CN109115544A - 一种使用脱钙法制作骨组织切片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用脱钙法制作骨组织切片的方法，包括如下步骤：S1：取骨组织置于由PBS配制的多聚甲醛中固定；S2：取出骨组织，冲洗后置于PBS‑EDTA脱钙液中，直至骨组织初步变软；S3：切割成组织块，并放入盛有无机酸脱钙液的容器中，再置于水浴锅中脱钙；S4：将脱钙的组织块冲洗去酸后进行梯度脱水，转入盛有氯仿‑无水乙醇混合液的容器内，最后再转入盛有氯仿溶液的容器内；S5：取出组织块进行浸蜡处理，包埋，切成蜡片后置于蒸馏水中，烘干，染色后封片。本发明提供的两步法脱钙，其中PBS‑EDTA脱钙液有很强的结合钙离子的能力，并在温度34‑38℃条件下脱钙，有效缩短预脱钙时间；采用两种酸混合脱钙，既可促进脱钙完全又能加快脱钙速度。
Description
技术领域
本发明属于显微组织切片领域，具体涉及一种使用脱钙法制作骨组织切片的方法。
背景技术
近年来，骨质疏松等骨骼疾病发病率越来越高，严重威胁人类的健康，而骨骼疾病也是畜牧养殖业中一个持续存在的问题，特别是骨代谢疾病导致的死亡和淘汰已造成巨大的经济损失，随着对骨骼疾病研究的越来越深入，骨组织切片是从组织和细胞的角度得出疾病的形态改变依据，做出相应诊断结果，而骨的组织学、病理学等形态学研究以及骨组织上特定基因、蛋白表达的定位、定性研究都离不开骨组织切片的制作，良好的骨组织切片的制作方法可以保证科研的科学性和客观性。骨组织是非常坚硬的，含有大量的无机钙盐是其最大的特点，因此，在制作骨组织切片的过程中，从取材到组织处理及其切片染色等方面的要求都非常高，其中任何一个环节处理不到位或者处理过度都会影响到组织切片的质量。尤其是前期的脱钙处理，如果骨组织脱钙过度又会严重影响组织细胞染色效果，或是组织抗原丢失；若脱钙不彻底，会直接影响骨切片的制作，进而影响对病变组织的病理诊断或科学实验能工作。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种两步脱钙法制作骨组织切片的方法。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现：
一种使用脱钙法制作骨组织切片的方法，包括如下步骤：
S1：固定：取骨组织，清除其他组织至表面光滑，置于由PBS配制的多聚甲醛中固定；
S2：预脱钙：将骨组织从多聚甲醛中取出，冲洗后置于PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为34~38℃的恒温箱中直至骨组织初步变软；
S3：脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，并放入盛有无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在温度40～60℃下脱钙18～24h，直至组织块完全变软；
S4：脱水与透明：将脱钙的组织块冲洗去酸后进行梯度脱水，在脱水完成后转入盛有氯仿-无水乙醇混合液的容器内8~12h，最后再转入盛有氯仿溶液的容器内24~48h，直至组织块下沉至容器底部即完成透明过程；
S5：包埋与切片：步骤S4完成后，取出组织块进行浸蜡处理，并对组织块进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于蒸馏水中展开，烘干直至蜡片与载玻片相贴合，最后染色后封片。
进一步地，步骤S2中，所采用的PBS-EDTA脱钙液与骨组织的体积比为20~30：1，其中所述PBS-EDTA的配置过程如下：将EDTA-Na2和磷酸盐缓冲液按质量体积比1~1.5：10置于磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液并搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.2-7.4，即可获得PBS-EDTA脱钙液。
进一步地，所采用的磷酸盐缓冲液的PH为7.2-7.4。
进一步地，步骤S3中，所述无机酸脱钙液的配制过程如下：将浓盐酸、甲酸和氯化钙按质量体积比4~6：3：4加入盛有蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即可得到无机酸脱钙液。
进一步地，步骤S3中，所述组织块的大小为3～5×3～5mm2。
进一步地，步骤S4中，所述梯度脱水的步骤为：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液、100%乙醇和叔丁醇混合液、100%乙醇和丙酮混合液、100%正丁醇溶液，每个梯度分别脱水1~2h。
