CN109402205B - 一种从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺，包括如下步骤：（1）肝素副产物加热水溶解，再加氯化钠至完全溶解；（2）肝素副产物完全溶解，加入酶试剂A，调pH至8～10，加热，再降至室温，离心，得第一次离心液；（3）向第一次离心液加沉淀剂B，搅拌，进离心，得第二次离心湿固体物；（4）第二次离心湿固体物加热水溶解，再加氯化钠至完全溶解；（5）第二次离心湿固体物完全溶解，加乙醇沉淀，收集沉淀物一；（6）将沉淀物一加水溶解，超滤，得超滤液；（7）向超滤液中加氯化钠溶解，再乙醇，收集沉淀物二；（8）沉淀物二烘干，得到类肝素或蛋白。本发明的优点在于：本发明工艺，能够提高类肝素或蛋白回收率及其效价。
Description
技术领域
本发明涉及一种类肝素的制备工艺，特别涉及一种从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺。
背景技术
类肝素，别名蛋白，是指天然的、合成的和半合成的与肝素有类似作用的物质，类肝素能够与数百种蛋白质相结合，影响蛋白质的空间构象、寿命和生物活性，类肝素还可以和胞外基质中的多种蛋白质相结合，控制它们的分布、转移和信息传递。可见类肝素是一种重要的信息分子，对主体细胞的行为如胞的增殖、分化、结合起调控作用，并参与对外来细胞的识别和控制过程。类肝素产品可作为生产舒洛地特，冠心舒等药物的原料，此类药物因安全有效，受到患者的广泛认同。
从猪小肠粘膜经过离子交换以及分级沉淀生产肝素的过程中产生了大量的废蛋白，这是因为树脂吸附过程中树脂也吸附蛋白，副产物蛋白中除了大量蛋白以外，其余主要成分为硫酸乙酰肝素（类肝素）。但是由于其中的有效物质分离困难，故产生肝素后一般将这些副产物丢弃或存储，造成资源浪费。
针对上述现象，专利CN 105037584 B公开了一种从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，包括如下步骤：1）将肝素副产物
废蛋白制成溶液；2)向溶液中加入吸附剂进行吸附；3）对吸附剂进行洗涤和洗脱，收集洗脱液并进行沉淀，得到沉淀固体一；4）将沉淀固体一制成溶液，之后依次经过调节pH、氧化、调节pH、还原、调节pH、调节盐浓度以及沉淀，得到沉淀固体二；5）将沉淀固体二烘干，得到类肝素。该从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，进行废物利用，节约成本，而且具有工艺简单，成本较低的特点；但该从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，仍存在一定的缺点：1.从副产物废蛋白中回收类肝素的回收率低；2.分离出的类肝素效价相对较低。
因此，研发一种能够提高类肝素回收率及其效价的从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺是非常有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高类肝素回收率及其效价的从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺，其创新点在于：包括如下步骤：
（1）将肝素副产物加95-100℃的热水溶解，然后加入按重量百分比4～6%的分析纯氯化钠至完全溶解；
（2）肝素副产物完全溶解后，加入酶试剂，调节pH到8～10；然后加热至50～60℃，并保温1～3小时，接着升温至95～105℃，最后用循环水降温至室温，降至室温后，第一次离心去除固体杂质，得到第一次离心液；其中，酶试剂是按重量份数由12-16份半胱氨酸、1-3份胰蛋白酶和0.4-0.6份亚硫酸钠制成；
（3）向第一次离心液加入离心液体积的1-2%的沉淀剂，并搅拌25～35min，搅拌后，进行第二次离心，得到第二次离心液和第二次离心湿固体物；其中，所述沉淀剂是按重量份数由1-2份5-磺基水杨酸、20-25份丙酮、55-60份甲醇和15-25份蒸馏水制成；
（4）向第二次离心湿固体物加热水溶解，然后加入重量百分比为14～16%的氯化钠搅拌至完全溶解；
（5）第二次离心湿固体物完全溶解后，加入乙醇沉淀，沉淀11～13小时后，收集沉淀物一；
（6）将沉淀物一加水溶解，溶解后，超滤1～3小时，得超滤液；
（7）向超滤液中加氯化钠溶解，溶解后，再加入乙醇沉淀，沉淀11～13小时后，收集沉淀物二；
（8）将沉淀物二烘干，得到类肝素或蛋白。
进一步地，所述（1）中，肝素副产物与热水的质量比是1:11～13，肝素副产物与分析纯氯化钠的质量比为1:0.6～0.65。
进一步地，所述（2）中的酶试剂与（1）中肝素副产物的质量比为0.035～0.4:1。
进一步地，所述（5）中乙醇选用质量百分浓度为80～90%的乙醇，且乙醇的用量为，以溶解液为1，乙醇与溶解液的比为1.5:1。
进一步地，所述（7）中氯化钠选用质量百分浓度为2～4%的分析纯氯化钠，乙醇选用质量百分浓度为92～98%的乙醇，且乙醇的用量为，以溶解液为1，乙醇与溶解液的比为1.5:1。
本发明的优点在于：本发明从肝素副产物中提取类肝素或蛋白的工艺，以肝素副产物为原料，从肝素副产物中进一步深加工，采用水和氯化钠分级溶解，以及乙醇分级沉淀获得比旋转度为0°～+40°、效价≥50.0 USPU/mg的类肝素或蛋白；且提取工艺中，采用复合酶试剂调节pH和复合沉淀剂沉淀，能够使肝素副产物中类肝素有效分离出来，大大提高类肝素或蛋白的收率，其收率可达30%以上。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例
