牛跟腱进行切片之前，先对所述牛跟腱进行预处理；所述预处理为用水对牛跟腱进行反复冲洗，之后用质量分数为20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反复冲洗。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先对牛跟腱进行切片再用水反复冲洗，去除水分。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切片为冷冻切片。
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