进一步地，所述氯仿-无水乙醇混合液为氯仿和无水乙醇按质量体积比3~6：1进行混合而成。
进一步地，步骤S5中，所述浸蜡处理步骤为：先将组织块置于预浸液内3~6h，再置于已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡3~6h，其中预浸液为正丁醇和石蜡按体积比1：2的混合溶液，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按体积比6~8：1的混合溶液，其中所述高熔点的温度为58~60℃。
进一步地，所述蜡片的厚度为6~8μm。
有益效果：
1、两步法脱钙：①PBS-EDTA脱钙液预脱钙：EDTA-Na2是一种良好的脱钙螯合剂，有很强的结合钙离子的能力，对组织破坏小，不产生气泡，不影响染色，并在温度34-38℃条件下脱钙，缩短预脱钙时间；②无机酸脱钙液：为采用两种酸混合脱钙液完全脱钙，既可促进脱钙完全又能加快脱钙速度，同时能够防止纤维性组织过度膨胀，减少组织破坏及对染色的影响。通过上述组合的两步脱钙可以避免骨组织、组织抗原等结构被破坏，既增强脱钙效果又加速脱钙速度；
2、采用正丁醇与叔丁醇脱水：由于骨组织硬度较大，使用丙酮、无水乙醇等强脱水剂后，必须使用二甲苯等收缩性更强的透明剂，结果会导致骨组织的硬度加大，不利于制片，本发明采用正丁醇与叔丁醇试剂进行脱水，正丁醇与叔丁醇能够兼顾脱水与透明双重作用，能减少二甲苯的使用；
3、氯仿透明：本发明选择氯仿作为透明剂，结合脱水步骤中采用的叔丁醇的作用，使氯仿透明效果增强，减短透明时间；
4、混合蜡液包埋：采用石蜡和蜜蜡按质量体积比6~8：1的混合蜡液，配合58~60℃温度条件，使在包腊过程中有效克服骨组织质地坚硬的特性，其中添加的蜜蜡能增加石蜡的韧性。
附图说明
图1 为本实施例1在100倍显微镜下的骨组织形态图；
图2 为本实施例2在100倍显微镜下的骨组织形态图；
图3 为本实施例3在100倍显微镜下的骨组织形态图；
图4 为常规技术制作的在100倍显微镜下的骨组织形态图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，包括如下步骤：第一步，固定：取大鼠的骨组织，清除骨组织周围的肌肉组织与其他组织，直至骨组织的表面光滑，然后置于由PBS配制的4%多聚甲醛中进行固定；第二步，预脱钙：将骨组织从4%多聚甲醛中取出，流水冲洗后置于PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为34~38℃的恒温箱中脱钙2~3d，直至骨组织初步变软，完成预脱钙处理，其中所采用的PBS-EDTA脱钙液与骨组织的体积比为20~30：1；第三步，脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，所述组织块的大小为3～5×3～5mm2，保证切口平整光滑，并放入盛有无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在水温在55～60℃下脱钙18～24h，直至组织块完全变软，用针尖刺入骨干或用手动折弯骨干即可；第四步，去酸：取出组织块装入纱布袋，封住袋口后悬置于流水处冲洗6~8h；第五步，梯度脱水：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液、100%乙醇和叔丁醇混合液、100%乙醇和丙酮混合液、100%正丁醇溶液，每个梯度分别脱水1~2h；第六步，透明：组织块经梯度脱水后转入质量体积比为3~6：1的氯仿-无水乙醇混合液内8~12h，然后转入氯仿溶液内24~48h，直至组织块下沉至容器底部，此时表明透明过程完成；第七步，包埋：将透明完成的组织块从氯仿溶液中取出，先加入按体积比1：2混合的正丁醇-石蜡预浸液中3~6h，再放入已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡3~6h，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按体积比6~8：1的混合溶液，所述高熔点温度为58~60℃，将浸蜡完成后的组织块取出包埋，待蜡块成型，做好标记；第八步，切片：取冷却后成型良好的蜡块进行切片，切片厚度6~8μm，切出的组织块蜡片放入38~42℃的蒸馏水中展片，捞片后烘烤数小时，直至切片与载玻片完全相贴合，采用流水冲洗，以切片不脱落为宜；第九步，染色：将切片放入苏木精染液中，HE染色后，染色时间5min~20min，根据环境温度而定，用少量树胶封住切片，封好的切片置于干净的白纸上，待完成干燥封片后，显微镜下仔细观察。
