CN104547248A

CN104547248A - 一种治疗骨科疾病的药物及其制法与检测方法及其应用

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Publication number: CN104547248A
Application number: CN201510000143.7A
Authority: CN
Inventors: 袁福德
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-02
Filing date: 2015-01-02
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及一种治疗股骨头坏死的药物组合物。发明名称为一种治疗骨科疾病的药物及其制法与检测方法及其应用。该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：取苦茄、松蒿、软水黄连，混合，药材加5～15倍量水微波提取1～5次，每次15～60min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。该药物组合物可用于制备治疗股骨头坏死的药物。本发明还提供了药物组合物的检测方法。

Description

一种治疗骨科疾病的药物及其制法与检测方法及其应用

技术领域：

本发明属于中药领域，涉及一种由苦茄、松蒿、软水黄连组成的具有治疗股骨头坏死的药物组合物。

技术背景：

股骨头缺血坏死 (ONFH)是由不同病因导致股骨头血液供应破坏而引起软骨下骨变性、坏死，继而造成股骨头塌陷，最终导致髋关节退行性破坏性改变。该病多发生于35～55岁的青壮年，若不及时治疗，70%患者股骨头将塌陷，约3～4年后需行全髋关节置换。通常认为激素和酒精的摄入是股骨头缺血坏死最常见的两大病因，约占股骨头缺血坏死病例的40%。近年来，国内外学者对股骨头坏死的病因和发病机制进行了深入研究，并且提出了众多学说，主要有：脂类代谢紊乱学说、血管内凝血学说、骨内压增高学说、二次碰撞学说等。最近研究发现，股骨头缺血坏死患者中，骨髓间充质干细胞的活性和数量受到抑制，从而提示股骨头缺血坏死可能是一种骨细胞和间充质干细胞性疾病，但其确切病理生理学机制现仍不完全明了。

目前，激素性股骨头坏死的发病机制依然是研究的热点、难点。当前对于激素性股骨头坏死领域的研究逐渐呈现以下两个趋势：一是随着分子生物学、干细胞研究、细胞凋亡研究的不断发展，我们能够从更微观的水平探寻激素性股骨头坏死的本质，为各种假说提供分子水平的证据，甚至找出各假说之间的内在联系；二是个体间对激素的敏感性差异越来越受到重视，越来越多的多态性基因被发现与激素性股骨头坏死的发病呈相关性。其意义不仅在于揭示其发病机理，更在于对潜在的高危人群进行筛选，提前采取预防措施，最大限度的保证激素作为药物在人群中的治疗作用，同时又可避免激素对激素性股骨头坏死高危人群的危害。

发明内容：

本发明的目的是提供一种治疗股骨头坏死的药物组合物。

本发明的另一目的是提供药物组合物的制备方法。

本发明的还提供该药物组合物在制备治疗股骨头坏死以及骨质增生、骨关节炎药物中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种治疗股骨头坏死的药物组合物，是由以下重量份的原料制成的：苦茄1～3，松蒿1～3，软水黄连1～3。

所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：苦茄1，松蒿2，软水黄连3。

所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：苦茄2，松蒿3，软水黄连2。

所述药物组合物优选是由以下重量份的原料制成的：苦茄1，松蒿1，软水黄连1。

所述药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。

所述药物组合物制备成的口服制剂为片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。

所述药物组合物采用如下方法制备：取干燥的苦茄、松蒿、软水黄连，混合，药材加5～15倍量水微波提取1～5次，每次15～60min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。

所述药物组合物优选采用如下方法制备：取干燥的苦茄、松蒿、软水黄连，混合，药材加10倍量水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。

所述药物组合物的检测方法为：

（1）色谱条件：色谱柱：C18柱，流动相：甲醇-1％冰乙酸比例为10:90，流速：1.0mL/min，检测波长：280nm。理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500。

（2）溶液制备：

①供试品溶液：取本发明药物10g，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，超声处理（200W，40kHz）30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

②对照品溶液：精密称取山奈酚对照品5.95mg，置50mL容量瓶中，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀；然后再从中精密量取5mL，置10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为53.55μg/mL的山奈酚对照品溶液；

③测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5μL，注入HPLC仪，进行检测。

所述药物组合物可用于制备治疗激素性股骨头坏死的药物。

所述药物组合物可用于制备治疗骨质增生的药物。

所述药物组合物可用于制备治疗骨关节炎的药物。

通过如下实验研究验证本发明的技术效果：

实验例一：本发明药物组合物治疗激素性股骨头坏死的实验研究

本实验通过观测兔血清中的骨钙素(BGP)和降钙素(CT)的水平及股骨头病理表现，探讨本发明药物组合物治疗激素性股骨头坏死（SONFH）的疗效。

1实验材料与方法

1.1实验动物

6月龄新西兰白兔60只，雌雄各半，体重(2.0～2.5)kg，由烟台大学动物实验中心提供。

1.2实验药品及试剂

本发明药物组合物：取干燥的苦茄333g、松蒿333g、软水黄连333g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得。

