CN103290076B

CN103290076B - 一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法

Info

Publication number: CN103290076B
Application number: CN201310251799.7A
Authority: CN
Inventors: 王宝维; 韩海娜; 葛文华; 张名爱; 岳斌
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao day food Limited by Share Ltd
Priority date: 2013-06-22
Filing date: 2013-06-22
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-06-22
Also published as: CN103290076A

Abstract

本发明的目的是提供一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法，即采用化学皂化法水解油脂并进行酶解制备甘油二酯。本发明在甘油二酯制备工艺中，增加了鹅油精炼和真空抽滤步骤，有利于除去杂质，缩短过滤时间，增加鹅油纯度与提取率，进而增加了甘油二酯成品率；另外，采用酶法制备鹅油甘油二酯，在脂肪水解的基础上进行，不仅使反应更加充分，还在一定程度上缩短了反应时间，提高了甘油二酯生成率，填补了该领域的空白，为鹅油甘油二酯的制备探索出一种新的方法，具有重要的经济社会价值。

Description

一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法

技术领域

本发明属于甘油二酯制备技术领域，具体涉及一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法。

背景技术

甘油二酯（Diacylglycerol,DG）是一类甘油三酯（Triacylglycerol,TG）中一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中间产物，它是公认安全（GRAS认证）的食品成分。研究发现甘油二酯和甘油三酯的消化和代谢途径明显不同。甘油二酯大多都被分解为不能再合成脂肪的1-MG与脂肪酸，由于1-MG与2-MG中脂肪酸与甘油结合的位置不同，因此作为中性脂肪合成原料有很大差别，在小肠内向中性脂肪再次合成极其迟缓。细胞内游离脂肪酸浓度变高，并通过β-氧化途径最终被分解为水和二氧化碳释放，导致甘油二酯在小肠脂质分解和能量利用率提高。因此，甘油二酯具有减少内脏脂肪、降低血脂和抑制体重增加的作用。

目前，甘油二酯作为多功能添加剂，其世界主要生产商都将其制备技术作为商业秘密保护，在文献中鲜有报道。就国内而言，甘油二酯的生产方法还没有取得突破性进展。由于甘油二酯的生产是多学科集成技术，单方面的技术优势不足，难以实现技术突破，且国外核心工程化技术处于保密状态，因此，目前国内甘油二酯尚未见产业化报道。

鹅油具有熔点低、香味独特，尤其是经过填饲的肥肝鹅腹部和皮下等部位沉积大量的脂肪，经过精炼处理得到的鹅油，胆固醇含量低、不饱和脂肪酸含量很高，是一种有待于开发的动物性油脂。但是目前对于鹅油的研究较少，大部分鹅油都用作饲料而造成浪费。因此，以精炼鹅油作为脂肪酸供体制备甘油二酯，可以大大提高鹅油的经济利用价值，提高产品的附加值。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法，即采用化学皂化法水解油脂并进行酶解制备甘油二酯，以填补目前该领域的空白。

申请人一直致力于研究酶解鹅油制备甘油二酯的最佳方法，通过长时间的研究确定出酶解鹅油制备甘油二酯的最佳工艺条件，从而促成了本发明。

本发明为酶解鹅油制备甘油二酯方法，包括有如下的步骤：

1）鹅油的精炼：将肥肝鹅腹脂置于一定温度下融化，除去杂质制得粗鹅油；粗鹅油经脱胶、脱色、脱臭处理后得到精炼鹅油；

2）混合脂肪酸的制备：将步骤1）制备的精炼鹅油作为脂肪酸供体来进行皂化水解，皂化物再进行酸化处理得到混合脂肪酸。

3）甘油二酯的制备：将甘油和步骤2）制备的混合脂肪酸混合制成反应溶液，加入南极假丝酵母脂肪酶B进行恒温反应，反应结束后离心，上清液即为甘油二酯。

上述步骤1）中肥肝鹅油精炼，除去杂质的方法为真空抽滤；

上述步骤1）中肥肝鹅腹脂融化的融化温度为55℃。

上述2）混合脂肪酸制备条件的皂化温度为82℃、反应时间为60min、酸化过程中pH值为2～3。

上述3）反应中甘油与混合脂肪酸的质量比优选为1:1.05，此条件下，甘油与脂肪酸的混合程度最好，甘油二酯生成率最高，且产物易于分离。

上述3）反应中恒温反应的温度优选为50℃，反应时间优选为9.2h，酶的质量分数优选为2.25%，此条件下，酶解反应最充分，副反应少，产品纯度高，减少了原材料及能源的浪费，有利于实现绿色生产。

