CN108264582A - 一种制备硫酸软骨素的新工艺 - Google Patents

一种制备硫酸软骨素的新工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备硫酸软骨素的新工艺，其目的在于提供一种工艺简单、CS回收得率高、所得CS成品纯度高、后处理分离便捷且便于回收蛋白副产的新工艺。本发明的主要方案是在核心蛋白水解方案中在酶解体系加入了一定数量的醇酮类极性溶剂，并引入了均匀剂。基于本发明的技术方案，酶解反应转化率高、转化效率快并且所得CS产物具有高纯特征；酶解反应之后对酶解液的后续处理可以简单便捷地实现，尤其是超滤处理的作业效率可以大为提高，且获得更好的分质效果；一方面通过浓缩液体系得到高质量的CS产品，同是也可以通过透过液体系回收得到质量好的副产蛋白产品；工艺路线中不需要进行传统的氧化、除杂操作，整体工艺的反应条件温和，操作规程简便易行。

Description

一种制备硫酸软骨素的新工艺
技术领域
本发明涉及一种制备硫酸软骨素的新工艺，属于生物化工技术领域。
背景技术
硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（又称N-乙酰氨基半乳糖）二糖单位组成，通过一个似糖链街区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。文献报导的CS 生产工艺种类繁多，主要包括动物软骨提取、微生物发酵和化学合成等方法。就工业生产的角度来看，以动物软骨为原料提取 CS 仍是目前最经济有效的方法。按照该方法，常用的动物软骨有猪、牛、禽类及鲨鱼的透明软骨等等。尽管动物软骨原料有所不同，所报导的生产工艺也略有差别，但是其本质是相同的，即将 CS 从软骨中提取出来并进行纯化。一般而言，各个厂家的生产工艺都是基于以下几个步骤：软骨的降解、核心蛋白的水解、去除蛋白并回收CS、CS 的纯化；其中：“核心蛋白的水解”是整个工艺中最重要的一个技术环节，其直接决定了CS收率和产品质量。
中国 CS 年产量占世界产量的80%以上，是世界上最大的CS 生产国和出口国；但是我国 CS 生产企业普遍资质不高，产品品质也较低，以出口为主的产业现状更使我们在市场中处于被动地位。对此，近些年来国内主要的S生产企业都在不断研发改进生产工艺，旨在开发高产量、高效率的生产过程，提高CS产品纯度和综合质量指标，使经济效益最大化。
文献所采用的CS提取方法主要有浓碱提取工艺、稀碱提取工艺、稀碱稀盐提取工艺及稀碱浓盐提取工艺。以上工艺中，浓碱提取工艺产品颜色较深，且废碱液对环境的危害较大；稀碱提取工艺蛋白质含量和氮含量较高，生产周期较长；稀碱稀盐和稀碱浓盐提取工艺，产率和纯度都不高。综合考虑产率和纯度的考虑，目前各个CS生产企业所采用的主流生产工艺一般都是“稀碱一酶解提取工艺”。其工艺路线一般是如下方案：先在稀碱条件下进行碱解，然后用胰脏(胰酶)和碱性蛋白酶进行酶解；或者是先在稀碱条件下添加一定量的碱性蛋白酶进行水解，然后利用胰脏(胰酶)或者专用的胰蛋白酶进行酶解；通过上述两种方案最终使硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来。
目前，稀碱-酶解提取工艺在产业实践中主要存在如下几点不足：（1）产品纯度不高，粗品中所残留的多肽、蛋白质、核酸及有机溶剂会给后续的纯化处理带来很大困难，并严重影响CS产品的综合质量指标和成品得率；（2）生产周期过长，一方面是水解（酶解）环节的转化速度和效率不够，CS转换得率和水解转化效率两者之间存在着冲突；另一方面是在水解液（酶解液）基础上一系列的后续处理（包括：醇沉、过滤、超滤、氧化除杂等）存在各种工艺性难点，并且需要消耗大量作业时间；（3）在规模化生产时，由于分质不清的固有缺陷以及体系粘稠等原因，蛋白副产品的回收加工难度大。
因此需要针对目前的生产工艺进行改进，寻找一种不仅易于转化效率高、生产周期短、后处理环节分离便捷，而且成品收率高、产品纯度高的硫酸软骨素的新工艺。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题，提供一种工艺简单、CS回收得率高、所得CS成品纯度高、后处理分离便捷且便于回收蛋白副产的新工艺。
