CN111909288A - 一种肝素钠的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素钠的精制方法，其特征在于：按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；一次脱色氧化、过滤、一级分级沉淀、二次脱色氧化、过滤、二级分级沉淀，干燥，过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠，脱色氧化时加入EDTA；本发明的有益效果是：2次酶解彻底除去肝素钠内的不同类型蛋白质，分级沉淀分离肝素钠内有关物质使得肝素钠纯度更高，脱色氧化时加入EDTA，很好的解决了过氧化物裂解肝素钠成过低分子肝素的可能，还能够避免工艺条件的变化特别是氧化剂的用量和氧化时间对于产品品质的波动影响，并获得稳定的低分子量区间的肝素钠。
Description
技术领域：
本发明属于肝素钠的制备技术领域，更具体地涉及一种肝素钠的精制方法。
背景技术：
目前国内肝素市场存在各种不同品质的粗品肝素钠，由于地域及生活习惯不同，各地养殖猪的环境及饲料也不同，粗品肝素钠生产工艺不同，造成粗品肝素钠的质量有所区别，比如其性状、蛋白质含量、效价、光吸收等差距都会特别大。目前国内现有技术中，盐解、酶解、树脂分离、氧化、沉淀或者其中几个方法的目标结合，
如专利号为201310009732.2的国家发明专利公开了一种肝素钠的精制方法，吸附除杂与添加酶激活剂进行酶解的联合精制肝素钠的方法，该方法能解决单纯的吸附与酶解难以彻底除杂的问题，且通过酶激活剂的使用，大大缩短了酶解时间，提高了生产效率；但是该方法使用的单一酶解，只能适用于一种质量状况的粗品肝素钠，更换其他质量状况的粗品肝素钠，其工艺指标又不能达到理想的精制效果。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种多工艺结合精制粗品肝素钠的工艺技术方法，能够有效的解决粗品肝素钠精制质量难达标并且收率低的问题：
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化：向步骤(1)中收集的沉淀物，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化：向步骤(4)收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
进一步地，所述的一次脱色工序：向步骤(1)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
所述二次氧化工序：向步骤(4)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0，按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化，氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h。
进一步地，所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度55～65℃再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度40～50℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
进一步地，所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度30～40℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
进一步地，所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度30～40℃，pH7.0～8.0，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
进一步地，所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度35～45℃，pH7.0～8.0，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
进一步地，所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.8～0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物
本发明的有益效果是：
本发明进行了2次酶解，彻底除去肝素钠内的不同类型蛋白质；使用不同盐度的肠衣盐溶液洗涤、洗脱树脂提取肝素钠，去除杂质的同时提高肝素钠的收率；使用分级沉淀分离肝素钠内有关物质(DS、CS)，使得肝素钠纯度更高，最终大幅度提高了肝素钠的产量和质量；
创造性的脱色氧化时加入EDTA，实现优秀氧化效果的同时，很好的解决了过氧化物裂解肝素钠成过低分子肝素的可能，规避了后续工艺，过小分子肝素钠在醇沉工艺中流失导致收率较低的问题，大大提高了成品收率；
脱色氧化时加入EDTA，还能够避免工艺条件的变化特别是氧化剂的用量和氧化时间对于产品品质的波动影响，并获得稳定的低分子量区间的肝素钠。
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
实施例一：
肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化：向步骤(1)中收集的沉淀物，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化：向步骤(4)收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度55～65℃再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度40～50℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度30～40℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度30～40℃，pH7.0～8.0，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度35～45℃，pH7.0～8.0，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.8～0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物。
实施例二：
肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化工序：向步骤(1)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20℃，pH值9.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化工序：向步骤(4)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0，按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3min，其余时间静置氧化，氧化过程中控制料液温度20℃，pH值9.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至8.5，控制料液温度55℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH至8.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度55℃再加入NaOH溶液调节pH至8.5，控制料液温度55℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH至8.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度40℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度30℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度30℃，pH7.0，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度35℃，pH7.0，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度35℃，加入洗脱液体积0.8倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度35℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