本发明在甘油二酯制备工艺中，增加了鹅油精炼和真空抽滤步骤，有利于除去杂质，缩短过滤时间，增加鹅油纯度与提取率，进而增加了甘油二酯成品率；另外，采用酶法制备鹅油甘油二酯，在脂肪水解的基础上进行，不仅使反应更加充分，还在一定程度上缩短了反应时间，提高了甘油二酯生成率，填补了该领域的空白，为鹅油甘油二酯的制备探索出一种新的方法，具有重要的经济社会价值。

附图说明

图1：本发明中温度与时间之间交互响应面图；

图2：本发明中温度与底物比之间交互响应面图；

图3：本发明中温度与加酶量之间交互响应面图；

图4：本发明中时间与底物比之间交互响应面图；

图5：本发明中底物比与加酶量之间交互响应面图；

图6：本发明中加酶量与时间之间交互响应面图；

具体实施方式

本发明首先采用化学法对鹅油进行处理制得混合脂肪酸，再将甘油与混合脂肪酸按照一定比例混合，然后加入一定量的酶进行反应。以甘油二酯的生成率为指标，底物比、加酶量、反应时间及反应温度为因素，设计响应面试验，筛选出酶解鹅油制备甘油二酯的最佳工艺条件。

本发明中酶解鹅油制备甘油二酯方法，包括有如下的步骤：

1）鹅油的精炼：将肥肝鹅腹脂置于55℃下融化，真空抽滤除去杂质，即可制得粗鹅油；粗鹅油经脱胶、脱色、脱臭处理后得到精炼鹅油。通过真空抽滤的方法除去杂质，有效缩短过滤时间，使鹅油纯度和提取率大大提高，进而增加了甘油二酯成品率。

具体步骤如下：脱胶处理：将粗鹅油在水浴中加热至60℃，并不断搅拌，然后缓慢加入占鹅油体积0.5%～2%的磷酸(体积分数分别选用85%、80%、75%)，搅拌均匀，在60℃下加热2min，再以4000r／min离心20min，上层漂浮的油即为脱胶鹅油。

通过对鹅油的提取率和脂肪酸含量分析表明，当使用体积分数为80%的磷酸用量为鹅油体积的1%，加热时间为2min时粗鹅油的脱胶方效果最好。

脱色处理：将脱胶鹅油水浴加热至60℃，再分别加入占鹅油重1%、3%、5%、7%、9%的活性白土，搅拌20min后，以4000r／min离心20min，上层漂浮的油即为脱色鹅油。结果表明，当活性白土用量为脱胶鹅油重量的3%时，即可以避免白土量不足使色素不能充分去除；又能防止过量的白土造成粗鹅油的浪费。

脱臭处理：将脱色鹅油置于圆底烧瓶中，分别置于45℃～65℃的温度下，利用旋转蒸发仪真空处理鹅油15min～30min，即得脱臭鹅油。通过粗鹅油的提取率和脂肪酸含量可知，粗鹅油的最佳脱臭方法为45℃下真空处理30min。

2)混合脂肪酸的制备：将精炼处理的鹅油按体积比1:4的比例加入1mol/LNaOH-乙醇溶液，磁力搅拌一段时间使其完全溶解后转移至1000ml的三口烧瓶，氮气保护下水浴回流皂化一段时间，得皂化液；减压蒸出乙醇，加水使皂化物完全溶解，在恒温恒速搅拌的条件下用10%HCl酸化至pH2～3，加入一定体积的正己烷萃取，温水洗至中性，减压蒸出溶剂，加无水硫酸钠脱水，抽滤，得混合脂肪酸。这样不仅使反应更加充分，还在一定程度上缩短了反应时间，提高了甘油二酯生成率。其中，混合脂肪酸制备条件：皂化温度82℃、反应时间为60min；反应中回收的乙醇与正己烷均可重复利用。

而且，皂化反应中以乙醇作为溶剂，增大了与反应物（精炼肥肝鹅油+NaOH）的接触面积，解决了水溶液体系反应不充分的问题，缩短了反应时间，使水解更加充分，并且蒸出的乙醇可以重复使用。这不仅减少了环境污染，而且降低了反应成本，有利于实现大规模生产。