对比药物A：取干燥的苦茄500g，松蒿500g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得。

对比药物B：取干燥的松蒿500g、软水黄连500g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得。

对比药物C：取干燥的软水黄连500g 、苦茄500g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得。

醋酸泼尼松龙注射液，浙江仙琚制药有限公司生产，国药准字：H33020824。

仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限公司生产，国药准字：Z20025337。兔BGP及CT(ELISA)试剂盒：购自苏州卡尔文生物科技有限公司。

1.3实验方法

60只新西兰白兔随机分成空白组(n=10)和造模组(n=50)。采用贺氏造模法（贺西京，毛履真，王坤正，等.肾上腺皮质激素引起股骨头缺血坏死的机制实验研究［J］.中华骨科杂志，1992，12(6)：440～443），造模组肌注醋酸泼尼松龙注射液7.5mg/kg，每周2次，共6周；空白组肌注生理盐水0.32mg/kg，每周2次，共6周，同时全部动物每周注射青霉素钠2次以预防感染，每次5万U/只。在第7周分别随机处死两组动物各2只，每只动物分别取两侧股骨头纵切面做He染色切片以观察造模情况。在第9周将造模组动物随机分为6组：本发明药物组合物组(n=8)、仙灵骨葆组(n=8)、对比药物A组(n=8)、对比药物B组(n=8)、对比药物C组(n=8)及阳性对照组(n=8)，空白组：剩余的动物为空白对照组(n=10)。自第9周起本发明药物组合物组每天用本发明药物组合物(45g·kg^-1·d^-1)分两次灌胃，对比药物A组每天用对比药物A(45g·kg^-1·d^-1)分两次灌胃，对比药物B组每天用对比药物B(45g·kg^-1·d^-1)分两次灌胃，对比药物C组每天用对比药物C(45g·kg^-1·d^-1)分两次灌胃，仙灵骨葆组用仙灵骨葆胶囊(0.1g·kg^-1·d^-1)制成混悬液分两次灌胃，阳性对照组和空白组都用生理盐水灌胃，每次15ml/只，每天2次，共治疗4周。分别在造模前、造模后及治疗后抽取每只兔的耳中央动脉血，测定血清中BGP和CT的水平。

1.4检测项目

(1)肉眼观察：实验兔的一般情况如：精神、体重、体毛、进食及股骨头形态。

(2)组织形态学观察：于第8周处死空白组和造模组各2只动物，每只动物取出双侧股骨头沿冠状面正中锯开，10%的中性福尔马林缓冲液固定48小时，5%的硝酸液脱钙，流水冲洗后石蜡包埋切片，He染色，5×40倍光镜下观察切片中骨小梁和骨细胞的形态结构，以了解造模情况。治疗结束后处死全部动物，按上述方法制成股骨头病理切片，每张切片在10×40倍视野下在负重区随机选取5个视野，计算骨陷窝总数和空虚骨陷窝数，取平均空骨陷窝率作为股骨头病理改变程度的指标以观察本发明药物组合物的治疗效果。

(3)血清中BGP和CT的测定：造模前、造模后及治疗后每只动物均采取耳中央动脉血4ml，将血液标本在常温下静置3小时后离心，3000r/分钟，10分钟，吸取上层血清，在-40℃下保存。应用酶联免疫法(ELISA)测定标本中的BGP和CT的水平，操作程序按试剂盒说明书进行。

1.5统计学处理方法

实验数据结果均以均数加减标准差(±s)表示，采用英文SPSS软件进行单因素方差分析，多组间两两比较选用LSD法和成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2实验结果

2.1动物一般情况及股骨头形态

造模2周后，造模组动物出现不同程度的精神差，体毛稀疏，光泽黯淡，食欲减少，体重减轻，皮下脂肪减少，6周后最为明显，空白组动物一般情况无明显变化。经4周治疗后造模动物上述一般情况较治疗前部分改善，但仍差于空白组。造模组和空白组动物的股骨头外观形态无明显差异，但造模组较空白组股骨头颈部骨皮质脆，股骨头骨质疏松，易凿取。

2.2股骨头切片观察结果

(1)造模结果：

空白组：骨小梁整齐清晰，排列规则，致密饱满。骨小梁和骨皮质中骨细胞清晰可见，核较大，居中，偶见骨细胞空虚，软骨下血管丰富，骨小梁周围成骨细胞较多。

造模组：软骨下骨小梁萎缩，较多的细胞核固缩，核偏位，染色深，骨髓内大量脂肪细胞堆积。骨小梁内正常骨细胞数量减少，部分骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数明显增多，提示股骨头发生病理性坏死。

