CN109425523A - 骨髓标本处理方法、脱钙液及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种骨髓标本处理方法、脱钙液及用途，所述处理方法至少包括将骨髓组织依次进行以下处理：固定和第一次脱钙、脱水、石蜡包埋、粗修、第二次脱钙、切片；所述脱钙液至少包括：甲酸、甲醛以及蒸馏水，所述甲酸的质量分数为97～99%，所述甲酸、甲醛以及水的体积比为198～202：48～52：190～210。采用本发明所述的脱钙液剂方法来处理骨髓标本，能够获得组织结构较为完整和细胞结构清晰的切片，有利于切片的镜下观察。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨髓标本处理方法、脱钙液及用途，属于医学化工领域。
背景技术
骨髓活检(BMB)技术在骨髓制片诊断中越来越具有优越性，但骨髓组织含有大量矿化物质，给制片造成很大难度，而且骨髓本是各种细胞的发源地，细胞种类和形态极为丰富仅有常规制片诊断难度极大，因而必须结合免疫组化染色以利于准确诊断。
在骨髓组织中富含有钙盐和脂肪组织，必须先进行脱钙处理后进行组织切片。骨髓标本传统的处理方式包括以下步骤：取材、固定和脱钙、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色等。传统的脱钙液时间不宜控制，需不断用针刺标本并观察标本的脱钙情况，若脱钙不彻底，制片难度加大，甚至切不出蜡片。脱钙过度致使细胞溶解和组织破坏，导致组织报废。总的来说，时间无法掌控，需要随时观测标本。
Bouin's液是骨髓病理标本的常规固定液，具有固定作用，对组织进行脱钙处理，但Bouin's液是由甲醛、苦味酸、冰醋酸构成，有明显的缺点，冰醋酸有强烈的刺激气味，冰醋酸低于15℃不能沉淀白蛋白、球蛋白，不能保存糖，也不能固定脂肪和类脂。苦味酸酸性强，能够沉淀一切蛋白质，但穿透能力差，对组织收缩明显，对脂肪和类脂无固定作用，获得的切片往往造成组织细胞免疫抗原的破坏、丢失影响免疫组化结果。
传统脱钙液在脱钙的同时往往造成组织细胞形态改变，Bouin's液能造成骨髓组织免疫抗原的破坏、丢失影响免疫组化结果。优质的固定液不仅使组织保持生物活性，防止组织腐败变质，且使得切片更加容易，因此合理地选择固定液对病理技术乃至整个病理工作起着举足轻重的作用。
因此，一种性能优异的标本固定液十分有利于组织切片和观察，既进一步完善固定、脱钙，减少组织固定不佳、抗原破坏和丢失而造成抗原移位，浓度不够或严重交叉反应，又可减少酸对组织的损伤，最大程度的避免由此造成的假阳性或假阴性表达。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种骨髓标本处理方法、脱钙液及用途，用于解决现有技术中骨髓标本切片不清晰，结构不清楚，染色不鲜明，脱钙时间难以控制的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供了一种骨髓标本处理方法，所述方法包括将骨髓组织依次进行以下处理：固定和第一次脱钙、脱水、石蜡包埋、粗修、第二次脱钙、切片。
固定和第一次脱钙是指将取材后骨髓组织进行加入脱钙液中浸泡。使蛋白质凝固，保留组织形态、组织细胞的抗原性。
脱水是指将骨髓组织加入脱水机中进行脱水处理，包括固定，从低浓度逐级到高浓度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡。脱水目的：组织经过固定和水洗后含大量水分，水不能与石蜡混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。常用脱水试剂：酒精(乙醇),为了避免组织脱水收缩，在用酒精脱水时，应采取梯度脱水，从70％酒精开始，经80％、90％、95％的酒精，而后至无水乙醇。透明的目的：为了能使石蜡浸入组织，组织脱水后，必须选一种既能与酒精相溶，又能溶解石蜡的溶剂，通过媒介作用，而达到石蜡浸入组织的目的。透明试剂：二甲苯30min，时间不宜过长。浸蜡：组织透明后，在融化的石蜡内浸渍的过程。
石蜡包埋是指将骨髓组织包埋于石蜡中，便于切出薄切片。
粗修是指对骨髓组织进行修整、切面修平，将骨髓组织暴露出来。
第二次脱钙是指将初修完的骨髓标本加入到脱钙液中浸泡。
所述固定和第一次脱钙使用的脱钙液液至少包括以下原料组分：甲酸、甲醛以及蒸馏水，所述甲酸、甲醛以及蒸馏水的体积比例为：198～202:48～52:190～210。所述甲酸是指甲酸体积分数为97～99％的甲酸水溶液。
更优选地，所述脱钙液还包括丙三醇，所述甲酸、甲醛、水以及丙三醇的体积比为248～252：48～52：190～210：48～52。
