CN103243079B

CN103243079B - 一种鸭硫酸软骨素复配酶解的提取方法

Info

Publication number: CN103243079B
Application number: CN201310180805.4A
Authority: CN
Inventors: 王宝维; 陈晨; 葛文华; 张名爱; 岳斌
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: CN103243079A

Abstract

本发明首先根据鸭胸软骨的化学组成设计了一种用于提取鸭硫酸软骨素的新型复合蛋白酶的基础配方，并利用复配酶制备鸭硫酸软骨素，其工艺包括鸭胸软骨骨粉的制备、鸭胸软骨骨粉的酶解提取、蛋白质的沉降、硫酸软骨素粉末四个步骤。本发明采用了复配酶解法提取鸭胸软骨的硫酸软骨素，采用新型复合蛋白酶和胰蛋白酶复配，去掉了碱提这一步，在复配酶使用上也进行了优化，其收率比其它方法提高了20%左右，产品纯度达到90%～95%。用复合酶代替稀碱或浓碱解离软骨能够大大降低对环境的污染，并且可以有效缩短生产周期、降低生产成本、增加了产品收率、提高产品质量，填补了该领域的空白。

Description

一种鸭硫酸软骨素复配酶解的提取方法

技术领域

本发明属于硫酸软骨素制备技术领域，具体涉及一种鸭硫酸软骨素复配酶解的提取方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的酸性黏多糖。硫酸软骨素具有抗凝血、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、防止动脉粥样硬化、调节体内水分、清除自由基和延缓衰老等多种生理功能，可应用于食品、药品、各种保健品及高档化妆品中。

我国是全球硫酸软骨素产量最大的国家，占全球产量的80%以上，年平均产量多于4000吨；我国硫酸软骨素主要出口到美国、欧洲、日本等地，其中美国作为我国硫酸软骨素第一大出口市场，出口份额约占50%。所以，随着硫酸软骨素生物活性功能不断研究及其应用领域的不断扩展，硫酸软骨素用途越来越广，具有广阔市场应用前景。

迄今，大多数硫酸软骨素生产企业仍采用传统的生产工艺。随着生化分离工程的进步，硫酸软骨素的生产技术将逐渐被新工艺、新技术所取代，其提取工艺向着更加降耗节能、绿色环保方向发展，更加注重产品的质量、收率、纯度和生物资源的综合优化利用。由于考虑到环保和成本等问题，目前硫酸软骨素的提取多采用改进的酶解法，相对于传统的碱解法和盐解法，生产出的产品提取率高、纯度符合标准，并且生产周期短，环境污染小。

虽然在硫酸软骨素酶解提取方法和作用机制的研究上已取得一定的研究进展，但应用到实际工业化生产中还需进行多方面的研究和改善。譬如：王金华采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解猪鼻软骨，此方法尽管解决了环保问题，但是酶用量较大，成本高，收率低。本发明的方法主要采用新型复合蛋白酶，其酶系中主要含有胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶，在酶解提取过程中能彻底水解胶原蛋白、脂肪和核酸类物质，再和特异性相对高的胰蛋白酶复配使用，能有效降低成本，提高收率。

截止到目前，国内外在鱼类、猪、牛、羊等动物硫酸软骨素的提取方法上已开展了大量研究，而对鸭软骨中有效活性物及其功能缺乏系统研究，从鸭胸软骨中提取硫酸软骨素技术还处于空白。我国肉鸭年出栏23亿只左右，而且生长期短，一般只有38～42天；由于育肥时间短，其肉鸭屠宰加工的副产品鸭胸软骨中的硫酸软骨素较其它家禽、家畜含量更高，是有待于开发利用的宝贵资源。为此，研究鸭硫酸软骨素提取工艺和功能应用，对进一步开发新的鸭硫酸软骨素资源，扩展其在功能食品、药品和保健品等领域的应用，具有重要经济和社会价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭硫酸软骨素的提取方法，即采用复合蛋白酶解法制备鸭硫酸软骨素，以填补目前该领域技术的空白。

申请人通过长时间的研究，获得了提取鸭硫酸软骨素的最佳复合蛋白酶组方，并经过单因素和响应面试验的筛选，确定出复合蛋白酶解法制备鸭硫酸软骨素的最佳工艺条件。

本发明首先根据鸭骨的化学组成设计了一种用于提取鸭硫酸软骨素的复合蛋白酶，其由胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶组成，其按照重量份数的比例为1.5：1：0.5：0.5；再与胰蛋白酶复配使用，其复配比例为1：0.5。