本实施例从肝素副产物中提取类肝素的工艺，包括如下步骤：
（1）将80kg肝素副产物加1000kg热水溶解，然后加入50kg质量百分比为5%的分析纯氯化钠至完全溶解；
（2）80kg肝素副产物完全溶解后，加入3kg酶试剂，该酶试剂是按重量份数由14份半胱氨酸、2份胰蛋白酶和0.5份亚硫酸钠制成，调节pH到9；然后加热至55℃，并保温2小时，接着升温至100℃，最后用循环水降温至室温，降至室温后，第一次离心去除固体杂质，得到1200kg的第一次离心液；
（3）向第一次离心液加入12kg沉淀剂，该沉淀剂是按重量份数由1.5份5-磺基水杨酸、22.5份丙酮、57.5份甲醇和20份蒸馏水制成，并搅拌30min，搅拌后，进行第二次离心，得到第二次离心液和70kg的湿固体；
（4）向第二次离心湿固体物加100kg热水溶解，然后加入15kg质量百分比为15%的氯化钠搅拌至完全溶解；
（5）第二次离心湿固体物完全溶解后，加入质量百分浓度为85%的乙醇沉淀，乙醇与溶解液的比例为1.5:1，沉淀12小时后，收集60kg湿的沉淀物一；
（6）将沉淀物一加100kg水溶解，溶解后，超滤2小时，得120kg超滤液；
（7）向超滤液中加质量百分浓度为3%的分析纯氯化钠，氯化钠的加入量为超滤液的3%，溶解后，再加入质量百分浓度为95%的乙醇沉淀，沉淀12小时后，收集55kg湿的沉淀物二；
（8）将沉淀物二烘干，得到25.81kg类肝素。
下表为本实施例得到的类肝素的理化结果。
| 项目 | 标准 | 实施例 |
| 效价 | ≥35u/mg | 51 u/mg |
| 吸光度（0.4%260nm） | ＜0.800 | 0.21 |
| 旋转度（4%） | ≥+18° | +25° |
| 干燥失重 | ＜5% | 1.2% |
| 收率 | -- | 32.26% |
由上表可以看出，本发明以肝素副产物为原料，从肝素副产物中进一步深加工，采用水和氯化钠分级溶解，以及乙醇分级沉淀获得比旋转度为0°～+40°、效价＞50.0 USPU/mg的类肝素；且提取工艺中，采用复合酶试剂调节pH和复合沉淀剂沉淀，能够使肝素副产物中类肝素有效分离出来，大大提高类肝素的收率，其收率可达30%以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种从肝素副产物中提取类肝素的工艺，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将肝素副产物加95-100℃的热水溶解，然后加入按重量百分比4～6%的分析纯氯化钠至完全溶解；
（2）肝素副产物完全溶解后，加入酶试剂，调节pH到8～10；然后加热至50～60℃，并保温1～3小时，接着升温至95～105℃，最后用循环水降温至室温，降至室温后，第一次离心去除固体杂质，得到第一次离心液；其中，酶试剂是按重量份数由12-16份半胱氨酸、1-3份胰蛋白酶和0.4-0.6份亚硫酸钠制成；
（3）向第一次离心液加入离心液体积的1-2%的沉淀剂，并搅拌25～35min，搅拌后，进行第二次离心，得到第二次离心液和第二次离心湿固体物；其中，所述沉淀剂是按重量份数由1-2份5-磺基水杨酸、20-25份丙酮、55-60份甲醇和15-25份蒸馏水制成；
（4）向第二次离心湿固体物加热水溶解，然后加入重量百分比为14～16%的氯化钠搅拌至完全溶解；
（5）第二次离心湿固体物完全溶解后，加入乙醇沉淀，沉淀11～13小时后，收集沉淀物一；
（6）将沉淀物一加水溶解，溶解后，超滤1～3小时，得超滤液；
（7）向超滤液中加氯化钠溶解，溶解后，再加入乙醇沉淀，沉淀11～13小时后，收集沉淀物二；
（8）将沉淀物二烘干，得到类肝素。
2.根据权利要求1所述的从肝素副产物中提取类肝素的工艺，其特征在于：所述（1）中，肝素副产物与热水的质量比是1:11～13，肝素副产物与分析纯氯化钠的质量比为1:0.6～0.65。
3.根据权利要求1所述的从肝素副产物中提取类肝素的工艺，其特征在于：所述（2）中的酶试剂与（1）中肝素副产物的质量比为0.035～0.4:1。
4.根据权利要求1所述的从肝素副产物中提取类肝素的工艺，其特征在于：所述（5）中乙醇选用质量百分浓度为80～90%的乙醇，且乙醇的用量为，以溶解液为1，乙醇与溶解液的比为1.5:1。
5.根据权利要求1所述的从肝素副产物中提取类肝素的工艺，其特征在于：所述（7）中氯化钠选用质量百分浓度为2～4%的分析纯氯化钠，乙醇选用质量百分浓度为92～98%的乙醇，且乙醇的用量为，以溶解液为1，乙醇与溶解液的比为1.5:1。
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| 硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的制备及其抗血栓相关活性协同作用研究;薛发刚;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20120415(第04期);第E079-88页 * |
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