优选地，所述固定和第一次脱钙的时间为100～140min。
优选地，所述脱水的时间为12～14h。
优选地，所述第二次脱钙抵用的脱钙液至少包括：盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水，所述盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水的体积比例为：48～52：23～27：23～27：398～402。所述盐酸是指盐酸体积分数为35～37％的盐酸水溶液。
优选地，所述第二次脱钙的时间为25～35min。
本发明的另一方面提供了一种骨髓标本脱钙液，脱钙液至少包括以下组分：甲酸、甲醛以及蒸馏水，所述甲酸、甲醛以及水的体积比为198～202：48～52：190～210。所述甲酸是指甲酸质量分数为97～99％的甲酸水溶液。
优选地，所述骨髓标本脱钙液还包括丙三醇，所述甲酸、甲醛、水以及丙三醇的体积比为248～252：48～52：190～210：48～52。
本发明的另一方面公开了上述脱钙液用于处理骨髓标本的用途。
进一步地，所述用途是指利用骨髓脱钙液对骨髓组织进行第一次脱钙和固定。
本发明的另一方面提供了一种骨髓标本脱钙液，脱钙液至少包括以下组分：盐酸、甲醛、蒸馏水，所述盐酸、甲醛以及蒸馏水的体积比例为：48～52：23～27：398～402。
优选地，所述骨髓标本脱钙液还包括丙三醇，所述盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水，所述盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水的体积比例为：48～52：23～27：23～27：398～402。
本发明的另一方面公开了上述脱钙液用于处理骨髓标本的用途。
进一步地，所述用途是指利用骨髓脱钙液对骨髓组织进行第二次脱钙。
如上所述，本发明的骨髓标本脱钙液及其处理方法和用途，具有以下有益效果：
采用特殊的脱钙液对骨髓组织经过两次脱钙处理，使得组织切片时更加容易，流畅，确保其切片结构的完整性。
本发明中所述的脱钙液，其中甲酸既含有羧基，又含有醛基，既可以应用其酸性对组织进行沉淀固定，又可以与蛋白质交联进行固定，性能相对温和，作用缓慢，甲酸分子小于乙酸，远小于苦味酸；甲醛为交联性固定剂，不能沉淀白蛋白和核蛋白，能与许多氨基酸反应；丙三醇，俗称甘油，属于多元醇类甘油。
所述脱钙液穿透力更强，固定更加迅速；同时能够对组织进行脱钙软化处理，降低组织的硬度，减少切片的阻力，以保持组织切片的完整性，可以达到固定的目的；渗透力强，可以通过网格状交联蛋白质分子而达到固定组织的作用，且固定效果均匀，并可适度保护组织免受酸的侵蚀，组织收缩小，确保其切片结构的完整性；通过实验发现特别适用于免疫组化染色，保护组织细胞形态，无明显的膨胀和收缩，减少免疫抗原的破坏和丢失，减少免疫组化结果的假阳性或假阴性表达；对抗原的影响方面较小；组织切片时更加容易，流畅。
附图说明
图1显示为实施例2中对照例的骨髓组织HE染色结果在40倍镜下的观测结果。
图2显示为实施例2中骨髓组织HE染色结果在40倍镜下的观测结果。
图3显示为实施例3中对照例的骨髓组织HE染色结果在400倍镜下的观测结果。
图4显示为实施例3中骨髓组织HE染色结果在400倍镜下的观测结果。
图5显示为实施例4中对照例的骨髓组织免疫组化染色结果在400倍镜下的观测结果。
图6显示为实施例4中骨髓组织免疫组化染色结果在400倍镜下的观测结果。
图7显示为实施例5中对照例的骨髓组织免疫组化染色结果在400倍镜下的观测结果。
图8显示为实施例5中骨髓组织免疫组化染色结果在400倍镜下的观测结果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
脱水机：Excelsior ES全自动脱水机
组织包埋机：Histostar TM组织包埋机
切片机：LEICA RM2235
摊片机：LEICA HI1210
烘箱：VWR 414005-115
实施例1骨髓病理标本制作
(1)骨髓活检组织取材(上海新培晶医学检验所)。
(2)组织固定、第一次脱钙处理：将上述骨髓组织加入到脱钙液中浸泡120min，骨髓脱钙液的组分：200mL甲酸(99％)和50mL甲醛52mL丙三醇、200mL蒸馏水。
(3)脱水(固定-脱水-透明-浸蜡)12h。
(4)包埋：将骨髓组织包埋入石蜡中。
(5)粗修：使组织切面暴露出来。
(6)第二次脱钙处理：将骨髓组织加入脱钙液中进行第二次脱钙，时间为30min，其中脱钙液的组分：50mL浓盐酸(35％)和25mL甲醛、25mL丙三醇、400mL蒸馏水。