应用上述的复合蛋白酶制备鸭硫酸软骨素，具体包括如下步骤：

1）鸭胸软骨骨粉的制备：将鸭胸软骨蒸煮并清洗；再先后通过混合有机溶剂和NaCl溶液进行浸泡处理，烘干后粉碎为60～80目的鸭胸软骨骨粉；

2）鸭胸软骨骨粉的酶解提取：将处理好的鸭胸软骨骨粉，加入到复合蛋白酶水溶液中进行酶解，制成鸭硫酸软骨素酶解液；

3）蛋白质的沉降：鸭硫酸软骨素酶解液中添加蛋白质沉降剂去除杂质蛋白；

4）硫酸软骨素粉末的制备：将去除蛋白的鸭硫酸软骨素溶液经过浓缩、沉降、脱水、烘干之后，获得鸭硫酸软骨素粉末。

上述步骤1）中将鸭胸软骨蒸煮，其中蒸煮的温度为60℃～80℃，蒸煮时间0.5h～1h。

上述步骤1）中混合有机溶剂是甲醇与氯仿的混合溶液，其中甲醇和氯仿的体积比为1～3:1；NaCl溶液的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。

上述步骤2）中复合蛋白酶水溶液中复合蛋白酶的浓度为0.1%；鸭胸软骨骨粉在复合蛋白酶水溶液中的添加浓度为10%；

为了获得更好的提取效果，在复合蛋白酶水溶液中还添加了胰蛋白酶，添加浓度为0.05%；

上述步骤2）中酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为5h～7h，酶解pH为6.0～7.0。

上述步骤3）中蛋白质沉降剂为三氯乙酸溶液，浓度为3%～7%，与鸭硫酸软骨素酶解液的体积比为1:1。

上述步骤4）中乙醇添加比例为1:2～4，沉降时间为4h～6h；烘干温度为60℃，时间为30min～40min。

本发明采用了复合蛋白酶解法提取鸭胸软骨的硫酸软骨素，采用新型复合蛋白酶和胰蛋白酶复合蛋白酶组方，去掉了碱提这一步，并在复合蛋白酶组的合理使用上也进行了优化，在指标上优于现行工艺。用复合蛋白酶代替稀碱或浓碱解离软骨，能够大大减少排污，降低对环境的污染，并且可以有效缩短生产周期、降低生产成本、增加生产效率、提高产品质量，能够满足在食品、药品和保健品方面鸭硫酸软骨素的环保、安全和高效提取加工的需要，为硫酸软骨素生产提供了更加科学的方法。

具体实施方式

本发明采用复合蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶解的方法制备鸭硫酸软骨素。以鸭硫酸软骨素提取率为响应值，酶解温度、酶解时间和酶解pH为响应因子，设计响应面试验，得到制备鸭硫酸软骨素的最佳工艺条件。

本发明的制备方法，包括如下的步骤：

1）复合蛋白酶组方：胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶、核酸酶，按照重量份数的比例为1.5：1：0.5：0.5；并可选择添加一定量的胰蛋白酶增加酶解效果，添加量为胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶总重的50%。酶解过程中，鸭胸软骨骨粉、新型复合蛋白酶和胰蛋白酶按照重量份数的比例为100：1：0.5。

由于鸭胸软骨的主要成分除了硫酸软骨素，还有II型胶原蛋白、脂肪和少量的核酸类物质；为此设计了新型复合蛋白酶，其酶系中主要含有胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶，在酶解提取过程中能彻底水解鸭胸软骨中的胶原蛋白、脂肪和核酸类物质。胰蛋白酶作为肽链内切酶，是特异性最强的蛋白酶，在酶解过程中和其它蛋白酶复合具有很强的协同作用，可以有效提高酶解效果。

2）鸭胸软骨骨粉的制备：原材料为新鲜鸭胸骨，在60℃～80℃恒温锅内蒸煮0.5h～1h，有利于去除鸭胸软骨上面附着未清除干净的鸭肉、筋膜和部分油脂。再通过混合有机溶剂和NaCl溶液的浸泡处理，去除脂肪和其它杂蛋白。最终鸭软骨经过切片（呈洁白色）、烘干，60～80目粉碎后，-20℃保存备用。