一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于其由如下步骤来实现：
（1）水煮蒸煮： 软骨原料加水浸没，升温至80-100℃ 进行水煮，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；将步骤水煮后软骨放入釜中进行蒸煮，上层油脂收集外售；
（2）两级酶解：将步骤（1）所得软骨和纯水以 1:0.5-1:2 的比例混合；按照软骨重量0.30-0.60% 的比例加入一级水解酶，按照纯水重量的3-20%加入均匀剂，按照纯水体积的10-60%加入醇酮类极性溶剂，于 20-60℃，pH8.0-10.0条件下酶解反应1.0-2.0h；再按照软骨重量0.30-0.60%的比例加入二级水解酶，于25-70℃，pH8.0-11.0条件下酶解反应1.5-2.5h；
（3）过滤和超滤：将步骤（2）所得酶解液调节pH6.0-8.0后进行过滤，收集滤液，对滤渣进行1-2次水洗，合并水洗液与滤液再进行超滤膜过滤，超滤后分成浓缩液和透过液；
（4）CS的提取：在步骤（3）所得浓缩液中加入醇酮类极性溶液，使得醇酮类极性溶剂的终浓度含量达到60%wt以上，沉降后离心收集沉降物，经真空干燥得到硫酸软骨素成品；
（5）副产蛋白的回收：将步骤（3）所得透过液进行蒸发浓缩和喷雾干燥得到副产蛋白；
所述一级水解酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、猕猴桃蛋白酶中的一种或几种的混合物；
所述二级水解酶为胰蛋白酶或者其与脂肪酶、胶原蛋白酶、糖原酶、核酸酶中一种或几种的混合物；
所述醇酮类极性溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮中的一种或几种的混合物；
所述均匀剂为包括下述物质中的一种或多种的混合物：
a、PEG200～10000、丙烯酸类聚合物表面活性剂、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚；
b、聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇双油酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇双硬脂酸酯；
c、粘度调节剂，该粘度调节剂的主要成分为含多羟基的聚丙烯酸酯。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（2）中一级水解酶优选为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合物，其质量比例为1：0.5-1：2，其加入量为软骨重量的0.40-0.50%；步骤（2）中二级水解酶优选为胰蛋白酶和胰脂肪酶的混合物，其质量比例为1：0.5-1：2，其加入量为软骨重量的0.40-0.50%。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（2）中醇酮类极性溶剂优选为乙醇，其加入量为纯水体积的20-30%。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（3）对酶解液进行过滤之前，在酶解液中加入0.5-3.0%wt的NaCl，并静置0.5-1小时。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（3）中滤渣进行水洗后对滤渣加以收集，作为骨粉外售用于动物饲料。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（4）在浓缩液中加入醇酮类极性溶液之前对浓缩液进行过滤，收集滤液，对滤渣进行1-2次水洗，合并水洗液与滤液，并将该滤渣与步骤（3）中的滤渣进行合并。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（4）在浓缩液中加入醇酮类极性溶液，使得醇酮类极性溶剂的终浓度含量达到70%-150%wt。
