CN101057884A - 一种治疗骨质疏松症的新的中药材及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗骨质疏松症的新的中药材，其中制备该种新药材原料重量配比组成为：黑大豆1000份、淫羊藿140～200份。本发明还公开了该种新药材的制备方法及用途。本发明还公开了淡豆豉对骨质疏松症的治疗的新用途。在治疗骨质疏松症时可以单独使用该种新药材或淡豆豉，或与其他药物组合制备成在临床上可以使用的各种剂型的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，具体地，涉及一种治疗骨质疏松症的新的中药材及其制备方法，和淡豆豉对治疗骨质疏松症的治疗新用途。
背景技术
根据2005年《中国药典》第230页记载的淡豆豉，为豆科植物大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的成熟种子的发酵产品，其味苦、辛、凉。归肺、胃经。功能是解表，除烦，宣发郁热。用于感冒、寒热头痛，烦躁胸闷，虚烦不眠。而未见其有其他功效之报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种治疗骨质疏松症的新的中药材，该种新药材暂时可以称为：仙豆豉(以下可称：“仙豆豉”)，其中该药材的制备原料重量配比为：黑大豆1000份、淫羊藿140～200份。
本发明的目的之一是提供一种治疗骨质疏松症的新的中药材，其中该药材的制备原料重量配比为：黑大豆1000份、淫羊藿150-190份。
本发明的目的之一是提供一种治疗骨质疏松症的新的中药材，其中该药材的制备原料重量配比为：黑大豆1000份、淫羊藿165g～175份。
本发明的目的之一是提供一种治疗骨质疏松症的新的中药材，其中该药材的制备原料重量配比为：黑大豆1000份、淫羊藿170份。
本发明的另一目的是提供一种制备该种治疗骨质疏松症的的新的中药材的方法，其包括如下步骤：
(1)按上述配比称取原料；
(2)淫羊藿的煎煮提取
将淫羊藿切碎，加5～10倍量的水，煎煮提取1-3次，每次60分钟，首次提取前在加水后先浸泡2小时，然后加热煎煮提取；合并两次提取液，浓缩至适当体积，得药汁，备用；药渣摊凉、晾干，留用；
(3)浸泡黑大豆
洗拣黑大豆，加入步骤(2)制取的药汁，浸泡适当的时间，待药汁基本吸收，豆粒充分饱胀；
(4)蒸煮黑大豆
将步骤(3)所得黑大豆置蒸锅内，隔水蒸煮至熟透；
(5)发酵黑大豆
将步骤(4)所得黑大豆置洁净房间内，摊凉，晾干水气，置适当容器，衬垫一层药渣，在药渣上疏松放置蒸熟的黑大豆，面上覆盖一层药渣，进行自然发酵，定时翻动，使发酵均匀，待豆粒上长满菌丝，至黄衣上遍时终止发酵，将发酵后的材料取出，筛选，除去药渣，将豆粒摊开晒干或50℃干燥，即得。
本发明的另一目的是提供一种制备治疗骨质疏松症的中药新药材的方法，其特征在于上述方法还包括在步骤(3)的浸泡步骤中室温为25℃、浸泡时间为8小时。
本发明的另一目的是提供一种制备治疗骨质疏松症的中药新药材的方法，其特征在于上述方法还包括在步骤(5)所述发酵步骤中室温在25℃～30℃，相对湿度40％-70％左右，发酵容器的豆粒中心点温度不超过35℃。
本发明所用黑大豆为豆科植物黑大豆(Glycine max(L.)Merr.)的黑色种皮栽培品系的成熟种子。产地河北省华北平原。
本发明所用淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornumMaxim.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimediumwushanense T.S.Ying)或朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干燥地上部分。
制作条件的确定和影响因素的控制：
药液的浓缩程度∶黑大豆吸收药汁的比例约为1∶1，故重量配比的药材煎煮提取液的浓缩程度需掌握好这个体积；
浸泡时间的控制：浸泡时间不能太短，也不能太长，时间太短，药液未能充分吸收，太长则可能酸败变质。浸泡时间以控制室温25℃时8小时适宜，以大豆颗粒饱胀，药汁吸尽为度；
蒸煮程度的确定：黑大豆蒸煮主要使大豆组织软化，蛋白质适当变性，有利于发酵时菌体分泌酶作用于蛋白质，利用营养物质，进行正常的繁殖。如果蒸煮不透或过度，均会出现异常发酵现象。
蒸煮过后，豆粒表皮带有较多的水分，不利于发酵，应摊凉至室温并晾干表面水分，至表皮开始出现皱缩为度。
发酵方式的确定：发酵过程中，直接影响发酵质量的条件和因素主要是发酵环境的洁净度和温湿度、豆粒堆放的厚度和疏松程度、发酵时间和发酵温度等。由于该制作过程是自然发酵，因此对发酵环境而言既要保持一定的洁净度，又要容许存在一定的菌落数。我们对发酵室进行一般的隔离和清洁，再用甲醛作熏蒸消毒处理，发酵室中所用的器具用过氧乙酸或70％乙醇擦拭即可达到要求。房间不必严格封闭，室内空气也不必进行过滤，但要控制室温在25℃～30℃，相对湿度40％-70％左右。发酵时，豆粒的堆积厚度要进行适当控制，以5～10cm一层的厚度为适宜，堆放时要使豆粒疏松放置，容器上、下要用药渣铺垫，多余的药渣也可与豆粒混匀放入一起发酵。这样可使豆粒间保持一定的空间，有足够的空气和散热的条件，利于发酵成功。