将已经除去表面肉、筋膜和部分油脂的鸭胸软骨进行切片处理，放在混合有机溶剂中浸泡，是根据脂肪可溶于大多数有机溶剂的原理进行的。经过对甲醇与氯仿的混合溶液和乙醚溶液的对比试验，以最终产品的纯度高低为指标，发现鸭胸软骨中的脂肪能更好地溶解于混合有机溶液。混合有机溶剂是甲醇与氯仿的混合溶液，其中甲醇和氯仿的体积比为1～3:1；该混合有机溶剂的组分和配比的设计原则是根据鸭胸软骨的组分来配制的，其优点是能够有效的去除鸭胸软骨中的油脂，又不会对软骨本身产生溶解。

将经过混合有机溶剂浸泡的鸭胸软骨切片冲洗干净，放在NaCl溶液的浸泡处理，是根据蛋白质属于亲水性胶体，因此溶解在水中成胶体溶液，而加入少量的氯化钠就会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，进而使附着在鸭胸软骨切片表面的杂蛋白在水溶液中的溶解度增大而溶出。

3）鸭胸软骨骨粉的酶解提取：将处理好的鸭胸软骨骨粉，加入到新型复合蛋白酶和胰蛋白酶溶液中进行酶解，酶解液即为鸭硫酸软骨素粗品溶液。

通过单酶酶解和复合蛋白酶解效果之间的比较，选取出最佳酶解方法。复合蛋白酶组方是根据鸭胸软骨含有的主要成份确定的；其中，新型复合蛋白酶其组方酶系中主要含有胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶，在鸭硫酸软骨素提取过程中能够彻底水解胶原蛋白、脂肪和核酸类物质，组方酶解效果优于其它单酶。胰蛋白酶作为肽链内切酶，是特异性最强的蛋白酶，它与新型复合蛋白酶复配后的酶解效果更佳。与其它单酶酶解和双酶酶解相比，酶用量减少50%左右，提取率提高20%左右。

4）蛋白质的沉降：鸭胸软骨骨粉酶解液中含有大量的蛋白质，通过添加蛋白质沉降剂将杂质蛋白进一步清除。

经过酶解液和一定浓度的三氯乙酸溶液按照一点比例混合进一步除去杂质蛋白，这是根据在酸性条件下，三氯乙酸与蛋白质形成不溶性盐，其作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，从而使蛋白质聚集沉淀。沉降的蛋白质等物质留作提取活性肽原料用。

5）硫酸软骨素粉末的制备：鸭硫酸软骨素溶液要经过浓缩、乙醇沉降、脱水、烘干之后，可以得到鸭硫酸软骨素粉末。

经过浓缩液和一定浓度乙醇按照一定比例边搅拌边混合，静置适当时间使硫酸软骨素自然沉降，原理是硫酸软骨素不溶解于乙醇等有机溶剂。

下面结合实施案例对本发明的方法进行详细描述。

实施例1：蛋白酶的筛选试验

原材料处理：鸭胸软骨置于60℃～80℃恒温蒸煮锅内蒸煮0.5h～1h后，除去软骨上多余的肉、筋膜和油脂，用清水冲洗干净。然后采用甲醇：氯仿（1～3:1）低温浸泡7h～9h除去脂肪，用清水冲洗干净。再用0.5mol/L～1.5mol/L NaCl溶液浸泡骨料，并缓慢搅拌除去大部分盐溶性的杂蛋白，使鸭软骨呈洁白色。烘干、60～80目粉碎后，-20℃保存备用。

①复合蛋白酶与单酶酶解试验

取一定量蛋白酶（新型复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶），放入烧杯中，加入一定量蒸馏水摇匀，再加入一定量的经过预先处理的鸭胸软骨粉末，在恒温水浴中酶解一定时间，根据酶解后制得的鸭硫酸软骨素粉末提取率的高低，选取最佳蛋白酶。

试验结果表明，所选的五种蛋白酶在相同的试验条件下，以鸭硫酸软骨素的提取率为指标，本发明的新型复合蛋白酶的酶解效果明显高于其它四种蛋白酶，提取率比实验室提取工艺普遍使用的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶高出2%左右，较酶解效果最差的中性蛋白酶高出3%以上；木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果基本一致，木瓜蛋白酶略优于胰蛋白酶；碱性蛋白酶的酶解效果低于前三种酶，中性蛋白酶的效果最差，具体结果如图1所示。