本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（5）在透过液中进行蒸发浓缩前先通过纳滤膜进行浓缩提纯。
本发明的技术原理在于：
1、本发明的核心蛋白水解方案中在酶解体系加入了一定数量的醇酮类极性溶剂，由于醇酮类极性溶剂加入后，酶解所得的CS产物在体系中的溶解度就会明显下降，从而促进酶解反应不可逆地向生成CS的方向进行，达到促进水解效率、缩短水解时间、提高水解转化率和CS产品得率的目的；另一方面，由于醇酮类极性溶剂的加入，蛋白质组份在体系中的溶解性会明显提高，有利于超滤环节的蛋白透过，大大缩短超滤-透析的作业时间，并对去除水解产品CS链上的残留肽和无硫酸角质素（KS），有利于明显提升CS产品的纯度和质量指标。
2、本发明的核心蛋白水解方案中在酶解体系中在加入醇酮类极性溶剂的同时引入了均匀剂，其功效有三：（1）均匀剂的使用因其特有的界面活性上可以大大提高酶解反应的速度，并降低体系的粘稠度，有利于后续过滤和超滤作业的顺利实施；（2）由于体系中醇酮类极性溶剂达到一定浓度的情况下，随着酶解反应的进行和CS产物的增多，因为反应体系对CS产物的溶解度原因，部分的CS产物将以小颗粒析出并分散于体系之中从而导致体系呈浆状，在体系中均匀剂的使用可以分散浆料体系的团聚性，同时提高浆料体系的悬浮性，同时避免CS产物因包裹蛋白、多肽等物质从而给后续纯化带来严重的不利影响和极大地影响产品品质的不利情形；（3）均匀剂的使用对CS分子在体系中的稳定性具有增效的有益作用。
本发明与现有技术相比，其优点在于：
1、基于本发明的技术方案，酶解反应转化率高、转化效率快并且所得CS产物具有高纯特征。
2、基于本发明的技术方案，酶解反应之后对酶解液的后续处理可以简单便捷地实现，尤其是超滤处理的作业效率可以大为提高，且获得更好的分质效果；一方面通过浓缩液体系得到高质量的CS产品，同是也可以通过透过液体系回收得到质量好的副产蛋白产品。
3、基于本发明的技术方案，工艺路线中不需要进行传统的氧化、除杂操作，整体工艺的反应条件温和，操作规程简便易行。
具体实施案例
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1：
将猪喉软骨原料加水浸没，升温至90℃ 进行水煮5小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；将步骤水煮后软骨放入100℃的反应釜中进行蒸煮1小时，上层油脂收集外售。
将上述所得软骨和纯水以 1:1 的比例混合；按照软骨重量0.40% 的比例加入包含了碱性水解酶和木瓜水解酶的混合酶（混合酶中两者重量比例为1：1），按照纯水重量的5%加入平平加O-25和OP-10的混合物（混合物中两者重量比例为1：1），按照纯水体积的25%加入质量分数为96%的乙醇，于 48℃，pH9.5的条件下酶解反应1.5h；再按照软骨重量0.45%的比例加入包含了胰蛋白酶和胰脂肪酶的混合酶（混合物中两者重量比例为8：2），于55℃，pH10.0的条件下酶解反应2h。（本步骤中pH值的调节均采用添加NaOH溶液的方式）
将上述所得酶解液用盐酸调节到pH6.5，在体系中加入1.0%wt的NaCl，静置30分钟后进行过滤，收集滤液，对滤渣用1：2体积的温度40℃纯水洗涤两次，合并水洗液与滤液；滤渣直接作为骨渣外售用于动物饲料。
对上述料液进行超滤膜过滤，其工艺条件为：压力0.2Mpa，孔径0.1微米，截留分子量为10K，温度为室温（将室温低于18℃时间，则调节温度到30℃），经超滤膜装置后料液被分成浓缩液和透过液两个部分，分别加以收集。
将上述所得浓缩液过滤到澄清，收集滤液，对滤渣用1：2体积的温度40℃纯水洗涤两次，合并水洗液与滤液；并将该滤渣与前述的过滤滤渣合并作为骨渣外售用于动物饲料。在过滤澄清后的滤液中加入质量分数为96%的乙醇，使得乙醇的终浓度含量达到80%wt，静置沉降1.5小时后离心，收集沉降物，经真空干燥（工艺条件：烘干温度控制在80-85℃，保温烘干6h）得到硫酸软骨素成品。