发酵温度的控制包括两个方面：一是环境温度要控制在25℃～30℃；二是发酵容器中豆粒内部发酵温度的控制，可用温度计插入每个发酵容器的豆粒中心点进行测试和监控，要求不超过35℃。发酵过程中，由于霉菌的新陈代谢而使堆积的豆粒出现发热升温现象，如不设法加于控制，温度可升至40℃以上，由此造成发酵异常，影响成品质量，应该用定时翻动的方法帮助散热，同时可使发酵均匀。
发酵时间的长短，主要从半成品的发酵程度进行判断，加以控制。在整个发酵过程中，菌丝在豆粒表面开始生长，待菌丝长遍豆粒外表面后，开始侵入豆粒内部，然后表面菌丝体开始溶化，颜色逐渐变黄而出现包裹于豆粒表面的“黄衣”，待到“黄衣上遍”，发酵即可终止。
器皿对发酵速度的影响：在实验过程中选择了玻璃、不锈钢、塑料、陶瓷为容器，得到结果，玻璃器皿与外界隔绝，散热较慢，发酵过程中，豆粒易腐烂；塑料器皿与外界隔绝，散热较慢，发酵过程中，豆粒易腐烂；不锈钢器皿虽与外界隔绝，但散热较顺利，豆粒温度易于控制，发酵过程中豆粒基本完好；陶瓷器皿散热较顺利，同时与外界水分交流通畅，豆粒中水分含量不会过高，豆粒温度易于控制，发酵过程中豆粒完好。
制备成品得率约为70％-75％。
本发明的另一目的是提供淡豆豉在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用，其中原料重量配比包括：黑大豆1000份，青蒿70～100份，桑叶70～100份。
本发明中的仙豆豉和淡豆豉在治疗骨质疏松症时的可以采用《中药制剂学》上常用的提取方法进行处理，如水提、醇提等。在临床上可以单独使用，或和药学上可接受的其他药物组合制成口服给药的剂型或非口服给药的剂型。
具体实施方式
实施例1
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿170份；
原药的来源：
黑大豆：本品为豆科植物黑大豆(Glycine max(L.)Merr.)的黑色种皮栽培品系的成熟种子。产地河北省华北平原，从石家庄市祥隆泰超市采购；
淫羊藿：小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)产地四川，从石家庄市乐仁堂药材公司批发部采购。
2.制备流程
(1)取原料药黑大豆1000份，淫羊藿150份；
(2)淫羊藿的煎煮提取
将淫羊藿切碎，加6倍量的水，煎煮提取2次，每次60分钟，首次提取前在加水后先浸泡2小时，然后加热煎煮提取；合并两次提取液，浓缩至适当体积，得药汁，备用；药渣摊凉、晾干，留用；
(3)浸泡黑大豆
洗拣黑大豆，加入步骤(2)制取的药汁，浸泡适当的时间，待药汁基本吸收，豆粒充分饱胀；
(4)蒸煮黑大豆
将步骤(3)所得黑大豆置蒸锅内，隔水蒸煮至熟透；
(5)发酵黑大豆
将步骤(4)所得黑大豆置洁净房间内，摊凉，晾干水气，置适当容器，衬垫一层药渣，在药渣上疏松放置蒸熟的黑大豆，面上覆盖一层药渣，进行自然发酵，定时翻动，使发酵均匀，待豆粒上长满菌丝，至黄衣上遍时终止发酵，将发酵后的材料取出，筛选，除去药渣，将豆粒摊开晒干或50℃干燥，即得。
实施例2
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿170份；
原药的来源：同实施例1
2.制备流程
制备流程包括：药材的煎煮提取、黑大豆的浸泡和蒸煮时间以及发酵条件的控制等几个方面。
(1)淫羊藿的煎煮提取
取处方量的淫羊藿，切碎，加8倍量的水，煎煮提取3次，每次60分钟，首次提取前在加水后先浸泡2小时，然后加热煎煮提取；合并三次提取液，浓缩至适当体积，得药汁，备用；药渣摊凉、晾干，留用；
(2)黑大豆的浸泡
取处方量的黑大豆，筛、捡除去杂质、瘪粒，用水淘净泥砂灰屑，加入制取的药汁，在室温25℃时浸泡8小时，待药汁基本吸收，豆粒充分饱胀；
(3)含药汁黑大豆的蒸煮
将吸收药汁而饱胀的黑大豆置蒸锅内，隔水蒸煮至熟透，取出，备用；
(4)发酵
将蒸煮出锅的黑大豆置洁净房间内，摊凉，晾干水气，置适当容器，衬垫一层药渣，在药渣上疏松放置蒸熟的黑大豆，面上覆盖一层药渣，进行自然发酵，定时翻动，使发酵均匀，豆粒上长满菌丝，至黄衣上遍时终止发酵。将发酵后的材料取出，筛选，除去药渣，将豆粒摊开晒干或50℃干燥，即得到成品。
实施例3
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿140份；
原药的来源：同实施例1
2.制备流程同上述实施例2
实施例4
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿160份；
原药的来源：同实施例1
2.制备流程同上述实施例2
实施例5
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿180份；
原药的来源：同实施例1
2.制备流程同上述实施例2
实施例6
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿190份；