②复合蛋白酶与単酶复合蛋白酶解试验

试验结果表明，新型复合蛋白酶和胰蛋白酶复配的酶解效果比新型复合蛋白酶单独酶解的效果好，提取率高出2.66%；另外三种酶和新型复合蛋白酶复配的酶解效果都低于新型复合蛋白酶单独酶解的效果，具体结果如图2所示。

③复合蛋白酶与胰蛋白酶复配比例筛选试验

试验结果表明，新型复合蛋白酶和胰蛋白酶复合蛋白酶解的作用效果随着胰蛋白酶比例的增大，先增大后减小，并在复合蛋白酶：胰蛋白酶为1:0.5时提取率达到最大，提取率较其他配比高出1%～4%，具体结果如图3所示。

实施例2：复合蛋白酶与胰蛋白酶复合蛋白酶解最佳工艺的筛选

（1）酶解单因素试验

酶解处理：称取10g预先处理好的鸭胸软骨骨粉于250mL烧杯中，调节溶液的pH值，按一定的料液比加入一定浓度的新型复合蛋白酶和胰蛋白酶，于恒温水浴锅中提取一定时间，于沸水浴中灭酶10min，再用四层滤布过滤出酶解液。

①料水比对鸭硫酸软骨素提取的影响

试验结果表明，鸭硫酸软骨素酶解的提取率随着料水比的增大而先增大而减小，并且在1:10的时候达到最大值，但是无论增大或者减小的幅度都很轻微，几乎趋近一致。因此考虑提取率和便于准确、方便操作的前提下，鸭硫酸软骨素酶解的较适宜的料水比是1:10，具体结果如图4所示。

②酶添加量对鸭硫酸软骨素提取的影响

试验结果表明，鸭硫酸软骨素酶解的提取率随着酶添加量在0.5%～1%范围内的增大而显著增加，并且在1%的时候达到最大值，然后随着添加量的增加而减小，但减小幅度很轻微，几乎趋近一致。因此考虑提取率和便于准确、方便称取的前提下，鸭硫酸软骨素酶解的较适宜的酶添加量是1%，结果如图5所示。

③酶解温度对鸭硫酸软骨素提取的影响

试验结果表明，温度对提取鸭硫酸软骨素的影响比较显著。鸭硫酸软骨素酶解的提取率随着酶解温度的升高而显著增加，提取率在50℃的时候达到最大值43.7%，较其它酶解温度高出2%～5%，然后随着酶解温度的继续增加而显著减小，具体结果如图6所示。

④酶解时间对鸭硫酸软骨素提取的影响

试验结果表明，时间对提取鸭硫酸软骨素的影响比较显著。鸭硫酸软骨素酶解的提取率随着酶解时间的增加而显著增加，提取率在6h的时候达到最大值43.43%，较其它酶解时间高出1%～6%，然后随着酶解时间的继续增加而显著减小，具体结果如图7所示。

⑤酶解pH对鸭硫酸软骨素提取的影响

试验结果表明，pH值对提取鸭硫酸软骨素的影响比较显著。鸭硫酸软骨素酶解的提取率随着酶解pH的提高而显著增加，提取率在酶解pH为6.5的时候达到最大值46.29%，较其它酶解pH高出2%～5%，然后随着酶解pH的继续提高而显著减小，具体结果如图8所示。

（2）复合蛋白酶解响应面试验

以酶解温度、酶解时间和酶解pH为自变量，硫酸软骨素提取率为响应值，进行Box-Behnken设计，利用Design Expert7.0软件进行响应面分析，建立回归模型。在单因素试验的基础上，确定最佳工艺。响应面试验方案及结果如下：

表1响应面优化设计试验数据

表2鸭硫酸软骨素提取率方差分析

注：极显著性(α<0.01)；显著(α<0.05)

多元回归分析结果表明，方程一次项及交互项都有显著影响。各试验因子对响应值的影响呈交互影响的线性关系。试验因子对响应值影响可表现为下式：

y=0.45846346-0.013746291X₁-0.011484521X₂-0.006809709X₃+ 0.011184416X₁X₂-0.001385853X₁X₃-0.004845604X₂X₃-0.050722693X₁ ²-0.062029103X₂ ²-0.06681127X₃ ²