第三步中，所述PBS-EDTA的配置过程如下为：将EDTA-Na2和磷酸盐缓冲液按质量体积比1~1.5：10置于加热磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液，同时搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.2-7.4，即可得PBS-EDTA溶液，其中所采用的磷酸盐缓冲液的PH为7.2-7.4；所述无机酸脱钙液的配制过程如下：将浓盐酸、甲酸和氯化钙按质量体积比4~6：3：4加入盛有蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即可得到无机酸脱钙液。
实施例1：
1、配置PBS-EDTA脱钙液和无机酸脱钙液：①PBS-EDTA脱钙液：将10g EDTA-Na2和PH为7.2的100ml磷酸盐缓冲液置于加热磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液，同时搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.2，即得到PBS-EDTA溶液；②无机酸脱钙液：将8ml浓盐酸、6ml甲酸和8g氯化钙加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即得到无机酸脱钙液。
2、切片步骤：第一步，固定：取大鼠的骨组织，清除骨组织周围的肌肉组织与其他组织，直至骨组织的表面光滑，然后置于由PBS配制的4%多聚甲醛中进行固定；第二步，预脱钙：将骨组织从4%多聚甲醛中取出，流水冲洗后置于预先配置的PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为34℃的恒温箱中2~3d，直至骨组织初步变软，完成预脱钙处理，其中所采用的PBS-EDTA脱钙液的体积为所用骨组织体积的20倍；第三步，脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，所述组织块的大小为9mm2，保证切口平整光滑，并放入盛有预先配置的无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在水温在50℃下脱钙24h，直至组织块完全变软，用针尖刺入骨干或用手动折弯骨干即可；第四步，去酸：取出组织块装入纱布袋，封住袋口后悬置于流水处冲洗6h；第五步，梯度脱水：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液脱水1h、80%乙醇溶液脱水1h、90%乙醇溶液脱水1h、100%乙醇和叔丁醇混合液脱水2h、100%乙醇和丙酮混合液脱水2h、100%正丁醇溶液脱水1h；第六步，透明；组织块经梯度脱水后转入质量体积比为6：1的氯仿-无水乙醇混合液内12h，然后转入氯仿溶液内24h，直至组织块下沉至容器底部，此时表明透明过程完成；第七步，包埋：将透明完成的组织块从氯仿溶液中取出，先加入按质量体积比1：2混合的正丁醇-石蜡预浸液中6h，再放入已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡6h，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按质量体积比8：1的混合溶液，所述高熔点温度为58°，将浸蜡完成后的组织块取出包埋，待蜡块成型，做好标记；第八步，切片：取冷却后成型良好的蜡块进行切片，切片厚度8μm，切出的组织块蜡片放入38℃的蒸馏水中展片，捞片后烘烤，直至切片与载玻片完全相贴合，采用流水冲洗以切片不脱落为宜；第九步，染色：将切片放入苏木精染液中，HE染色后，染色时间10min，用少量树胶封住切片，封好的切片置于干净的白纸上，待完成干燥封片后，完成切片过程，将其置于显微镜下观察，如图1。
实施例2：
1、配置PBS-EDTA脱钙液和无机酸脱钙液：①PBS-EDTA脱钙液：将12.5g EDTA-Na2和PH为7.3的100ml磷酸盐缓冲液置于加热磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液，同时搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.3，即得到PBS-EDTA溶液；②无机酸脱钙液：将10ml浓盐酸、6ml甲酸和8g氯化钙加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即得到无机酸脱钙液。