原药的来源：同实施例1
2.制备流程同上述实施例2
实施例7
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份，淫羊藿200份；
原药材的来源：同实施例1
2.制备流程同上述实施例2
实施例8
1.原料及重量配比
重量配比：黑大豆1000份、青蒿80份、桑叶80份；
原料来源：
黑大豆：本品为豆科植物黑大豆(Glycine max(L.)Merr.)的黑色种皮栽培品系的成熟种子。产地河北省华北平原，从石家庄市祥隆泰超市采购；
青蒿：本品为菊科植物黄花蒿(Artemisiaa nnuaL.)的干燥地上部分。产地江苏，从石家庄市乐仁堂药材公司批发部采购；
桑叶：本品为桑科植物桑(Morusa lbaL.)的干燥叶。产地浙江，从石家庄市乐仁堂药材公司批发部采购。
2.制备流程
制备流程主要包括以下步骤：黑大豆的洗拣、青蒿、桑叶的煎汤浸泡、含药汁黑大豆的蒸煮、发酵、干燥后即为成品。
其制作要点有：药材的煎煮提取、黑大豆的浸泡和蒸煮时间以及发酵条件的控制等几个方面。
(1)青蒿、桑叶的煎煮提取
取配比量的青蒿、桑叶，切碎，加6倍量的水，煎煮提取2次，每次60分钟，首次提取前在加水后先浸泡2小时，然后加热煎煮提取；合并两次提取液，浓缩至适当体积，得药汁，备用，药渣摊凉、晾干，留用。
(2)黑大豆的浸泡
取配比量的黑大豆，筛、捡除去杂质、瘪粒，用水淘净泥砂灰屑，加入制取的药汁，浸泡时间以控制室温25℃，8小时适宜，待药汁基本吸收，豆粒充分饱胀。
(3)含药汁黑大豆的蒸煮
将吸收药汁而饱胀的黑大豆置蒸锅内，隔水蒸至熟透，取出，备用。
(4)发酵
将蒸煮出锅的黑大豆置洁净房间内，环境温度28℃，摊凉，晾干水气，置适当容器，衬垫一层药渣，在药渣上疏松放置蒸熟的黑大豆，在黑大豆上覆盖一层药渣，进行自然发酵，发酵容器的豆粒中心点温度为30℃，定时翻动，使发酵均匀，豆粒上长满菌丝，至黄衣上遍时终止发酵。将发酵后的材料取出，筛选，除去药渣，将豆粒摊开晒干或50℃干燥，即得到淡豆豉成品。
淡豆豉及仙豆豉提取物治疗骨质疏松症的药效学试验
摘要：研究结果表明：淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(实施例2所得产品)(2g生药/kg、18g生药/kg)能明显提高去卵巢大鼠股骨、胫骨骨密度，增加胫骨骨灰重，提高股骨抗弯强度，光镜下可见骨组织形态亦较去卵巢模型组大鼠改善；可减缓大鼠去卵巢所致的增重效应；能减轻去卵巢大鼠子宫及肾上腺萎缩；对血钙含量、碱性磷酸酶无明显影响，但可回升血磷含量；可明显升高去卵巢大鼠血清雌二醇、降钙素含量，降低血清骨钙素含量；可明显改善维甲酸致骨质疏松大鼠的一般状况，减缓体重的减轻和性腺器官的萎缩，降低血清碱性磷酸酶活性，增加骨质疏松大鼠骨小梁面积密度、骨小梁宽度和骨小梁数目，增加骨密度、骨灰重及骨钙含量；可明显提高氢化可的松阳虚小鼠抗疲劳能力。研究结果为临床用药提供了必要的理论依据。
一、对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的影响
试验目的：通过观察淡豆豉提取物和仙豆豉提取物对去卵巢所致骨质疏松症大鼠的影响，以评价其治疗骨质疏松症的作用。
试验材料：
药物：如实施例8所制得的淡豆豉。称取淡豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用；仙豆豉，称取仙豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用。
动物：SD大鼠(二级)，雌性，体重200-220g，由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2003-1-003，动物饲料亦由该中心提供。
试剂：血清雌二醇放射免疫分析测试盒，北京北方生物技术研究所产品；血清降钙素放射免疫分析测试盒、血清骨钙素放射免疫分析测试盒，均为解放军总医院科技开发中心放免所产品；钙液体试剂盒，北京中生生物工程高技术公司产品；血清磷测试盒、血清碱性磷酸酶测试盒，均为石家庄市试剂厂产品。
仪器：双能x线骨密度仪(LUNAR-DPX，美国)；722光栅分光光度计(上海)；γ-计数器(西安)；CMT-8202电子万能试验机(深圳)。
试验方法：
将大鼠以350mg/kg的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，无菌条件下手术切除双侧卵巢后缝合[1]，将手术后存活大鼠随机分为去卵巢模型组，淡豆豉提取物小剂量组(2g生药/kg)、淡豆豉提取物大剂量组(18g生药/kg)及仙豆豉提取物小剂量组(2g生药/kg)、仙豆豉提取物大剂量组(18g生药/kg)，每组8只。另取8只大鼠做同样操作但不切除卵巢，仅切除一小块脂肪组织作为假手术组。于手术后第3天开始灌胃给药，假手术组和去卵巢模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，连续12周。末次给药后40分钟处死动物，处死动物当日称重，剖取肾上腺、子宫称重，计算脏器系数；剖取左侧股骨、胫骨，剔净肌肉后用双能x线骨密度仪测骨密度；然后用电子万能试验机进行三点弯曲试验测左侧股骨抗弯强度(最大负荷，跨距20mm)；将左侧胫骨以氯仿∶甲醇混合液(2∶1)脱脂72小时，置烘箱中120℃干燥6小时，在将干骨置800℃马福炉内灰化6小时，冷却后称灰重；取血标本分离血清，采用化学法测定血中钙、磷含量，碱性磷酸酶(ALP)活性；用放免法测定血清雌二醇(E)、骨钙素(BGP)、降钙素(CT)含量。采用t检验比较各组间差异情况(SPSS10.0 for windows)。