实施例三：
肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化工序：向步骤(1)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度30℃，pH值11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度40℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化工序：向步骤(4)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至11.0，按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3min，其余时间静置氧化，氧化过程中控制料液温度30℃，pH值11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度40℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
进一步地，所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至10.5，控制料液温度65℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度65℃再加入NaOH溶液调节pH至10.5，控制料液温度65℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度50℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度40℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度40℃，pH8.0，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度45℃，pH8.0，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度40℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度40℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
实施例四：
肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化工序：向步骤(1)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度25℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至10.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液4min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度25℃，pH值10.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度38℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温38℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化工序：向步骤(4)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度25℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至10.0，按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液4min，其余时间静置氧化，氧化过程中控制料液温度25℃，pH值10.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度38℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温38℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至9.0，控制料液温度60℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.5，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至90℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度60℃再加入NaOH溶液调节pH至9.5，控制料液温度60℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.5，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至90℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度45℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度35℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度35℃，pH7.5，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度40℃，pH7.5，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度38℃，加入洗脱液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温38℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度38℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温38℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物。
为了更加直观的展现本发明的双酶解工艺优势，特以本发明采用双酶解2次除蛋白法和相同工艺采用现有技术以援引的方式将专利号为201310009732.2公开的以胰酶采用单酶法酶解的方法，并相应调整最适pH反应后，进行对比，并依据《中国药典2015》中关于肝素钠中蛋白含量的检测方法和检测指标进行检测，结果如下：
表1：双酶解工艺对照试验数据
| 酶1 | 酶2 | 蛋白质含量 | |
| 实施例2 | 2709碱性蛋白酶 | 水解蛋白酶 | 0.27％ |
| 对比例1 | 胰酶 | 无 | 0.39％ |
根据表1数据分析可知：
双酶解比单一胰酶酶解除去粗品肝素钠内的蛋白质效果更好，彻底除去肝素钠内的不同类型蛋白质,有利于成品蛋白质控制。
为了更加直观的展现本发明的分级沉淀工艺优势，特以本发明采用不同浓度乙醇进行分级沉淀和相同工艺采用一级沉淀的方法进行对比，并依据《中国药典2015》中关于肝素钠中纯度和收率的检测方法和检测指标进行检测，结果如下：
表2：分级沉淀工艺对照试验数据
| 一级沉淀的乙醇浓度 | 二级沉淀的乙醇浓度 | 有关物质 | 抗IIa | 收率 | |
| 实施例2 | 0.88倍的药用乙醇 | 0.85倍的药用乙醇 | 0.05％ | 220 | 99％ |
| 对比例2 | 0.88倍的药用乙醇 | 无 | 0.81％ | 210 | 92％ |
根据表2数据分析可知：
分级沉淀去除了肝素钠内有关物质，提高了肝素成品抗IIa单位，成品收率显著提高，有利于工厂经济效益。
为了更加直观的展现本发明的EDTA工艺优势，特以本发明采用在脱色氧化工序时添加双氧水的同时添加EDTA和相同工艺采用脱色氧化工序时仅仅添加双氧水进行对比，并依据《中国药典2015》中关于肝素钠中核酸、收率和分子量与分子量区间分布的检测方法和检测指标进行检测，结果如下：
表3：脱色氧化工艺对照试验数据
| 脱色氧化 | EDTA | 核酸(260) | 重均分子量： | 收率 | |
| 实施例1 | 双氧水 | 无 | 0.510 | 15300 | 91％ |
| 实施例2 | 双氧水 | 有 | 0.453 | 17800 | 99％ |
根据表3数据分析可知：
脱色氧化时加入EDTA，实现优秀氧化效果的同时，很好的解决了过氧化物裂解肝素钠成过低分子肝素的可能，规避了后续工艺，过小分子肝素钠在醇沉工艺中流失导致收率较低的问题，大大提高了成品收率。
为了更加直观的展现本发明的EDTA工艺优势，通过延长氧化时间和加大氧化剂的用量作为对照变量，并依据《中国药典2015》中关于肝素钠中核酸、收率和分子量与分子量区间分布的检测方法和检测指标进行检测，结果如下：