将前述所得透过液通过进行纳滤膜过滤进行浓缩提纯，将纳滤提纯产生的浓缩液通过双效蒸发器进行真空浓缩（温度控制在在80-85℃）得到蛋白半成品，再通过喷雾干燥器进行喷雾干燥（干燥温度约为160℃左右）得到副产蛋白粉。
经分析检测，CS产品总得率为24.4%，CS产品中硫酸软骨素质量分数99.1%、蛋白质质量分数0.13%（以折干计，成品中另有含水质量分数为3.72%）、酸碱度为6.6。
与传统的工艺相比（以猪猴软骨为原料），其生产周期一般需要72-100小时（不包括蛋白回收环节），而本实施例在产业实践中的生产周期仅仅为40小时（包括蛋白回收环节）。另一方面，传统工艺的CS产品得率一般在13-16%之间，而本实施例CS产品的总得率可以达到24.4%；传统工艺的CS产品质量分数一般多在80-85%之间，而本实施例CS产品的CS质量分数达到99.1%的高纯水平。
实施例2：
将鸡胸软骨原料加水浸没，升温至90℃ 进行水煮4小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；将步骤水煮后软骨放入100℃的反应釜中进行蒸煮40分钟，上层油脂收集外售。
将上述所得软骨和纯水以1:1 的比例混合；按照软骨重量0.45% 的比例加入包含了碱性水解酶和木瓜水解酶的混合酶（混合酶中两者重量比例为1：1），按照纯水重量的6%加入PEG2000和OP-10的混合物（混合物中两者重量比例为1：1），按照纯水体积的27%加入质量分数为96%的乙醇，于 50℃，pH9.5的条件下酶解反应1.5h；再按照软骨重量0.40%的比例加入包含了胰蛋白酶和胰脂肪酶的混合酶（混合物中两者重量比例为8：2），于55℃，pH10.0的条件下酶解反应2h。（本步骤中pH值的调节均采用添加NaOH溶液的方式）
将上述所得酶解液用盐酸调节到pH6.5，在体系中加入1.0%wt的NaCl，静置30分钟后进行过滤，收集滤液，对滤渣用1：2体积的温度40℃纯水洗涤两次，合并水洗液与滤液；滤渣直接作为骨渣外售作为动物饲料。
对上述料液进行超滤膜过滤，其工艺条件为：压力0.2Mpa，孔径0.1微米，截留分子量为10K，温度为室温（将室温低于18℃时间，则调节温度到30℃），经超滤膜装置后料液被分成浓缩液和透过液两个部分，分别加以收集。
将上述所得浓缩液过滤到澄清，收集滤液，对滤渣用1：2体积的温度40℃纯水洗涤两次，合并水洗液与滤液；并将该滤渣与前述的过滤滤渣合并作为骨渣外售用于动物饲料。在过滤澄清后的滤液中加入质量分数为96%的乙醇，使得体系中乙醇的终浓度含量达到83%wt，静置沉降1.5小时后离心，收集沉降物，经真空干燥（工艺条件：烘干温度控制在80-85℃，保温烘干6h）得到硫酸软骨素成品。
将前述所得透过液通过进行纳滤膜过滤进行浓缩提纯，将纳滤提纯产生的浓缩液通过双效蒸发器进行真空浓缩（温度控制在在80-85℃）得到蛋白半成品，再通过喷雾干燥器进行喷雾干燥（干燥温度约为160℃左右）得到副产蛋白粉。
经分析检测，CS产品总得率为24.7%，CS产品中硫酸软骨素质量分数99.0%、蛋白质质量分数0.14%（以折干计，成品中另有含水质量分数为3.65%）、酸碱度为6.5。
与传统的工艺相比（以鸡胸软骨为原料），其生产周期一般需要72-110小时（不包括蛋白回收环节），而本实施例在产业实践中的生产周期仅仅为42小时（包括蛋白回收环节）。另一方面，传统工艺的CS产品得率一般在14-19%之间，而本实施例CS产品的总得率达到24.7%；传统工艺的CS产品质量分数一般多在80%左右，而本实施例CS产品中CS质量分数达到99.0%的高纯水平。

Claims (8)

1.一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于其由如下步骤来实现：