试验结果：
1.对去卵巢大鼠体重的影响
结果见表1，从结果可见，试验前各组动物体重无显著差别(P＞0.05)，实验结束时去卵巢模型组大鼠体重较假手术组明显增加(P＜0.05)，表明切除双侧卵巢可使大鼠体重增加，即去卵巢具有增重效应。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠体重均较去卵巢模型组明显减轻(P＜0.05)，提示淡豆豉提取物和仙豆豉提取物具有一定的减缓去卵巢所致的增重效应。
表1 对去卵巢大鼠体重的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 体重(g) | |
| 试验前 | 试验后 | |||
| 假手术组去卵巢模型组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 888888 | 206.2±10.8204.4±12.9201.2±15.9206.1±14.8205.3±16.6210.5±15.2 | 302.4±19.8**339.2±20.2313.7±15.6*320.1±20.2317.8±14.4*308.9±15.7** |
与去卵巢模型组比较*p＜0.05 **p＜0.05
2.对去卵巢大鼠子宫及肾上腺重量的影响
结果见表2，从结果可见，实验结束时去卵巢模型组大鼠子宫指数、肾上腺指数均较假手术组显著降低(P＜0.01)，表明切除大鼠双侧卵巢12周可引起大鼠子宫和肾上腺萎缩，尤其是子宫萎缩更为明显。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠子宫指数、肾上腺指数显著高于去卵巢模型组(p＜0.01)。提示淡豆豉提取物和仙豆豉提取物均能有效减轻去卵巢大鼠子宫及肾上腺萎缩。
表2 对去卵巢大鼠器官重量的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 子宫指数(g/100g体重) | 肾上腺指数(g/100g体重) |
| 假手术组去卵巢模型组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 888888 | 0.258±0.127**0.027±0.0060.071±0.029**0.093±0.018**0.095±0.020**0.134±0.027** | 0.031±0.004**0.014±0.0040.019±0.003**0.016±0.003**0.022±0.003**0.021±0.005** |
与去卵巢模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01
3.对去卵巢大鼠骨密度、骨灰重及骨强度的影响
结果见表3，从结果可见，实验结束时去卵巢模型组大鼠左侧股骨、胫骨骨密度、胫骨骨灰重及股骨最大负荷均明显低于假手术组(p＜0.01)，表明切除大鼠双侧卵巢12周已引起大鼠骨质疏松。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠左侧股骨、胫骨骨密度、胫骨骨灰重及股骨最大负荷均明显较去卵巢模型组升高(p＜0.05或p＜0.01)。提示淡豆豉提取物和仙豆豉提取物均能有效预防去卵巢大鼠骨质丢失，提高骨骼负载能力。
表3 对去卵巢大鼠骨密度、骨灰重及骨强度的影响 (
X±S，n＝8)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 骨密度(g/cm2) | 最大负荷(N) | 胫骨骨灰重(g) | |
| 股骨 | 胫骨 | ||||
| 假手术组去卵巢模型淡豆豉提取仙豆豉提取 | --218218 | 0.229±0.013**0.194±0.0120.218±0.018*0.219±0.017*0.214±0.013*0.224±0.024* | 0.199±0.012**0.147±0.0260.174±0.021*0.182±0.024**0.188±0.017**0.190±0.018** | 105.4±13.31**78.44±15.1195.11±13.12**96.47±8.19**98.12±15.44**98.18±13.34** | 0.375±0.033**0.256±0.0240.301±0.018**0.294±0.023**0.311±0.024**0.280±0.020* |
与去卵巢模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01