(2)治疗结果：治疗4周后全部动物处死，取股骨头制成He切片。光镜下：

空白组：呈正常组织形态学表现；阳性对照组：呈股骨头坏死表现，坏死程度较造模结束时无明显改变，平均空骨陷窝率达29.3±2.60%，明显高于空白组(P＜0.05)；本发明药物组合物组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组和仙灵骨葆组：部分骨细胞核边聚，较大部分骨细胞正常，软骨下萎缩骨小梁和正常骨小梁并存，萎缩的仍占较大部分，部分骨小梁得到恢复，骨髓内有部分脂肪细胞堆积。视野下空骨陷窝仍然明显，但较阳性对照组明显减少，两组空骨陷窝率均低于空白组(P＜0.05)，本发明药物组合物组和仙灵骨葆组对比空骨陷窝率无明显差异(P＞0.05)。对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组和仙灵骨葆组对比空骨陷窝率明显差异(P＜0.05)。说明，本发明药物组合物组的效果优于对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组。见表1。

表1治疗4周后各组的空骨陷窝率(%， ±s)

组别	空骨陷窝率
		本发明药物组合物组	20.22±1.18^(1)(2)(3)
对比药物A组	24.46±1.67^(1)(2)(4)
		对比药物B组	24.55±1.34^(1)(2)(4)
对比药物C组	24.32±1.13^(1)(2)(4)
		仙灵骨葆组	19.31±1.02⁽¹⁾⁽²⁾
阳性对照组	29.44±2.53⁽¹⁾
		空白组	11.65±1.86

注：与空白组对比，⁽¹⁾P＜0.05；与阳性对照组对比，⁽²⁾P＜0.05；与仙灵骨葆组对比，⁽³⁾P＞0.05；与仙灵骨葆组对比，⁽⁴⁾P＜0.05；

造模后造模组(即非空白组)BGP水平较空白组明显降低，有显著差异(P＜0.05)。治疗后仙灵骨葆组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组和本发明药物组合物组BGP水平较阳性对照组明显升高，有显著差异(P＜0.05)，但对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组较空白组有一定差距，差异有统计学意义(P＜0.05)，而仙灵骨葆组和本发明药物组合物组与空白组相当，无明显差异(P＞0.05)；说明，本发明药物组合物组的效果优于对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组。治疗后本发明药物组合物组与仙灵骨葆组对比BGP水平无明显差异，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2血清中BGP测定结果(ng/mL，±s)

组别	动物	造模前	造模后	治疗后
					空白组	8	11.35±1.34	11.33±1.42	11.51±0.92
阳性对照组	8	11.48±1.07	7.66±1.35⁽³⁾	7.14±0.73
					仙灵骨葆组	8	12.19±1.10	7.49±1.48⁽³⁾	11.27±1.36⁽¹⁾⁽⁴⁾
本发明药物组合物组	8	11.82±1.61	7.32±1.03⁽³⁾	11.94±0.95^(1)(2)(4)
					对比药物A组	8	12.33±1.44	7.45±1.46⁽³⁾	9.27±1.28⁽¹⁾⁽³⁾
对比药物B组	8	11.67±1.28	7.46±1.39⁽³⁾	8.90±0.89⁽¹⁾⁽³⁾
					对比药物C组	8	12.66±1.35	7.54±1.53⁽³⁾	9.42±1.21⁽¹⁾⁽³⁾

注：与阳性对照组对比，⁽¹⁾P＜0.05；与仙灵骨葆组对比，⁽²⁾P＞0.05；与空白组对比，⁽³⁾P＜0.05；与空白组对比，⁽⁴⁾P＞0.05；

造模后造模组CT水平较空白组明显升高，有显著差异(P＜0.05)。治疗后仙灵骨葆组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组和本发明药物组合物组CT水平较阳性对照组明显降低，有显著差异(P＜0.05)，但对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组较空白组有一定差距，差异有统计学意义(P＜0.05)，而仙灵骨葆组和本发明药物组合物组与空白组相当，无明显差异(P＞0.05)；说明，本发明药物组合物组的效果优于对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组。治疗后本发明药物组合物组CT水平与仙灵骨葆组相当，无明显差异(P＞0.05)。见表3。

表3血清中CT测定结果(ng/mL，±s)

组别	动物	造模前	造模后	治疗后
					空白组	8	20.03±2.35	20.48±1.57	20.26±1.75
阳性对照组	8	20.37±1.86	24.09±1.90⁽⁴⁾	24.23±1.44
					仙灵骨葆组	8	20.28±2.09	24.38±1.79⁽⁴⁾	20.72±1.81⁽¹⁾⁽³⁾
本发明药物组合物组	8	20.09±1.70	23.97±1.66⁽⁴⁾	20.63±2.62^(1)(2)(3)
					对比药物A组	8	21.08±1.67	23.44±1.65⁽⁴⁾	22.84±1.45⁽¹⁾⁽⁴⁾
对比药物B组	8	20.25±2.26	24.63±1.12⁽⁴⁾	22.77±1.56⁽¹⁾⁽⁴⁾
					对比药物C组	8	20.04±1.43	23.92±1.51⁽⁴⁾	22.48±2.79⁽¹⁾⁽⁴⁾

