CN110618010A - 一种骨组织石蜡切片制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨组织石蜡切片制作方法，涉及石蜡切片的制作领域，方法包括：取骨组织进行固定，置于脱钙液中进行脱钙，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理，取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，并进行伊红染色，将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。采用上述方法制作出的骨组织石蜡切片，切片显示的骨与骨周边组织形态完整、组织结构清晰、细胞形态完整、以及细胞核颗粒饱满。以此解决了现有技术中采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及石蜡切片的制作领域，尤其涉及一种骨组织石蜡切片制作方法。
背景技术
骨组织(osseous tissue)是一种坚硬的结缔组织，也是由细胞、纤维和基质构成的。纤维为骨胶纤维(和胶原纤维一样)，基质含有大量的固体无机盐。近年来，骨骼疾病发病率越来越高，严重威胁人类的健康；同时，骨骼疾病也是畜牧养殖业中一个持续存在的问题，特别是骨代谢疾病导致的死亡已造成巨大的经济损失。因此，需要对骨骼疾病进行深入的研究，骨组织切片是从组织和细胞的角度得出骨骼疾病的形态改变依据，以得到相应的诊断结果。
骨组织是非常坚硬的，含有大量的无机钙盐是其最大的特点。因此，在制作骨组织切片的过程中，需要进行脱钙处理，以溶解钙盐。采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的问题。
因此，现有技术中存在采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种骨组织石蜡切片制作方法，用以解决现有技术中采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
依据本发明实施例提供了一种骨组织石蜡切片的制作方法，包括以下步骤：
S101，取骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；
S102，将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；
S103，将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；
S104，取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干蜡片；
S105，将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。
优选地，脱钙液为甲酸、盐酸、以及六水氯化铝与蒸馏水的混合物。
优选地，脱钙液为：85～90％甲酸4～5ml、浓盐酸7～10ml、以及六水氯化铝5～10ml均匀混合后加入蒸馏水定容至100ml的混合物。
优选地，在步骤S103中“将脱钙后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中进行脱水”之前还包括：
通过碱中和脱钙后处理后的骨组织残余的脱钙液，并通过流水进行冲洗。
优选地，逐级脱水和透明步骤具体包括：
将染色后的蜡片经65～75％乙醇，80～85％乙醇，90～95％乙醇Ⅰ、Ⅱ、以及无水乙醇逐级脱水1～3min，将经过逐级脱水的蜡片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明5min。
优选地，步骤S104中“将蜡块切成蜡片”具体包括：将蜡块切成厚度为5～8um的蜡片。
优选地，步骤S103中“取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理”具体包括：
将骨组织块置于预浸液内4～5h，再置于已融化的混合蜡液中浸蜡4～6h；其中，预浸液为正丁醇和石蜡混合溶液，混合蜡为石蜡和蜜蜡的混合物。
优选地，预浸液为正丁醇和石蜡按体积1:2混合的混合溶液。
优选地，混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物。
优选地，混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物的熔点为58°～60°。
综上所述，根据本发明实施例提供的一种骨组织石蜡切片制作方法，涉及石蜡切片的制作领域，方法包括：取骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干蜡片；将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。采用上述方法制作出的骨组织石蜡切片，切片显示的骨与骨周边组织形态完整、组织结构清晰、细胞形态完整、以及细胞核颗粒饱满。以此解决了现有技术中采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
上述说明仅是本发明实施例技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明实施例的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明实施例的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明实施例的具体实施方式。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为本发明第一实施例提供的一种骨组织石蜡切片制作方法流程图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
请参阅图1，为本发明实施例提供的一种骨组织石蜡切片制作方法的流程图，一种骨组织石蜡切片的制作方法，包括如下步骤：
S101，取骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；
在白鼠死体上剪取骨组织，剪取的骨组织的体积尽量小，体积大小可以是(3～6)*(3～6)mm2，并且剪取的骨组织尽量包含软骨。清理骨组织周边的软组织部分，将剪取的骨组织置于10％生理盐甲醛溶液中。
S102，将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；
将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的软组织带有甲醛，需要对其进行生理盐水或清水进行冲洗，去除生理盐甲醛溶液的残留之后置于脱钙液中进行脱钙，直至骨组织完全变软，且用尖针可以刺入骨组织即可。
S103，将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；
将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，可以对组织进行脱水，存放时间可以为4h，将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，并将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理。
S104，取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干蜡片；
S105，将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。