4.对去卵巢大鼠血钙、血磷及碱性磷酸酶的影响
结果见表4，从结果可见，大鼠切除双侧卵巢后各组大鼠血钙含量无明显变化(P＞0.05)，但血磷含量较假手术组明显下降(p＜0.01)，淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠血磷值均明显较去卵巢模型组高(p＜0.05或p＜0.01)，接近正常水平。各组大鼠碱性磷酸酶(ALP)活性均无明显变化(P＞0.05)。
表4 对去卵巢大鼠血液生化指标的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 血钙含量(mmol/l) | 血磷含量(mg/dl) | 碱性磷酸酶(u/dl) |
| 假手术组去卵巢模型组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 888888 | 2.44±0.262.31±0.152.55±0.332.47±0.262.59±0.272.55±0.31 | 5.88±0.58**4.11±0.675.08±1.01*5.55±0.81**5.66±0.78**5.61±0.74** | 10.55±2.0812.77±2.6412.57±2.0911.14±3.1811.27±2.3711.55±2.44 |
与去卵巢模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01
6.对去卵巢大鼠血清雌二醇、降钙素及骨钙素含量的影响
结果见表5，从结果可见，去卵巢模型组大鼠血清雌二醇、降钙素含量明显较假手术组降低(p＜0.01)，骨钙素含量明显较假手术组升高(p＜0.01)，表明去卵巢后大鼠已致激素分泌紊乱。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠血清雌二醇、降钙素含量明显较去卵巢模型组升高(p＜0.01)，骨钙素含量明显较去卵巢模型组降低(p＜0.01)。
表5 对去卵巢大鼠相关激素含量的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 雌二醇(pg/ml) | 降钙素(ng/l) | 骨钙素(цg/l) |
| 假手术组去卵巢模型组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 888888 | 161.14±85.19**40.07±6.5570.93±13.11**65.14±11.76**63.47±15.47**76.48±13.22** | 262.21±151.41±19.24233.14±227.17±232.71±219.95± | 0.93±0.37**1.81±0.521.17±0.21**0.98±0.27**0.76±0.27**0.89±0.64** |
与去卵巢模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01
结论：本研究结果表明：淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)能明显提高去卵巢大鼠股骨、胫骨骨密度，增加胫骨骨灰重，提高股骨抗弯强度，光镜下可见骨组织形态亦较去卵巢模型组大鼠改善；可减缓大鼠去卵巢所致的增重效应；能减轻去卵巢大鼠子宫及肾上腺萎缩；对血钙含量、碱性磷酸酶无明显影响，但可回升血磷含量；可明显升高去卵巢大鼠血清雌二醇、降钙素含量，降低血清骨钙素含量。
二、对维甲酸所致大鼠骨质疏松症的影响
试验目的：通过观察淡豆豉提取物和仙豆豉提取物对维甲酸致骨质疏松症大鼠的影响，评价其治疗骨质疏松症的作用。
试验材料：
药物：淡豆豉为本发明实施例所得成品。称取淡豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用；仙豆豉，称取仙豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用。
动物：SD大鼠(二级)，雄性，体重200-220g，由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2003-1-003，动物饲料亦由该中心提供。
试剂：钙液体试剂盒，北京中生生物工程高技术公司产品；血清磷测试盒、血清碱性磷酸酶测试盒为石家庄市试剂厂产品；维甲酸原料，上海南翔试剂有限公司产品。
仪器：钼靶DGX-3型50mA软射线X线机(上海医疗器械厂)；IBAS2000通用图象分析系统(KONTRON公司，美国)；5000型火焰原子吸收分光光度计(P-E公司，美国)。
试验方法：