(7)切片：切片厚度在约为3微米，获得实验例切片。
同时制作对比例：将步骤(5)粗修之后的骨髓组织直接进行切片获得。
(8)摊片：在摊片机上让组织切片在温水中展开。
(9)捞片：用载玻片捞起贴在其上。
(10)烤片：切片置于70℃恒温烤箱中，烤片1h。
实施例2骨髓组织HE染色
对实施例1中制备的实验例以及对比例进行以下操作：
染色：①石蜡切片经二甲苯脱蜡3次，每次10分钟。②放入100％、95％、85％、70％梯度的乙醇水化，每浓度2次，每次2分钟。③苏木素染色5分钟(贝索)，流水冲洗3-5分钟，分化10秒，反蓝3分钟，伊红染色5-10秒(贝索)，脱水、透明、封固。
HE染色后，结果采用显微镜(BX51)观察，实验例结果如图2所示；在对比例观察结果如图1所示。
通过图1和图2可见，图2较图1组织切片完整，细胞结构清晰，厚薄均匀，无褶皱或折叠，无刀痕或裂隙透明度好，着色均匀。
实施例3骨髓病理标本制备及HE染色
(1)骨髓活检组织取材(上海新培晶医学检验所)。
(2)组织固定、第一次脱钙处理：将上述骨髓组织加入到脱钙液中浸泡100min，骨髓脱钙液的组分：198mL甲酸和52mL甲醛48mL丙三醇、210mL蒸馏水。
(3)脱水(固定-脱水-透明-浸蜡)12h。
(4)包埋：将骨髓组织包埋入石蜡中。
(5)粗修：利用切片机使组织切面暴露出来。
(6)第二次脱钙处理：将骨髓组织加入脱钙液中进行第二次脱钙，时间为25min，其中脱钙液的组分：50mL浓盐酸(35％)和25mL甲醛、25mL丙三醇、400mL蒸馏水。
(7)切片：切片厚度在约为3微米，获得实验例；同时制作对比例：将步骤(5)粗修之后的骨髓组织直接进行切片获得。
(8)摊片：让组织切片在温水中展开。
(9)捞片：用载玻片捞起贴在其上。
(10)烤片：切片置于70℃恒温烤箱中，烤片1h。
(11)染色：①石蜡切片经二甲苯脱蜡3次，每次10分钟。②放入100％、95％、85％、70％梯度的乙醇水化，每浓度2次，每次2分钟。③苏木素染色5分钟(贝索)，流水冲洗3-5分钟，分化10秒，反蓝3分钟，伊红染色5-10秒(贝索)，脱水、透明、封固。
结果采用显微镜(BX51)观察，其结果如图4所示；在对比例观察结果如图3所示。
通过图3和图4可见，图4较图3组织切片完整，细胞结构清晰，厚薄均匀，无褶皱或折叠，无刀痕或裂隙透明度好，着色均匀。
实施例4骨髓组织免疫组化染色
对实施例1中制备的实验例以及对比例进行以下操作：
(1)脱蜡：二甲苯脱蜡3缸，10分钟/每缸，梯度酒精100％、100％、85％、70％，2分钟/每缸。
(2)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(3)热修复：高压锅内预热pH6.0柠檬酸修复液，沸腾后将玻片置于其中，待限压阀转动喷气后开始计时2分30秒，取出后自然晾凉20分钟。
(4)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(5)封闭：3％过氧化氢，室温孵育15分钟，蒸馏水清洗干净。
(6)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(7)一抗：滴加适量一抗MPO，37℃1小时。(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)
(8)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(9)二抗：滴加适量的检测系统，PV-9000，试剂I 37℃15分钟，PBS清洗3次，2分
钟/每次，试剂II 37℃15分钟，PBS清洗3次，2分钟/每次。
(10)DAB显色：2管DAB显色，现配现用，5min。
(11)苏木素复染：苏木素复染2分钟，自来水洗干净，盐酸酒精分化(快速)，温水
返蓝5分钟，逐级梯度酒精脱水。
(12)封片：二甲苯透明、封片。
结果采用显微镜(BX51)观察，实验例观察结果如图6，对比例观察结果如图5。图6较图5细胞结构完整，抗体表达清晰，背景干净，细胞染色结果鲜明、阴阳性对比清楚，无非特异性着色干扰。
实施例5
(1)骨髓活检组织取材(上海新培晶医学检验所)。
(2)组织固定、第一次脱钙处理：将上述骨髓组织加入到脱钙液中浸泡140min，骨髓脱钙液的组分：202mL甲酸(97％)和48mL甲醛52mL丙三醇、190mL蒸馏水；同时制备对比例，将对比例加入Bouin's液中进行脱钙和固定。
(3)脱水(固定-脱水-透明-浸蜡)12h。
(4)包埋：将骨髓组织包埋入石蜡中。