注：与阳性对照组对比，⁽¹⁾P＜0.05；与仙灵骨葆组对比，⁽²⁾P＞0.05；与空白组对比，⁽³⁾P＞0.05；空白组对比，⁽⁴⁾P＜0.05。

3结论

实验中可见，治疗4周后与阳性对照组比较，本发明药物组合物组股骨头病理观察见部分骨细胞核边聚，较大部分骨细胞正常，软骨下萎缩骨小梁和正常骨小梁并存，萎缩的仍占较大部分，部分骨小梁得到恢复，骨髓内有部分脂肪细胞堆积。且本发明药物组合物组的空骨陷窝率(20.22±1.18%)低于阳性对照组(29.44±2.53%)，病理改变得到部分逆转。而在与仙灵骨葆组对比中，两者对于兔血清BGP、CT的影响相当(P＞0.05)。有临床报道，单纯采用仙灵骨葆胶囊治疗股骨头坏死可稳定病情，对临床症状的改善有较好的疗效。实验结果表明本发明药物组合物对兔实验性SONFH有治疗作用，并且治疗效果优于对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组，说明本发明药物组合物中几味药物的组合配比后，产生了协同增效的作用，三味药物缺一不可。

综上所述，本实验通过观察BGP、CT在兔实验性SONFH中的变化初步探讨本发明药物组合物对SONFH的治疗作用，本发明药物组合物对于兔实验性SONFH有积极的治疗作用，其机制可能在提高成骨细胞的活性的同时抑制破骨细胞的活性，从而部分逆转兔SONFH的病理变化。

实验二：本发明药物治疗兔骨关节炎的实验研究

1材料与方法

1.1建立动物模型

健康成年雄性新西兰大白兔36只，体重2.5kg左右。以3%戊巴比妥钠30mg·kg^-1静脉麻醉，参照Hulth的方法于无菌条件下切断其左膝前、后交叉韧带及内侧半月板。术后不固定伤肢，分笼饲养。

1.2动物分组

造模后将动物随机分为用药组、非用药对照组，各18只。根据Meeh-Rubner公式A(体表面积m²)=K(系数)·K(体重g^)2/3·10^-4计算得出用药组动物服用本发明药物的剂量约为1粒/日，于术后13周起口服。分别于术后16、20和24周取材。

1.3光镜标本制备

处死动物后，立即解剖左膝关节，每组随机取1只兔子，以锐利刀片切取1mm×1mm股骨内髁全软骨层标本，供透射电镜观察，并取其胫骨内侧平台作扫描电镜观察。所余之股骨内髁及余兔之股骨内髁、胫骨内侧平台连同软骨下骨一并切下，置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定48小时，10%甲酸甲醛脱钙液脱钙10～15天。按常规石蜡包埋，5μm纵向切片，HE、甲苯胺蓝染色。

1.4不脱钙透射电镜标本制备

标本置于4℃2%戊二醛中固定2小时，PBS缓冲液漂洗，1%锇酸后固定2小时，乙醇逐级脱水后用环氧树脂618包埋，LKB超薄切片机切片，铅、铀染色。HitachiH-500透射电镜观察。

1.5扫描电镜标本制备

标本置于4℃2%戊二醛中固定24小时，1%四氧化锇后固定2小时，乙醇逐级脱水后临界点干燥，定向粘附于载物台上，真空喷金后用Jeol JSM-840扫描电镜观察。

1.6增殖软骨细胞的免疫组织化学显色

采用链霉菌-生物素-过氧化酶法观察软骨细胞的增殖状况。每个石蜡标本制成5μm厚连续切片2张，1张做免疫组化研究，1张作为不加一抗的阴性对照片。切片脱蜡至水，3%过氧化氢室温下孵育5分钟。5%正常山羊血清处理切片10分钟，依次加入抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司)，37℃湿盒孵育30分钟；二抗(生物素标记IgG)及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液。DAB显色，甲基绿复染。

1.7凋亡软骨细胞的末端原位标记

采用末端原位标记(TUNEL)法观察软骨细胞凋亡状况(Oncor公司试剂盒)。石蜡标本制成5μm厚连续切片2张，1张进行末端原位标记，1张为不加核酸末端转移酶的阴性对照。切片脱蜡至水。0.1%胰蛋白酶室温下消化30分钟。3%过氧化氢室温下孵育5分钟。地高辛标记的核酸末端转移酶(TdT)37℃湿盒孵育60分钟，抗地高辛抗体室温下孵育30分钟，DAB显色，甲基绿复染。