从表2可以看出，方程一次项、二次项的影响都是显著的，交互项作用影响不显著，故交互项可以省略，也可以看出各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因素的影响大小，需对其进一步进行多元回归分析，并在α=0.05显著水平剔除回归方程中不显著项后，得到简化后的回归模型：

y=0.45846346-0.013746291X₁-0.011484521X₂-0.006809709X₃+0.011184416X₁X₂-0.050722693X₁ ²-0.062029103X₂ ²-0.06681127X₃ ²

从表2的回归模型方差分析可以看出，该模型回归极显著（P＜0.01），失拟项不显著，该模型R₂=99.25%，R_2Adj=98.29%，说明该模型与试验模拟性良好。自变量与响应值之间的线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可知各因子的贡献率为：X₁＞X₂＞X₃，即酶解温度＞酶解时间＞酶解pH。方程一次项X₁、X₂影响极显著（P＜0.01），X₃影响显著（P＜0.05），二次项X₁ ²、X₂ ²、X₃ ²影响极显著（P＜0.01），其中酶解温度和酶解时间得交互作用显著（P＜0.05）。使用design expert7.0软件处理数据和分析，新型复合蛋白酶和胰蛋白酶复合蛋白酶解的最佳条件：酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为5h～7h，酶解pH为6.0～7.0，试验结果见图9、图10和图11。

本发明的鸭硫酸软骨素的具体制备工艺与技术指标：

胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶、核酸酶按照重量份数比例为1.5：1：0.5：0.5；酶解过程中，鸭胸软骨骨粉、复合蛋白酶和胰蛋白酶按照重量份数比例为100：1：0.5；料水比为1:10，酶添加量为1%，酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为5h～7h，酶解pH为6.0～7.0的条件下，酶解液的提取率为45%～50%，纯度为90%～95%。

实施例3：复合蛋白酶与胰蛋白酶复合蛋白酶解最佳工艺回归试验

按照本发明发明内容中所记载的提取方法，当胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶、核酸酶按照重量份数比例为1.5：1：0.5：0.5；酶解过程中，鸭胸软骨骨粉、复合蛋白酶和胰蛋白酶在溶液中按照重量份数比例为100：1：0.5；酶添加量为1%，酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为5h～7h，酶解pH为6.0～7.0，通过5次验证试验发现，在该条件下所得酶解量依次为45.86%、45.91%、46.05%、46.03%、45.83%，平均提取率为45.94%，纯度为90%～95%，与实施案例2的结果基本一致；上述结果表明本发明的工艺具有很好稳定性。

本发明的复合蛋白酶组方和复合蛋白酶解方法能够使鸭硫酸软骨素得到有效的提取，填补了此领域空白；与其它单酶和双酶酶解相比，酶用量减少50%左右，提取率提高20%左右。大大缩短提取时间，增加了提取率、降低了酶添加量、提高生产效益，使之更加环保高效；此项技术可以广泛应用于鸭硫酸软骨素产品的进一步开发，具有广阔的市场开发前景。

Claims

1.一种用于提取鸭硫酸软骨素的复合蛋白酶，所述的复合蛋白酶由胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶、核酸酶和胰蛋白酶组成；所述的复合酶中胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶的重量份数的比例为1.5：1：0.5：0.5；胰蛋白酶的添加量为胶原蛋白酶、脂肪酶、糖原酶和核酸酶总重量的50%。

2.一种提取鸭硫酸软骨素的方法，包括如下的步骤：

所述的步骤1）中混合有机溶剂是甲醇与氯仿的混合溶液，其中甲醇和氯仿的体积比为1:1～3:1；NaCl溶液的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L；

2）鸭胸软骨骨粉的酶解提取：将处理好的鸭胸软骨骨粉，加入到权利要求1所述的复合蛋白酶水溶液中进行酶解，制成鸭硫酸软骨素酶解液；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中将鸭胸软骨蒸煮，其中蒸煮的温度为60℃～80℃，蒸煮时间0.5h～1h。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中复合蛋白酶水溶液中复合蛋白酶的浓度为0.1%；鸭胸软骨骨粉在复合蛋白酶水溶液中的添加浓度为10%。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中酶解温度为45℃～55℃，酶解时间为5h～7h，酶解pH为6.0～7.0。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤3）中蛋白质沉降剂为三氯乙酸溶液，浓度为3%～7%，与鸭硫酸软骨素酶解液的体积比为1:1。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤4）中乙醇添加比例为1:2～1:4，沉降时间为4h～6h；烘干温度为60℃，时间为30min～40min。