按文献建立维甲酸骨质疏松症模型[2]。将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组(蒸馏水1ml/100g体重)、模型对照组(维甲酸70mg/kg+蒸馏水1ml/100g体重)、淡豆豉提取物小剂量组(维甲酸70mg/kg+淡豆豉提取物2g生药/kg)、淡豆豉提取物大剂量组(维甲酸70mg/kg+淡豆豉提取物18g生药/kg)及仙豆豉提取物小剂量组(维甲酸70mg/kg+仙豆豉提取物2g生药/kg)、仙豆豉提取物大剂量组(维甲酸70mg/kg+仙豆豉提取物18g生药/kg)，连续2周。2周后各组大鼠均停服维甲酸，继续给药2周。末次给药后40分钟，将大鼠用乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清，采用化学法测定血清钙、磷含量，碱性磷酸酶(ALP)活性；处死大鼠，剖取睾丸、前列腺+精囊腺称重，计算脏器系数；迅速小心剖取两侧股骨，并钝性剥离所有软组织，取左侧股骨锯断，浸入10％甲醛溶液固定，用10％稀盐酸脱钙，HE染色制成5μm骨切片，应用通用图象分析系统进行处理，测量骨小梁宽度、骨小梁面积密度、骨小梁个数(共计5个视野，每两个接合点之间为一个骨小梁)；取右侧股骨按组排列摄制X软片，将软片用图象分析系统测量扫描灰度值；摄制股骨X软片后，将右侧股骨以氯仿∶甲醇混合液(2∶1)脱脂72小时，置烘箱中120℃干燥6小时，在将干骨置800℃马福炉内灰化6小时，冷却后称灰重。取灰分精密称定适量，加6mol/L稀盐酸溶解成无色透明液体，定容10ml，使用火焰原子吸收分光光度计测定骨钙含量，采用钼兰法测定骨磷含量。采用t检验比较各组间差异情况(SPSS10.0 for windows)。
试验结果：
1.对骨质疏松大鼠体重及一般状况的影响
试验过程中发现模型对照组大鼠活动缓慢，反应迟钝，倦缩，拱背，竖毛，毛色枯槁，食量减少，体重明显减轻(P＜0.01)。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠一般状况明显较模型对照组大鼠改善，体重明显增加(P＜0.01)，结果见表6
表6 对骨质疏松大鼠体重的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 体重(g) | |
| 试验前 | 试验后 | |||
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 208.9±8.11215.4±12.29207.4±12.27215.2±12.47207.2±13.12214.1±12.94 | 270.0±15.63**210.1±12.51231.1±14.24**251.7±16.74**247.2±15.84**247.9±13.17** |
与模型对照组比较*p＜0.05 **p＜0.05
2.对骨质疏松大鼠性腺指数的影响
结果见表7，从结果可见，模型对照组大鼠睾丸指数、前列腺+精囊腺指数均较正常对照组显著降低(p＜0.05或P＜0.01)，表明大鼠灌服维甲酸已造成性腺器官萎缩。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠睾丸指数、前列腺+精囊腺指数显著高于模型对照组(p＜0.01)。
表7 对骨质疏松大鼠性腺器官重量的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 睾丸指数(g/100g体重) | 前列腺+精囊腺指数(g/100g体重) |
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 1.208±0.129**0.808±0.1661.077±0.142**0.976±0.125**0.987±0.152**1.091±0.177** | 0.502±0.077**0.255±0.0710.348±0.049*0.336±0.081*0.349±0.076*0.344±0.0671* |
与模型对照组比较*p＜0.05 **p＜0.01
4.对骨质疏松大鼠血液生化指标变化
结果见表8，从结果可见，各组大鼠血钙、血磷含量无明显变化(P＞0.05)，但碱性磷酸酶(ALP)活性较正常对照组明显升高(p＜0.01)，淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠碱性磷酸酶(ALP)活性均明显较模型对照组降低(p＜0.05或p＜0.01)。
表8 对骨质疏松大鼠血液生化指标的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 血钙含量(mmol/l) | 血磷含量(mg/dl) | 碱性磷酸酶(u/dl) |
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 2.44±0.152.08±0.192.57±0.262.54±0.212.67±0.332.47±0.21 | 5.66±0.424.55±0.714.88±0.725.33±0.885.11±0.715.10±0.66 | 10.01±2.33**16.17±5.1111.34±3.19*10.91±5.1910.94±4.44*10.98±5.17* |
与模型对照组比较*p＜0.05 **p＜0.01
5.对骨质疏松大鼠骨小梁宽度、骨小梁面积、骨小梁个数的影响