3）甘油二酯的制备：按比例称取一定量的甘油和混合脂肪酸于小烧瓶中，置于恒温摇床中,使反应物混合均匀，待升至所规定的温度后加入一定量南极假丝酵母脂肪酶B，开始计时，恒温反应一段时间后通过离心可将酶分离，即可得到高甘油二酯混合物,分离出的酶经叔丁醇浸泡脱去油脂后，可进行重复使用。

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。

实施例1：酶解鹅油制备甘油二酯最佳工艺条件的筛选试验

1、鹅油的精炼

将肥肝鹅腹脂加热55℃进行融化，采取真空抽滤除去杂质，获得粗鹅油；对粗鹅油进行脱胶、脱色、脱臭处理，获得精炼鹅油产品。

2、混合脂肪酸的制备

将精炼处理的鹅油按1:4的比例加入1mol/L NaOH-乙醇溶液，磁力搅拌一段时间使其完全溶解后转移至1000ml的三口烧瓶，82℃水浴回流皂化1h，得皂化液，转入旋转蒸发仪中，减压蒸出乙醇，加水使皂化物完全溶解，在恒温恒速搅拌的条件下用10%HCl酸化至pH2～3，分层，加入一定体积的正己烷萃取，除去下层水层，温水洗至中性，减压蒸出溶剂，加无水硫酸钠脱水，抽滤，获得混合脂肪酸。

3、甘油二酯的制备

按底物比1：0.5～3的比例将甘油和混合脂肪酸加入烧瓶中，置于恒摇床,并设定反应温度为30℃～70℃，反应物混合均匀后，加入1%～5%南极假丝酵母脂肪酶B，反应时间为0～12h，反应完成后，将酶解液于高速离心机中离心10min，得上清液。通过离心可将酶分离，即可得到高甘油二酯混合物，液相色谱法测定甘油二酯的生成率。

对于上述的反应条件的优化如下：

（1）底物比的筛选：设定加酶量为3%，反应时间8h，反应温度50℃条件下，调节甘油与混合脂肪酸的质量比例为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3分别进行试验，测定甘油二酯生成率，并对其底物比进行初步筛选。

（2）反应加酶量的筛选：设定底物比为1:1，反应时间8h，反应温度50℃条件下，调节加酶量为1%、2%、3%、4%、5%分别进行试验，测定甘油二酯生成率，并对加酶量进行初步筛选。

（3）酶解时间的筛选：设定底物比为1:1，加酶量3%，反应温度50℃条件下，调节酶解时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分别进行试验，测定甘油二酯生成率，并对其反应时间进行初步筛选。

（4）酶解温度的筛选：设定底物比为1:1，加酶量3%，反应时间8h条件下，调节酶解温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃分别进行试验，测定甘油二酯生成率，并对其反应温度进行初步筛选。

（5）响应面试验方案及结果

表1响应面方案及结果

（6）响应面回归模型的建立与分析：通过响应面软件design expert7.0.0对试验结果进行分析后得出其线性回归方程如下:

Y=92.88+1.43A+0.64B+1.24C+0.63D-0.28AB-1.44AC-1.3AD-0.37BC-0.28BD-1.75CD-2.25A²-0.44B²-4.05C²-0.73D²

式中：A表示反应温度；B表示反应时间；C表示底物比；D表示加酶量，对上述响应面试验进行方差分析，结果如表2。

表2响应面方差分析

由表可知，回归模型整体呈极显著（P<0.01），模型失拟项为0.0680>0.05，没有显著性影响，说明残差由随机误差造成，且回归方程可以代替真实点进行试验结果的分析。模型决定系数R²=0.953，表明模型拟合度较好，可以良好的描述此试验。一次项对试验影响大小排序为A>C>B>D，即：反应温度>底物比>反应时间>加酶量，其中反应温度对试验有极显著性影响（P<0.01），反应时间、加酶量和底物比对试验有显著性影响（P<0.05）。交互项中BC和BD显著性较好，说明底物比和反应时间，反应时间和加酶量的相互作用对提取率的影响较大。经design expert7.0软件分析后，得出酶法制备额油甘油二酯的最佳工艺条件为：反应温度为50℃，反应时间为9.2h，底物比（混合脂肪酸：甘油）为1.05，加酶量为2.25%，在此条件下甘油二酯的生成率为92.43%。优化条件的结果详见附图1-6。