本实施例所提供的骨组织石蜡切片制作方法制作的骨组织切片，切片显示的骨与骨周边组织形态完整、组织结构清晰、细胞形态完整、以及细胞核颗粒饱满。以此解决了现有技术中采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
优选地，脱钙液为甲酸、盐酸、以及六水氯化铝与蒸馏水的混合物。
具体实施时，将甲酸、盐酸、以及六水氯化铝在蒸馏水中充分搅拌以得到脱钙液，并且在骨组织通过该脱钙液进行脱钙时需要使脱钙液处于流动状态，以便于脱钙液与骨组织充分接触。
优选地，脱钙液为：85～90％甲酸4～5ml、浓盐酸7～10ml、以及六水氯化铝5～10ml均匀混合后加入蒸馏水定容至100ml的混合物。
本实施例中，脱钙液为：85～90％甲酸4～5ml、浓盐酸7～10ml、以及六水氯化铝5～10ml，将甲酸、盐酸、以及六水氯化铝在蒸馏水中充分搅拌后加入蒸馏水定容，以便于完全淹没骨组织，并且在搅拌脱钙液过程中不会损伤置于脱钙液中的骨组织。
优选地，在步骤S103中“将脱钙后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中进行脱水”之前还包括：
通过碱中和脱钙后处理后的骨组织残余的脱钙液，并通过流水进行冲洗。
具体实施时，由于脱钙液中存在一定的酸性物质，为了防止酸性物质对后续脱水及透明过程对骨组织产生影响，需要采用碱进行中和，中和后通过流水进行冲洗。
优选地，逐级脱水和透明步骤具体包括：
将染色后的蜡片经65～75％乙醇，80～85％乙醇，90～95％乙醇Ⅰ、Ⅱ、以及无水乙醇逐级脱水1～3min，将经过逐级脱水的蜡片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明5min。
具体实施时，将蜡片进行脱水和透明处理，将染色后的蜡片经65～75％乙醇，80～85％乙醇，90～95％乙醇Ⅰ、Ⅱ、以及无水乙醇逐级脱水1～3min；同时，将经过逐级脱水的蜡片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明5min。从低浓度到高浓度的逐级脱水，可以降低高浓度乙醇对骨组织的伤害，并且能充分的将骨组织内的水渗透出来，使得石蜡完全进入骨组织内。
优选地，步骤S104中“将蜡块切成蜡片”具体包括：将蜡块切成厚度为5～8um的蜡片。
具体实施时，将蜡片切成厚度为5～8um，有利于后续对骨组织切片的细胞进行观察。
优选地，步骤S103中“取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理”具体包括：
将骨组织块置于预浸液内4～5h，再置于已融化的混合蜡液中浸蜡4～6h；其中，预浸液为正丁醇和石蜡混合溶液，混合蜡为石蜡和蜜蜡的混合物。
优选地，预浸液为正丁醇和石蜡按体积1:2混合的混合溶液。
优选地，混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物。
具体实施时，将蜜蜡按80～90％：10～20％的配比，可以提高包埋蜡的硬度，在切片过程中不会破坏骨组织内的组织结构。
优选地，混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物的熔点为58°～60°。
综上所述，根据本发明实施例提供的一种骨组织石蜡切片制作方法，涉及石蜡切片的制作领域，方法包括：取骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干蜡片；将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。采用上述方法制作出的骨组织石蜡切片，切片显示的骨与骨周边组织形态完整、组织结构清晰、细胞形态完整、以及细胞核颗粒饱满。以此解决了现有技术中采用常规的切片制作方法制作骨组织切片时，制作时间长，制作过程中容易改变骨组织结构，并且存在染色效果不佳的技术问题。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101，取骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；
S102，将骨组织从生理盐甲醛溶液中取出，取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；
S103，将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；
S104，取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干所述蜡片；
S105，将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的所述蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。
2.根据权利要求1所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述脱钙液为甲酸、盐酸、以及六水氯化铝与蒸馏水的混合物。
3.根据权利要求2所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述脱钙液为：85～90％甲酸4～5ml、浓盐酸7～10ml、以及六水氯化铝5～10ml均匀混合后加入蒸馏水定容至100ml的混合物。
4.根据权利要求3所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，在步骤S103中“将脱钙后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中进行脱水”之前还包括：
通过碱中和脱钙后处理后的骨组织残余的脱钙液，并通过流水进行冲洗。
5.根据权利要求1所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述逐级脱水和透明步骤具体包括：
将染色后的蜡片经65～75％乙醇，80～85％乙醇，90～95％乙醇Ⅰ、Ⅱ、以及无水乙醇逐级脱水1～3min，将经过逐级脱水的蜡片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明5min。
6.根据权利要求1所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，步骤S104中“将蜡块切成蜡片”具体包括：将蜡块切成厚度为5～8um的蜡片。
7.根据权利要求1至6任一项所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，步骤S103中“取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理”具体包括：
将骨组织块置于预浸液内4～5h，再置于已融化的混合蜡液中浸蜡4～6h；其中，所述预浸液为正丁醇和石蜡混合溶液，所述混合蜡为石蜡和蜜蜡的混合物。
8.根据权利要求7所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述预浸液为正丁醇和石蜡按体积1:2混合的混合溶液。
9.根据权利要求7所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物。
10.根据权利要求8所述的骨组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，所述混合蜡为石蜡和蜜蜡按80～90％：10～20％的配比的混合物的熔点为58°～60°。
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