2、切片步骤：第一步，固定：取大鼠的骨组织，清除骨组织周围的肌肉组织与其他组织，直至骨组织的表面光滑，然后置于由PBS配制的4%多聚甲醛中进行固定；第二步，预脱钙：将骨组织从4%多聚甲醛中取出，流水冲洗后置于预先配置的PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为36℃的恒温箱中直至骨组织初步变软，完成预脱钙处理，其中所采用的PBS-EDTA脱钙液的体积为所用骨组织体积的25倍；第三步，脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，所述组织块的大小为16mm2，保证切口平整光滑，并放入盛有预先配置的无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在水温在57℃下脱钙20h，直至组织块完全变软，用针尖刺入骨干或用手动折弯骨干即可；第四步，去酸：取出组织块装入纱布袋，封住袋口后悬置于流水处冲洗6h；第五步，梯度脱水：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液脱水1h、80%乙醇溶液脱水1h、90%乙醇溶液脱水1h、100%乙醇和叔丁醇混合液脱水2h、100%乙醇和丙酮混合液脱水2h、100%正丁醇溶液脱水1h；第六步，透明；组织块经梯度脱水后转入体积比为3：1的氯仿-无水乙醇混合液内16h，然后转入氯仿溶液内24h，直至组织块下沉至容器底部，此时表明透明过程完成；第七步，包埋：将透明完成的组织块从氯仿溶液中取出，先加入按体积比1：2混合的正丁醇-石蜡预浸液中8h，再放入已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡6h，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按体积比6：1的混合溶液，所述高熔点温度为60℃，将浸蜡完成后的组织块取出包埋，待蜡块成型，做好标记；第八步，切片：取冷却后成型良好的蜡块进行切片，切片厚度6μm，切出的组织块蜡片放入42℃的蒸馏水中展片，捞片后烘烤，直至切片与载玻片完全相贴合，采用流水冲洗以切片不脱落为宜；第九步，染色：将切片放入苏木精染液中，HE染色后，染色时间8min，用少量树胶封住切片，封好的切片置于干净的白纸上，待完成干燥封片后，完成切片过程，将其置于显微镜下观察，如图2。
实施例3：
1、配置PBS-EDTA脱钙液和无机酸脱钙液：①PBS-EDTA脱钙液：将15g EDTA-Na2和PH为7.4的100ml磷酸盐缓冲液置于加热磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液，同时搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.4，即得到PBS-EDTA溶液；②无机酸脱钙液：将12ml浓盐酸、6ml甲酸和8g氯化钙加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即得到无机酸脱钙液。
2、切片步骤：第一步，固定：取大鼠的骨组织，清除骨组织周围的肌肉组织与其他组织，直至骨组织的表面光滑，然后置于由PBS配制的4%多聚甲醛中进行固定；第二步，预脱钙：将骨组织从4%多聚甲醛中取出，流水冲洗后置于预先配置的PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为38℃的恒温箱中直至骨组织初步变软，完成预脱钙处理，其中所采用的PBS-EDTA脱钙液的体积为所用骨组织体积的30倍；第三步，脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，所述组织块的大小为25mm2，保证切口平整光滑，并放入盛有预先配置的无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在水温在60℃下脱钙12h，直至组织块完全变软，用针尖刺入骨干或用手动折弯骨干即可；第四步，去酸：取出组织块装入纱布袋，封住袋口后悬置于流水处冲洗6h；第五步，梯度脱水：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液脱水1h、80%乙醇溶液脱水1h、90%乙醇溶液脱水1h、100%乙醇和叔丁醇混合液脱水2h、100%乙醇和丙酮混合液脱水2h、100%正丁醇溶液脱水1h；第六步，透明：组织块经梯度脱水后转入体积比为4.5：1的氯仿-无水乙醇混合液内12h，然后转入氯仿溶液内48h，直至组织块下沉至容器底部，此时表明透明过程完成；第七步，包埋：将透明完成的组织块从氯仿溶液