实施例2：酶解鹅油制备甘油二酯最佳工艺条件筛选回归试验一

按底物比1:1.05的比例将甘油和混合脂肪酸直接加入烧瓶中，置于恒摇床,并设定反应温度为50℃，反应物混合均匀后，加入2.25%质量分数的南极假丝酵母脂肪酶B，反应时间为9.2h，反应完成后，将酶解液于高速离心机中离心10min，将酶分离，上清液即为高甘油二酯混合物，液相色谱法测定甘油二酯的生成率。通过5次验证试验发现，在该条件下所得甘油二酯生成率依次为92.05%、92.37%、92.28%、92.25%、92.34%，平均提取率为92.26%，与实施案例1的结果基本一致；上述结果表明本发明的工艺具有很好稳定性。

实施例3：酶解鹅油制备甘油二酯工艺条件筛选回归试验试验二

完全按照实施例1工艺步骤进行再次试验，只是在甘油二酯制备工艺中，删除鹅油精炼和真空抽滤两个步骤。

通过5次验证试验发现，在该条件下所得甘油二酯生成率依次为80.05%、80.37%、80.28%、80.25%、80.34%，平均提取率为80.26%，远远低于实施案例1的结果；上述结果表明，鹅油精炼和真空抽滤有利于提高甘油二酯提取率。

实施例4：未优化条件下制备甘油二酯试验

按底物比1：4的比例将甘油和混合脂肪酸直接加入烧瓶中，置于恒摇床,并设定反应温度为40℃，反应物混合均匀后，加入2%的南极假丝酵母脂肪酶B，反应时间为8h，反应完成后，将酶解液于高速离心机中离心10min，得上清液。通过离心将酶分离，得到高甘油二酯混合物，液相色谱法测定甘油二酯生成率。

结果表明，实施案例4的提取率为70%，远低于实施例1最佳条件下的92.43%，因此,实施例1的提取方法较为理想。

实施例5：直接法酶解鹅油制备甘油二酯试验

按底物质量比1：3的比例将甘油和未经水解的精炼鹅油直接加入烧瓶中，置于恒摇床,并设定反应温度为50℃，反应物混合均匀后，加入3%南极假丝酵母脂肪酶B，反应时间为8h，反应完成后，将酶解液于高速离心机中离心10min，得上清液。通过离心将酶分离，得到高甘油二酯混合物，液相色谱法测定甘油二酯的生成率。

结果表明，实施案例5的提取率为35%，远低于实施例1最佳条件下的92.43%。

本发明的方法在肥肝鹅油的精炼过程中，通过真空抽滤的方法除去杂质，有效缩短过滤时间，增加鹅油纯度；另外，在传统酶解的基础上，首先对鹅油进行了混合脂肪酸的制备，即在化学水解（皂化）的基础上进行处理，不仅使反应更加充分，减少了原材料浪费；还在一定程度上缩短了反应时间，提高了生产效率和甘油二酯的生成率；同时，此项技术避免了采用高温、高压工艺造成的能源浪费，属于节能减排工艺创新，可以直接应用于鹅油新产品的进一步开发，对水禽产业加工副产品利用提供了一条新的途径，该项技术推广应用必将产生巨大的社会经济价值。

Claims

1.一种酶解鹅油制备甘油二酯的方法，包括有如下的步骤：

2）混合脂肪酸的制备：将步骤1）制备的精炼鹅油作为脂肪酸供体来进行皂化水解，皂化物再进行酸化处理得到混合脂肪酸；

3）甘油二酯的制备：将甘油和步骤2）制备的混合脂肪酸混合制成反应溶液，加入南极假丝酵母脂肪酶B进行恒温反应，反应结束后离心，上清液即为甘油二酯；其中甘油和混合脂肪酸的质量比为1:1.05；恒温反应温度为50℃；南极假丝酵母脂肪酶B的加酶量为2.25%；恒温反应的反应时间为9.2h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中肥肝鹅腹脂融化，其融化温度为55℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中除去杂质方法为真空抽滤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中皂化水解温度82℃、反应时间为60min，酸化过程中pH值为2～3。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3）中的南极假丝酵母脂肪酶B为固定化的南极假丝酵母脂肪酶B。