结果见表9，结果可见，模型对照组大鼠骨小梁宽度、骨小梁面积密度均明显较正常对照组大鼠降低(p＜0.01)，骨小梁个数明显较正常对照组大鼠减少(p＜0.05或p＜0.01)。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠骨小梁宽度、骨小梁面积密度及骨小梁个数均较模型对照组大鼠明显增加(p＜0.05或p＜0.01)。
表9 对骨质疏松大鼠骨小梁宽度及骨小梁面积密度的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 骨小梁数目(个) | 骨小梁面积密度 | 骨小梁宽度(μm) |
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 20.2±1.41**9.8±1.2611.7±1.66*12.8±1.49**12.4±1.55**12.4±1.28** | 0.608±0.021**0.319±0.0160.519±0.067**0.588±0.067**0.573±0.069**0.589±0.071** | 79.94±7.14**60.99±7.8174.16±9.12**76.01±7.18**78.95±9.14**76.82±7.27** |
与模型对照组相比*p＜0.05 **p＜0.01
6.对骨质疏松大鼠股骨骨密度、骨灰重的影响
结果见表10，结果显示，模型对照组大鼠扫描灰度值、骨灰重明显较正常对照组大鼠降低(p＜0.01)。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠扫描灰度值和骨灰重均较模型对照组大鼠明显增高(p＜0.05或p＜0.01)。
表10 对骨质疏松症大鼠骨密度、骨灰重的影响(
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 灰重(g) | 骨密度(扫描灰度值) |
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 0.351±0.028**0.217±0.0200.249±0.043*0.268±0.021**0.285±0.041**0.270±0.031** | 194.16±17.22**161.210±13.31172.15±14.18**179.88±15.61**180.61±14.88**175.95±16.51** |
与模型对照组相比*p＜0.05 **p＜0.01
7.对大鼠骨钙、磷含量的影响
结果见表11，从结果可见，模型对照组大鼠骨钙含量明显较正常对照组大鼠降低(p＜0.01)。淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组大鼠骨钙含量明显较模型对照组大鼠升高(p＜0.01)，但骨磷各组大鼠无明显差异。
表11 对骨质疏松症大鼠骨钙、磷含量的影响(
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 钙含量(mg/g) | 磷含量(mg/g) |
| 正常对照组模型对照组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 198.11±13.15**178.17±9.36184.18±9.47**187.57±6.81**190.54±7.57**191.46±8.22** | 132.19±16.69127.16±8.99131.84±13.07132.46±17.99128.85±10.66131.27±8.94 |
与模型对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01
结论：本试验结果表明：淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)可明显改善维甲酸致骨质疏松大鼠的一般状况，减慢体重的减轻和性腺器官的萎缩，降低血清碱性磷酸酶活性，增加骨质疏松大鼠骨小梁面积密度、骨小梁宽度和骨小梁个数，增加骨密度、骨灰重及骨钙含量。
三、对阳虚小鼠抗疲劳能力的影响
试验目的：观察淡豆豉提取物及仙豆豉对阳虚小鼠抗疲劳能力的影响
试验材料：
药物：淡豆豉为本发明实施例8所制得成品。称取淡豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用；仙豆豉，称取仙豆豉1kg，用80％乙醇冷浸24h，用80％乙醇提取三次，每次加热回流2h，乙醇量为3000ml，回收溶媒后分别制成干膏备用；氢化可的松注射液，天津氨基酸公司人民制药厂，批号20040201。
动物：昆明种小鼠，雄性，体重18-20g，由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2003-1-003，动物饲料亦由该中心提供。
试验方法：