1.8统计分析

显微镜下计数阳性细胞所占比例，随机检验10～20个视野，至少计数2500个软骨细胞。采用Studentt检验进行统计分析。

2结果

2.1肉眼观察

对照组16周时，软骨负重区出现凹槽样变，表面呈颗粒状突起，色泽暗黄混浊；20周有骨赘形成；24周，软骨非负重区凹凸不平，局部软骨缺损。用药组大体形态变化与同期对照组相似。

2.2光镜下形态变化

16周时，对照组软骨出现裂隙，深达放射层；用药组可见大量增生呈巢状的软骨细胞。20～24周，对照组软骨裂隙增多加深，软骨细胞柱状排列消失；用药组与之相比无显著差异。

2.3超微结构变化

16周时，对照组软骨细胞核固缩，胞质中可见脂滴，软骨基质中出现致密胶原纤维束；用药组软骨细胞内质网大量增生，富含糖原颗粒，呈分泌旺盛状态。20～24周，对照组部分软骨细胞坏死崩解，染色质浓集，内质网减少。线粒体肿胀，软骨基质中胶原纤维粗细不等，横带周期消失；用药组与之类似。

2.4软骨表面变化

16周时，对照组软骨表面出现裂隙，胶原纤维暴露；用药组软骨表面完整。20～24周，对照组局部软骨缺损，大量胶原纤维裸露；用药组与之相似。

2.5免疫组化

PCNA阳性细胞主要分布于软骨表层。阳性细胞比例见表4。

表4 PCNA阳性细胞指数(±s)

时间(周)	用药组(n=6)	对照组(n=6)
			16	18.8±4.3**	6.2±1.1
20	12.7±1.4	12.3±1.2
			24	10.6±3.5*	16.4±4.5

注:PCNA阳性细胞指数=阳性细胞数/计数细胞总数×100

用药组与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

对照组20周阳性细胞指数高于16周，相比有显著差异(t=7.106，P<0.01)，而与24周无差异(t=1.649，P>0.05)。用药组术后20周阳性细胞指数低于16周，相比有差异(t=3.157，P<0.05)，而与24周相比无差异(t=0.896，P>0.05)。术后16周，用药组阳性细胞指数明显高于对照组(t=6.006， P<0.01)；而术后24周，用药组阳性细胞指数则低于对照组(t=2.291，P<0.05)。

2.6末端原位标记

凋亡的软骨细胞主要位于软骨浅层，其比例见表5。

表5 凋亡细胞指数(±s)

时间(周)	16	20	24
				用药组(n=6)	21.7±1.6	34.5±5.4	10.3±1.2*
对照组(n=6)	17.6±4.5	25.4±8.3	57.2±13.1

注:凋亡细胞指数=凋亡细胞数/计数细胞总数×100

用药组与对照组比较*P<0.01

对照组24周凋亡细胞指数明显高于20周，相比有显著差异(t=4.885，P<0.01)。用药组24周凋亡细胞指数明显低于16周相比有显著差异(t=11.38，P<0.01)。用药组16、20周凋亡细胞指数与同期对照组比无显著差异(t=2.135 P>0.05；t=2.158，P>0.05)。而24周凋亡细胞指数则明显低于对照组(t=10.86 P<0.01)。

3讨论与结论

正常完整的关节软骨使关节得以低摩擦、低损耗的状态进行活动，并赋予其抵抗压力、张力、剪切力的能力。OA（骨关节炎）患者的关节软骨因各种原因发生退变或损坏后，改变了应力由关节面向骨组织的传导，使关节软骨和软骨下骨发生一系列继发性病变，最终使关节失去正常功能。

本发明药物对骨关节炎显现出较好的临床疗效。为进一步探讨其疗效发生的机理，本研究参照Hulth的方法建立了兔OA模型。结果显示对照组在术后16～24周中呈现出纤维裂隙增多、加深，大量软骨细胞变性、坏死，局部软骨缺损等典型的晚期OA表现。用药组早期(16周)表现为软骨细胞增生，后期(20～24周)与对照组无显著差异，提示本发明药物对晚期OA效果有限。这可能由于：(1)软骨细胞的退变过程呈不可逆性，本发明药物对变性的软骨细胞无效。(2)残存的功能正常的软骨细胞数量过少，即使本发明药物直接或间接地作用于这些细胞促进其修复活动，也无法恢复软骨降解与合成的平衡关系。

实验三：本发明药物治疗激素性股骨头坏死的临床观察

2013年4月21日至2013年10月12日，结合临床经验及现代医学对激素性股骨头坏死的发病机理的研究，以本发明药物应用于临床股骨头缺血性坏死的治疗，疗效较好，现将结果报道如下。