（1）水煮蒸煮： 软骨原料加水浸没，升温至80-100℃ 进行水煮，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；将步骤水煮后软骨放入釜中进行蒸煮，上层油脂收集外售；
（2）两级酶解：将步骤（1）所得软骨和纯水以 1:0.5-1:2 的比例混合；按照软骨重量0.30-0.60% 的比例加入一级水解酶，按照纯水重量的3-20%加入均匀剂，按照纯水体积的10-60%加入醇酮类极性溶剂，于 20-60℃，pH8.0-10.0条件下酶解反应1.0-2.0h；再按照软骨重量0.30-0.60%的比例加入二级水解酶，于25-70℃，pH8.0-11.0条件下酶解反应1.5-2.5h；
（3）过滤和超滤：将步骤（2）所得酶解液调节pH6.0-8.0后进行过滤，收集滤液，对滤渣进行1-2次水洗，合并水洗液与滤液再进行超滤膜过滤，超滤后分成浓缩液和透过液；
（4）CS的提取：在步骤（3）所得浓缩液中加入醇酮类极性溶液，使得醇酮类极性溶剂的终浓度含量达到60%wt以上，沉降后离心收集沉降物，经真空干燥得到硫酸软骨素成品；
（5）副产蛋白的回收：将步骤（3）所得透过液进行蒸发浓缩和喷雾干燥得到副产蛋白；
所述一级水解酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、猕猴桃蛋白酶中的一种或几种的混合物；
所述二级水解酶为胰蛋白酶或者其与脂肪酶、胶原蛋白酶、糖原酶、核酸酶中一种或几种的混合物；
所述醇酮类极性溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮中的一种或几种的混合物；
所述均匀剂为包括下述物质中的一种或多种的混合物：
a、PEG200～10000、丙烯酸类聚合物表面活性剂、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚；
b、聚乙二醇单油酸酯、聚乙二醇双油酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇双硬脂酸酯；
c、粘度调节剂，该粘度调节剂的主要成分为含多羟基的聚丙烯酸酯。
2.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（2）中一级水解酶优选为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合物，其质量比例为1：0.5-1：2，其加入量为软骨重量的0.40-0.50%；步骤（2）中二级水解酶优选为胰蛋白酶和胰脂肪酶的混合物，其质量比例为1：0.5-1：2，其加入量为软骨重量的0.40-0.50%。
3.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（2）中醇酮类极性溶剂优选为乙醇，其加入量为纯水体积的20-30%。
4.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（3）对酶解液进行过滤之前，在酶解液中加入0.5-3.0%wt的NaCl，并静置0.5-1小时。
5.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（3）中滤渣进行水洗后对滤渣加以收集，作为骨粉外售用于动物饲料。
6.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（4）在浓缩液中加入醇酮类极性溶液之前对浓缩液进行过滤，收集滤液，对滤渣进行1-2次水洗，合并水洗液与滤液，并将该滤渣与步骤（3）中的滤渣进行合并。
7.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（4）在浓缩液中加入醇酮类极性溶液，使得醇酮类极性溶剂的终浓度含量达到70%-150%wt。
8.本发明所述一种制备硫酸软骨素的新工艺，其特征在于所述步骤（5）在透过液中进行蒸发浓缩前先通过纳滤膜进行浓缩提纯。
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