将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、阳虚模型组淡豆豉提取物小剂量组(2g生药/kg)、淡豆豉提取物大剂量组(18g生药/kg)及仙豆豉提取物小剂量组(2g生药/kg)、仙豆豉提取物大剂量组(18g生药/kg)。各组每日灌胃给药(水)一次，容量为0.2ml/10g体重，连续给药7天，同时肌注氢化可的松0.75mg/只[3](正常对照组除外)，末次给药后1小时，进行游泳试验，试验时，分别将小鼠负重5％，投入水中，记录小鼠开始游泳到沉入水底的时间，采用t检验比较各组间差异情况(SPSS10.0 for windows)。。
试验结果：
结果见表12，从结果可见，阳虚模型组小鼠游泳时间明显较正常对照组短(P＜0.01)，淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)组小鼠游泳时间均明显较阳虚模型组长(P＜0.01)。
表12 对阳虚小鼠游泳时间的影响 (
X±S)
| 组别 | 剂量(g生药/kg) | 动物数(只) | 游泳时间(min) |
| 正常对照组阳虚模型组淡豆豉提取物仙豆豉提取物 | --218218 | 101010101010 | 7.44±0.51**4.36±0.595.79±0.67**6.19±0.62**6.88±1.09**6.71±0.64** |
与阳虚模型组比较*p＜0.05 **P＜0.01
小结
本研究结果表明：淡豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)及仙豆豉提取物(2g生药/kg、18g生药/kg)能明显提高去卵巢大鼠股骨、胫骨骨密度，增加胫骨骨灰重，提高股骨抗弯强度，光镜下可见骨组织形态亦较去卵巢模型组大鼠改善；可减缓大鼠去卵巢所致的增重效应；能减轻去卵巢大鼠子宫及肾上腺萎缩；对血钙含量、碱性磷酸酶无明显影响，但可回升血磷含量；可明显升高去卵巢大鼠血清雌二醇、降钙素含量，降低血清骨钙素含量；可明显改善维甲酸致骨质疏松大鼠的一般状况，减缓体重的减轻和性腺器官的萎缩，降低血清碱性磷酸酶活性，增加骨质疏松大鼠骨小梁面积密度、骨小梁宽度和骨小梁数目，增加骨密度、骨灰重及骨钙含量；可明显提高氢化可的松阳虚小鼠抗疲劳能力，研究结果为临床用药提供了必要的理论依据。
参考文献：
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3.陈奇主编，中药药理实验方法学，人民卫生出版社，1996.
4.徐叔云等主编，药理实验方法学，第二版，人民卫生出版社1991。
Claims (10)
1.一种治疗骨质疏松症的新的中药材，其特征在于是由下述重量配比的原料制成：黑大豆1000份、淫羊藿140～200份。
2.如权利要求1所述的该种新药材，其中各原料的重量配比是：黑大豆1000份、淫羊藿150-190份。
3.如权利要求1所述的该种新药材，其中各原料的重量配比是：黑大豆1000份、淫羊藿165～175份。
4.如权利要求1所述的该种新药材，其中各原料的重量配比是：黑大豆1000份、淫羊藿170份。
5.一种制备权利要求1-4所述的中药新药材的方法，其包括如下步骤：
(1)按权利要求1-4所述重量配比取原料；
(2)淫羊藿的煎煮提取
将淫羊藿切碎，加5～10倍量的水，煎煮提取1-3次，每次60分钟，首次提取前在加水后先浸泡2小时，然后加热煎煮提取；合并提取液，浓缩至适当体积，得药汁，备用；药渣摊凉、晾干，留用；
(3)浸泡黑大豆
洗拣黑大豆，加入步骤(2)制取的药汁，浸泡适当的时间，待药汁基本吸收，豆粒充分饱胀；
(4)蒸煮黑大豆
将步骤(3)所得黑大豆置蒸锅内，隔水蒸煮至熟透；
(5)发酵黑大豆
将步骤(4)所得黑大豆置洁净房间内，摊凉，晾干水气，置适当容器，衬垫一层药渣，在药渣上疏松放置蒸熟的黑大豆，上面覆盖一层药渣，进行自然发酵，定时翻动，使发酵均匀，待豆粒上长满菌丝，至黄衣上遍时终止发酵，将发酵后的材料取出，筛选，除去药渣，将豆粒摊开晒干或50℃干燥，即得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)的浸泡步骤中优选为室温为25℃、浸泡时间为8小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(5)所述发酵步骤中室温在25℃～30℃，相对湿度40％-70％左右，发酵容器的豆粒中心点温度不超过35℃。
8.淡豆豉在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用，其中原料包括：黑大豆1000份，青蒿70～100份，桑叶70～100份。
9.如权利要求1-4和8任一项在治疗骨质疏松症的应用，其中所述的药物含有该种中药新药材或淡豆豉，或和药学上可接受的药物组合。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述的药材及药物组合物可制成包括口服给药的剂型和非口服给药的剂型。
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|---|---|---|---|---|
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20071024 |