表4：不同条件下EDTA脱色氧化工艺对照试验数据
根据表4数据分析可知：各组重均分子量基本满足《中国药典2015》中关于肝素钠中重均分子量15000-19000的指标要求，
但是，由实施例1、实施例2、对比例3和对比例5对比，当通过延长氧化时间和加大氧化剂的用量时，没有添加EDTA的对照组，肝素钠的重均分子量与标准中的重均分子量相比虽然能够满足要求，均位于15000的临界值，产品品质不稳定，工艺条件控制不准确极易产生不合格的产品；而且分子量区间间值较大，产品易受到工艺条件的影响，不同批次的产品出现了质量的波动，产品的平均分子量和收率受到工艺条件的影响较大，产品品质产生波动；
由实施例2、对比例4和对比例6可知，当通过延长氧化时间和加大氧化剂的用量时，产品的平均分子量和收率影响较小，产品品质较为稳定，分子量区间基本维持在17550-17950之间，不会随着延长氧化时间和加大氧化剂的用量变化；
因此，脱色氧化时加入EDTA，能够避免工艺条件的变化特别是氧化剂的用量和氧化时间对于产品品质的影响，并获得稳定的低分子量区间的肝素钠，
综上所述：本发明进行了2次酶解彻底除去肝素钠内的不同类型蛋白质；使用不同盐度的肠衣盐溶液洗涤、洗脱树脂提取肝素钠，去除杂质的同时提高肝素钠的收率；使用分级沉淀分离肝素钠内有关物质(DS、CS)，使得肝素钠纯度更高，最终大幅度提高了肝素钠的产量和质量；
创造性的脱色氧化时加入EDTA，实现优秀氧化效果的同时，很好的解决了过氧化物裂解肝素钠成过低分子肝素的可能，规避了后续工艺，过小分子肝素钠在醇沉工艺中流失导致收率较低的问题，大大提高了成品收率；
脱色氧化时加入EDTA，还能够避免工艺条件的变化特别是氧化剂的用量和氧化时间对于产品品质的波动影响，并获得稳定的低分子量区间的肝素钠。
Claims (7)
1.一种肝素钠的精制方法，其特征在于：
(1)按酶解工序、离子交换吸附工序、洗涤工序、洗脱工序、沉淀工序得到肝素钠粗品沉淀物；
(2)一次脱色氧化：向步骤(1)中收集的沉淀物，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(3)过滤：一次脱色氧化结束，使用0.8μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(4)一级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.88倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(5)二次脱色氧化：向步骤(4)收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
(6)过滤：二次脱色氧化结束，使用0.45μm滤膜进行过滤，收集滤液；
(7)二级分级沉淀：收集滤液，控制滤液温度35～40℃，加入滤液体积0.85倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h；沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
(8)把二级分级沉淀得到沉淀物加入4L/亿单位纯化水，经0.22聚醚砜滤芯过滤；
(9)干燥：过滤后的滤液经真空冷冻干燥，得到精品肝素钠。
2.根据权利要求1所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述的一次脱色氧化工序：向步骤(1)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1：6的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0；按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化；氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h；
所述二次脱色氧化工序：向步骤(4)中收集的沉淀物按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:5的配比加水溶解，控制料液温度20～30℃，按粗品肝素钠重量的0.5％还加入EDTA，再加入NaOH溶液调节pH至9.0～11.0，按照加入水的体积2％的量，量取双氧水体积，并向双氧水中体积加入双氧水体积3倍的水混匀，均分成三份，每隔一小时，向料液中加入一份双氧水溶液，每次加入均搅拌料液3～5min，其余时间静置氧化，氧化过程中控制料液温度20～30℃，pH值9.0～11.0，以第一次加入双氧水溶液的时间开始计时，共氧化12h。
3.根据权利要求2所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述的酶解工序为双酶解2次除蛋白包括：
Ⅰ：配制10％浓度的2709碱性蛋白酶溶液：按水与粗品肝素钠重量比为10:1的配比向粗品肝素钠中加入水混合均匀，按水与肠衣盐重量比为100:3的配比向上述料液中加入肠衣盐混合均匀，再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃，
Ⅱ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入步骤Ⅰ配置的酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤；滤液控制料液温度55～65℃再加入NaOH溶液调节pH至8.5～10.5，控制料液温度55～65℃；
Ⅲ：按酶与粗品肝素钠重量比为1:100的配比加入10％浓度的水解蛋白酶溶液，开始酶解3h；酶解完成，调节料液pH8.0～9.0，按粗品肝素钠与无水氯化钙重量比为10:3的配比向料液中加入无水氯化钙混合均匀，快速升温至85～95℃，保温15min；保温完成，趁热过滤，滤液控制料液温度40～50℃，加入与无水氯化钙重量相同的无水碳酸钠，搅拌反应15min，过滤。
4.根据权利要求2所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述离子交换吸附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与水体积(单位：L)比值为1:8的配比向沉淀物中加水，将沉淀物完全溶解，按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与树脂体积(单位：L)比值为1:8配比向沉淀物中加入树脂，其中所用树脂为碱性阴离子树脂A98，控制体系温度30～40℃，搅拌吸附4h，吸附完毕，去除不吸附的残留液体。
5.根据权利要求2所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述洗涤工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与5％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向树脂中加入5％肠衣盐溶液，控制温度30～40℃，pH7.0～8.0，搅拌洗涤2h，洗涤完成去除洗涤液，再重复此步骤2次。
6.根据权利要求2所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述脱附工序：按粗品肝素钠活性(单位：亿IU)与12％肠衣盐溶液体积(单位：L)比值为1:8的配比向洗涤工序处理的树脂中加入12％肠衣盐溶液，控制温度35～45℃，pH7.0～8.0，洗脱4.5h，收集得到第一次洗脱液，再重复此步骤1次得到第二次的洗脱液。
7.根据权利要求2所述的肝素钠的制备方法，其特征在于所述沉淀工序：将脱附工序中收集的第一次洗脱液，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.8～0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物；
再将脱附工序中收集的第二次的洗脱液加入沉淀物中，搅拌溶解，控制洗脱液温度35～40℃，加入洗脱液体积0.9倍的药用乙醇，搅拌均匀，保温35～40℃沉淀4h，沉淀结束，去除上清收集沉淀物。
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Denomination of invention: A refining method of heparin sodium Effective date of registration: 20220630 Granted publication date: 20210903 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Jining urban sub branch Pledgor: SHANDONG CHENLONG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980009589 |