1资料与方法

1.1诊断标准

参考国家中医药管理局发布的《中医病证诊断疗效标准》。采用FiCat分期方法。

1.2一般资料

共观察治疗45例，均为骨科门诊患者。采用随机平行组对照设计，将45例按随机法分为治疗组和对照组，其中治疗组24例中，男18例，女8例；对照组21例中，男15例，女6例。采用双盲法进行临床疗效观察。两组患者性别，年龄患侧、患髋分期比较，均无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

1.3治疗方法

1.3.1对照组

仙灵骨葆胶囊(由贵州同济堂制药有限公司生产)，口服，每次1粒，每天2次。

1.3.2治疗组

本发明药物:取干燥的苦茄333g、松蒿333g、软水黄连333g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。口服，每次2粒，每天2次。

两组患者均连续给药三月为一疗程，停药后一周内复查，分别于治疗前、治疗后对患者临床症状及实验室检查指标进行评定。

1.4观察指标

治疗前后相关症状、体征观察记录。血液流变学指标及血脂指标，治疗前后各检查1次。治疗前后各检查X光片1次。

1.5疗效标准

采用1993年北戴河全国股骨头缺血性坏死专题讨论会上修改的髋关节功能评定标准，根据四项总分(疼痛、生活能力、关节活动度及行走距离)+X线标准得分，全面分析髋关节的功能。髋关节功能四项六级评分标准，采用100分制，每项分为6级，I级最差，VI级最好。疗效总评定:优≥80分；良≥60分；可≥40分；差<40分。

1.6统计学方法

采用SPSS13.0软件包进行数据统计处理。各数值以±s表示，所有资料均进行统计学处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ²检验，等级资料用Ridit分析。

2结果

2.1两组临床疗效比较(见表6)

表6两组临床疗效比较(例)

组别	例数	优	良	可	差	优良率（%）	总有效率（%）
								治疗组	24	9	12	2	1	87.50*	95.83*
对照组	21	1	8	6	6	42.86	71.43

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2两组治疗前后血液流变学变化比较(见表7)

表7两组治疗前后血液流变学指标变化比较(±s)

注：与对照组治疗后比较，*P<0.05

2.3两组治疗前后血脂变化比较(见表8)

表8 两组患者治疗前后血脂变化比较(mmol/L，±s)

注：与对照组治疗后比较，*P<0.05

3结论

临床观察表明本发明药物能降低血液的粘稠度，减少血管内凝血，改善血液微循环，从而减轻和改善骨组织的缺血状况；抑制毛细血管通透性；还能纠正脂质代谢紊乱，防止脂质在髓腔内堆积，降低骨内压，从而中断骨内压增高、微循环障碍致缺血性坏死的恶性循环。

实验四：本发明药物组合物制备工艺优选研究

采用L₉(3⁴)正交设计安排实验，以该方主要功效成分山奈酚的含量为考察指标，对其提取工艺进行研究，以期优选出可行的提取方法。

1仪器与试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪、SPD-10Avp紫外检测器（日本岛津公司）；AE200电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。山奈酚对照品（中国食品药品检定研究院）。

甲醇（色谱纯，美国TediA公司）；乙酸乙酯（天津市博迪化工有限公司）；乙醇（天津市永大化学试剂有限公司）；三氯甲烷（深圳市华昌化工有限公司）；甲酸（湖南省衡阳市有机化学试剂厂）；硬脂酸镁（湖南华日制药有限公司）；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。硅胶G板（青岛海洋硅胶干燥剂有限公司）。

2方法

2.1提取方法

设计了以下3种提取方法。

2.1.1水煎醇沉法：按处方配比苦茄33g、松蒿33g、软水黄连33g，共99g，将苦茄、松蒿、软水黄连粉碎成粗粉(20～40目)，混合加水煎煮，具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、浓缩，加2倍体积95%乙醇沉淀过夜，减压回收乙醇，浓缩定容至100mL备用。

2.1.2微波辅助水煎醇沉法：除加热工具为家用微波炉40%火力外，其他具体方法同上。

2.1.360%乙醇回流法：按处方配比取苦茄33g、松蒿33g、软水黄连33g，共99g，将苦茄、松蒿、软水黄连粉碎成粗粉(20～40目)，混合加60%乙醇水浴加热回流，具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、过滤、减压回收乙醇，浓缩定容至100mL备用。

2.2　山奈酚的含量测定

2.2.1　色谱条件：色谱柱：C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-1％冰乙酸（10:90），流速：1.0mL/min，检测波长：280nm。理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500。

2.2.2　溶液制备

（1）供试品溶液：取本品10g，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，超声处理（200W，40kHz）30min。放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（2）对照品溶液：精密称取山奈酚对照品5.95mg，置50mL容量瓶中，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀；然后再从中精密量取5mL，置10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为53.55μg/mL的山奈酚对照品溶液；