中取出，先加入按体积比1：2混合的正丁醇-石蜡预浸液中3h，再放入已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡3h，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按体积比7：1的混合溶液，所述高熔点温度为59℃，将浸蜡完成后的组织块取出包埋，待蜡块成型，做好标记；第八步，切片：取冷却后成型良好的蜡块进行切片，切片厚度7μm，切出的组织块蜡片放入40℃的蒸馏水中展片，捞片后烘烤，直至切片与载玻片完全相贴合，采用流水冲洗以切片不脱落为宜；第九步，染色：将切片放入苏木精染液中，HE染色后，染色时间12min，用少量树胶封住切片，封好的切片置于干净的白纸上，待完成干燥封片后，完成切片过程，将其置于显微镜下观察，如图3。
从图1-3与图4对比，可以看出，改进后的骨组织切片技术可以降低骨组织HE染色过程中脱片，可以使骨组织HE染色均匀；而常规技术中易导致骨组织在染色过程中脱片，导致骨组织HE染色不均匀。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：固定：取骨组织，清除其他组织至表面光滑，置于由PBS配制的多聚甲醛中固定；
S2：预脱钙：将骨组织从多聚甲醛中取出，冲洗后置于PBS-EDTA脱钙液中，并放入温度为34~38℃的恒温箱中直至骨组织初步变软；
S3：脱钙：将初步变软的骨组织切割成组织块，并放入盛有无机酸脱钙液的容器中，再将容器置于水浴锅中，在温度40~60℃下脱钙18~24h，直至组织块完全变软；
S4：脱水与透明：对脱钙的组织块冲洗并去酸后进行梯度脱水，在脱水完成后转入盛有氯仿-无水乙醇混合液的容器内8~12h，最后再转入盛有氯仿溶液的容器内24~48h，直至组织块下沉至容器底部即完成透明过程；
S5：包埋与切片：步骤S4完成后，取出组织块进行浸蜡处理，并对组织块进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于蒸馏水中展开，烘干直至蜡片与载玻片相贴合，最后染色后封片。
2.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S2中，所采用的PBS-EDTA脱钙液与骨组织的体积比为20~30：1，其中所述PBS-EDTA的配置过程如下：将EDTA-Na2和磷酸盐缓冲液按质量体积比1~1.5：10置于磁力搅拌器进行混合，在加热过程中添加NaOH当量溶液并搅拌至白色粉末状钠盐完全溶解，再用稀盐酸调节混合溶液pH至7.2-7.4，即可获得PBS-EDTA脱钙液。
3.根据权利要求2所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，所采用的磷酸盐缓冲液的PH为7.2-7.4。
4.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S3中，所述无机酸脱钙液的配制过程如下：将浓盐酸、甲酸和氯化钙按质量体积比4~6：3：4加入盛有蒸馏水的烧杯中，涡旋震荡混匀，即可得到无机酸脱钙液。
5.根据权利要求1所述的脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S3中，所述组织块的大小为3～5×3～5mm2。
6.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S4中，所述梯度脱水的步骤为：将组织块依次通过以下溶液进行脱水：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液、100%乙醇和叔丁醇混合液、100%乙醇和丙酮混合液、100%正丁醇溶液，每个梯度分别脱水1~2h。
7.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，所述氯仿-无水乙醇混合液为氯仿和无水乙醇按体积比3~6：1进行混合而成。
8.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S5中，所述浸蜡处理步骤为：先将组织块置于预浸液内3~6h，再置于已融化的高熔点混合蜡液中浸蜡3~6h，其中预浸液为正丁醇和石蜡按体积1：2的混合溶液，所述混合蜡液为石蜡和蜜蜡按体积6~8：1的混合溶液，其中所述高熔点的温度为58~60℃。
9.根据权利要求1所述的使用脱钙法制作骨组织切片的方法，其特征在于，步骤S5中，所述蜡片的厚度为6~8μm。
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