(5)粗修：使组织切面暴露出来。
(6)第二次脱钙处理：将骨髓组织加入脱钙液中进行第二次脱钙，时间为35min，其中脱钙液的组分：50mL浓盐酸和25mL甲醛、25mL丙三醇、400mL蒸馏水。
(7)切片：切片厚度在约为3微米；同时制作对比例：对实验例和对比例同时进行以下操作：
(8)之后的骨髓组织直接进行切片获得。
(9)摊片：让组织切片在温水中展开。
(10)捞片：用载玻片捞起贴在其上。
(11)烤片：切片置于70℃恒温烤箱中，烤片1h。
(12)脱蜡、脱水：二甲苯脱蜡3缸，10分钟/每缸，梯度酒精100％、100％、85％、70％，2分钟/每缸。
(13)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(14)热修复：高压锅内预热pH6.0柠檬酸修复液，沸腾后将玻片置于其中，待限压阀转动喷气后开始计时2分30秒，取出后自然晾凉20分钟。
(15)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(16)封闭：3％过氧化氢，室温孵育15分钟，蒸馏水清洗干净。
(17)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(18)一抗：滴加适量一抗MPO，37℃1小时。(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)
(19)PBS清洗3次，2分钟/每次。
(20)二抗：滴加适量的检测系统，PV-9000，试剂I 37℃15分钟，PBS清洗3次，2分钟/每次，试剂II 37℃15分钟，PBS清洗3次，2分钟/每次。
(21)DAB显色：2管DAB显色，现配现用，5min。
(22)苏木素复染：苏木素复染2分钟，自来水洗干净，盐酸酒精分化(快速)，温水返蓝5分钟，逐级梯度酒精脱水。
(23)封片：二甲苯透明、封片。
结果采用显微镜(BX51)观察，实验例观察结果如图8，对比例观察结果如图7。图8较图7细胞结构完整，抗体表达清晰，背景干净，细胞染色结果鲜明、阴阳性对比清楚，无非特异性着色干扰。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种骨髓标本处理方法，其特征在于，所述处理方法至少包括将骨髓组织依次进行以下处理：固定和第一次脱钙、脱水、石蜡包埋、粗修、第二次脱钙、切片。
2.根据权利要求1所述的骨髓标本处理方法，其特征在于：所述固定和第一次脱钙使用的脱钙液至少包括以下原料组分：甲酸、甲醛以及蒸馏水，所述甲酸、甲醛以及蒸馏水的体积比例为：198～202:48～52:190～210。
3.根据权利要求2所述的骨髓标本处理方法，其特征在于：所述脱钙液还包括丙三醇，所述甲酸、甲醛、水以及丙三醇的体积比为248～252：48～52：190～210：48～52。
4.根据权利要求1所述的骨髓标本处理方法，其特征在于：所述固定和第一次脱钙的时间为100～140min；所述第二次脱钙的时间为25～35min。
5.根据权利要求1所述的骨髓标本处理方法，其特征在于：所述第二次脱钙使用的脱钙液至少包括以下原料组分：盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水，所述盐酸、甲醛、丙三醇以及蒸馏水的体积比例为：48～52：23～27：23～27：398～402。
6.一种骨髓标本脱钙液，其特征在于，所述脱钙液至少包括以下组分：甲酸、甲醛以及蒸馏水，所述甲酸、甲醛以及水的体积比为198～202：48～52：190～210。
7.根据权利要求6所述的骨髓标本脱钙液，其特征在于：所述骨髓标本脱钙液还包括丙三醇，所述甲酸、甲醛、水以及丙三醇的体积比为248～252：48～52：190～210：48～52。
8.如权利要求6～7任意项所述的骨髓标本脱钙液用于处理骨髓标本的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途是指利用骨髓脱钙液对骨髓组织进行第一次脱钙和固定。
10.一种骨髓标本脱钙液，其特征在于，所述脱钙液至少包括以下原料组分：盐酸、甲醛、蒸馏水，所述盐酸、甲醛以及蒸馏水的体积比例为：48～52：23～27：398～402。
11.如权利要求10所述的骨髓标本脱钙液用于处理骨髓标本的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述用途是指利用骨髓脱钙液对骨髓组织进行第二次脱钙。
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