（3）阴性溶液：取除丹参外的其余处方量药材，按制备工艺制成缺丹参的阴性样品，同法制成缺丹参的阴性样品溶液。

分别精密量取上述供试品、对照品、阴性样品溶液各5μL，注入HPLC仪，按2.2.1项进行检测，结果如图1所示。在该色谱条件下，山奈酚的保留时间为15.5min，阴性样品溶液在该保留时间处不出峰，表明本发明药物药物中的其他成分对山奈酚的测定无干扰。

2.2.3　标准曲线的绘制：分别精密吸取浓度为0.1071mg/mL的山奈酚对照品溶液1、3、5、7、9mL，分别置10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取5μL进样，测定其峰面积（A），以浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，得山奈酚回归方程为：A＝510502.4C－696.3（r＝0.9999）。结果表明，在10.71～96.39μg/mL范围内，山奈酚浓度与峰面积线性关系良好。

2.3正交试验设计

在对溶媒和提取方法初步选择后，提取方法(A)、溶剂用量(B)、提取次数(C)作为考察的3个因素，每个因素各取3个水平，采用L₉(3⁴)正交表进行试验(见表9)，以提取山奈酚的得率为考察指标。提取时间因提取方法不同有所差异。水煎煮：90min/次；微波水提：30min/次；乙醇回流提取：90min/次。

表9 正交试验因素水平表

水平	提取方法A	溶剂用量(倍量)B	提取次数(次)C
				1	水煎煮	8	1
2	微波水提	10	2
				3	乙醇回流提取	12	3

3正交试验结果

3.1结果分析(见表10)

表10 正交试验结果分析表

表10极差结果说明，各因素对提取效果的影响程度依次为A＞C＞B。其中影响最大的是提取方法A，其次为提取次数C，溶剂用量B影响很小。因此，各因素的最佳水平组合为A2C3B2。对数据进行方差分析，结果见表11。可知提取方法与提取次数对指标有显著影响，而溶剂用量对指标无显著影响，与直观分析结果一致，最佳提取方案为：A2C3B2，即微波提取3次，水用量为10倍量。

表11 方差分析表

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	P
						提取方法	0.901	2	56.313	19	＜0.05
溶剂用量	0.021	2	1.313	19
						提取次数	0.410	2	25.625	19	＜0.05
误差	0.020	2

3.2验证试验

在以上试验基础上，放大投药量50倍，即5000g，按照相同方法重复试验3次，与上述结果相平行，说明优选结果可信。

4结论

根据试验结果，最佳提取工艺方案为A2C3B2，即微波提取3次，加水量为10倍，每次30min。微波提取山奈酚得率明显高于其他两种方法，因微波提取是从物料内部加热，有效成分不易被破坏，提取充分，得率高，且与普通生产提取时间一般为90min相比，大大缩短了提取时间，节约了能源。

实验四：本发明药物组合物质量标准研究

1　仪器和试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪、SPD-10Avp紫外检测器（日本岛津公司）；AE200电子分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）。本发明药物药物，自制；山奈酚对照品（中国食品药品检定研究院）。

2　方法和结果

2.1　本发明药物药物的制备：按如下处方和制备工艺制备本发明药物药物。

2.1.1　处方：苦茄333g，松蒿333g，软水黄连333g。

2.1.2　制备工艺：取干燥的苦茄333g、松蒿333g、软水黄连333g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得。

2.3　山奈酚的含量测定

2.3.1　色谱条件：色谱柱：C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-1％冰乙酸（10:90），流速：1.0mL/min，检测波长：280nm。理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500。

2.3.2　溶液制备

分别精密量取上述供试品、对照品、阴性样品溶液各5μL，注入HPLC仪，按2.3.1项进行检测，结果如图1所示。在该色谱条件下，山奈酚的保留时间为15.5min，阴性样品溶液在该保留时间处不出峰，表明本发明药物药物中的其他成分对山奈酚的测定无干扰。

2.3.3　标准曲线的绘制：分别精密吸取浓度为0.1071mg/mL的山奈酚对照品溶液1、3、5、7、9mL，分别置10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取5μL进样，测定其峰面积（A），以浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，得山奈酚回归方程为：A＝510502.4C－696.3（r＝0.9999）。结果表明，在10.71～96.39μg/mL范围内，山奈酚浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.4　精密度和稳定性实验：精密吸取同一供试品溶液5μL，重复进样5次，测定其峰面积，结果其平均峰面积为149265.406，RSD为0.53％（n＝5），表明本发明药物精密度良好。分别精密吸取供试品溶液5μL，于0、2、4、8、10h进样，测定其峰面积，结果其平均峰面积为149383.512，RSD为0.62％（n＝5）。表明供试品溶液在8h内基本稳定。

2.3.5　重复性实验：取同一批样品5份，按上述条件平行处理并测定，结果其平均含量为0.5391mg/片，RSD为0.94％（n＝5），表明本发明药物重复性良好。

2.3.6回收率实验：精密称取已知山奈酚含量为1.7935mg/g的供试品约0.4g，精密加入山奈酚对照品溶液（0.0868mg/mL）10mL，即0.868mg，再精密加入甲醇15mL，按上述含量测定项下的方法测定含量，测得其平均回收率为98.72％，RSD为0.82％（n＝3），表明本方法加样回收率良好。

2.3.7　样品含量测定：按拟定的含量测定方法，测定10批样品中的山奈酚的含量，结果见表12。10批样品中山奈酚含量的平均值为0.545mg/片，RSD为2.05％。按平均含量的75％折算，确定本品的含量限度为每克本发明药物中山奈酚含量不得＜0.40mg。

表12　10批样品每克本发明药物中山奈酚含量测定结果

批号	含量（mg）	批号	含量（mg）
				20130923	0.537	20131026	0.544
20130925	0.541	20131027	0.556
				20130927	0.544	20140202	0.547
20130929	0.532	20140204	0.543
				20131020	0.563	20140209	0.532

3结论

采用HPLC法对本发明药物药物中的山奈酚含量进行测定，其他成分对测定结果无干扰，方法学考察结果表明线性关系良好，精密度、回收率及重复性均较好，可用于本品的质量控制，规定其限度为每克本发明药物中山奈酚含量不少于0.40mg。

附图说明：

图1：本发明药物HPLC谱图；A：山奈酚对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性样品溶液；1：山奈酚

具体实施方式：

实施例1：

处方：苦茄600g，松蒿200g，软水黄连200g。

制法：取干燥的苦茄600g、松蒿200g、软水黄连200g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，装入胶囊，制成硬胶囊剂1000粒。

检测方法：

（1）色谱条件：色谱柱：C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇－1％冰乙酸（10:90），流速：1.0mL/min，检测波长：280nm。理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500。

（2）溶液制备：

④结果：每克本发明药物中山奈酚含量为0.534mg。

实施例2：

处方：苦茄166g，松蒿332g，软水黄连498g。

制法：取干燥的苦茄166g、松蒿332g、软水黄连498g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，压制成片，包衣，制成1000片。

检测方法：

（1）色谱条件：色谱柱：C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-1％冰乙酸（10:90），流速：1.0mL/min，检测波长：280nm。理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500。

（2）溶液制备：

④结果：每克本发明药物中山奈酚含量为0.515mg。

实施例3：

处方：苦茄286g，松蒿429g，软水黄连286g。

制法：取干燥的苦茄286g、松蒿429g、软水黄连286g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，干燥，制成5000丸。

检测方法：

（2）溶液制备：

④结果：每克本发明药物中山奈酚含量为0.551mg。

实施例4：

处方：苦茄333g，松蒿333g，软水黄连333g。

制法：取干燥的苦茄333g、松蒿333g、软水黄连333g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，制成颗粒剂10000g。

检测方法：

（2）溶液制备：

④结果：每克本发明药物中山奈酚含量为0.523mg。

在本发明中，所述的药物组合物中的苦茄为茄科茄属植物欧白英Solanum dulcamara L.的全草；松蒿为玄参科松蒿属植物松蒿Phtheirospermum japonicum(Thunb.)Kanitz [Geradia japonica Thunb.]的全草；软水黄连为毛茛科唐松草属植物多枝唐松草Thalictrum ramosum Boivin的全草。

实施例5：

处方：苦茄333g，松蒿333g，软水黄连333g。

制法：取干燥的苦茄333g、松蒿333g、软水黄连333g和鲍鱼壳粉末100g，混合，药材加10000mL水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料（淀粉），混匀，制成颗粒剂10000g。

检测方法：

（2）溶液制备：

④结果：每克本发明药物中山奈酚含量为0.523mg。

Claims

1.一种治疗股骨头坏死的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：苦茄1～3，松蒿1～3，软水黄连1～3。

2.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：苦茄1，松蒿2，软水黄连3。

3.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：苦茄2，松蒿3，软水黄连2。

4.如权利要求1药物组合物，其特征在于，该药物组合物是由以下重量份的原料制成的：苦茄1，松蒿1，软水黄连1。

5.如权利要求1～4中任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用药学中常规的制药方法制备成片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取苦茄、松蒿、软水黄连，混合，药材加5～15倍量水微波提取1～5次，每次15～60min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物采用如下方法制备：取苦茄、松蒿、软水黄连，混合，药材加10倍量水微波提取3次，每次30min，提取液合并，浓缩，干燥，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒剂，即得。

8.如权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物的检测方法为：

（1）色谱条件：色谱柱：C18柱，流动相：甲醇-1％冰乙酸比例为10:90，流速：1.0mL/min，检测波长：280nm，理论塔板数按山奈酚峰计算应不＜2500；

（2）溶液制备：

①供试品溶液：取本发明药物10g，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，200W，40kHz超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

9.如权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。

10.如权利要求1～4任意一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物在制备治疗骨质增生或骨关节炎药物中的应用。