CN1422283A - K5多糖衍生的具有高抗凝和抗血栓形成活性的葡糖胺聚糖及其制备方法 - Google Patents

K5多糖衍生的具有高抗凝和抗血栓形成活性的葡糖胺聚糖及其制备方法 Download PDF

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Abstract

通过以下步骤制得的具有高抗凝和抗血栓形成活性的K5多糖的葡糖胺聚糖衍生物：从大肠杆菌中制备K5多糖，N－去乙酰化/N－硫酸化，C－5差向异构化，过硫酸化，选择性O－脱硫酸化，选择性6－O－硫酸化和N－硫酸化，其中在特定的二价阳离子存在下，采用溶液或固定化形式的葡糖醛酰基C－5表异构酶进行所述差向异构化。

Description

K5多糖衍生的具有高抗凝和抗血栓 形成活性的葡糖胺聚糖及其制备方法
                      先有技术
葡糖胺聚糖是工业上从各种动物器官(例如肠粘膜、肺等)中提取出来的生物聚合物。
根据其结构，葡糖胺聚糖可分为肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸(ialuronic acid)。尤其是肝素和硫酸类肝素，它们由包含糖醛酸(L-艾杜糖醛酸或D-葡糖醛酸)和氨基糖(葡糖胺)的重复二糖单元所构成。
糖醛酸可在2-位进行硫酸化，而葡糖胺最容易N-乙酰化(硫酸类肝素)或N-硫酸化(肝素)和6-O-硫酸化。此外，葡糖胺还在3-位包含硫酸根基团。
肝素和硫酸类肝素是分子量呈多分散性(MW为3000-30,000D)的分子。
除了具有已知的抗凝和抗血栓形成活性之外，还发现了肝素具有抗高血酯、抗增殖、抗病毒、抗肿瘤和抗血管生成(angiogenetic)活性。为了最大限度地满足这些新治疗领域对原材料的需求，需要开发出用以替代动物组织提取物的新生产方法。有关哺乳动物中天然生物合成的肝素及其特性的描述，可参见Lindhal等，Lane D.和LindahlU.(编辑)“肝素的化学和生物学特性；临床应用”，Edward Arnold，伦敦，159-190页，和Lindahl U.Feingold D.S.和RodénL.(1986)TIBS，11，221-225(1986)。
肝素活性的基本原理在于由戊糖区域构成的序列可与抗凝血酶III(ATIII)结合，这种所谓的“活性戊糖”的结构是肝素对ATIII高亲合力结合所需要的。该序列包含在3-位硫酸化的葡糖胺的唯一单元，而在肝素链的其他部位却没有该单元。除了通过ATIII来表现出活性以外，肝素还可通过激活肝素辅因子II(HCII)而表现出抗凝和抗血栓形成活性，其中HCII对凝血酶具有选择性抑制作用。众所周知，激活HCI I所需的最小糖序列是包含至少24单糖的链(Tollefsen D.M.，血栓形成和止血学术讨论会，16，66-70(1990))。
从以前的研究中可以得知，从大肠杆菌菌株中分离出来的K5荚膜多糖(Vann W.F.，Schmidt M.A.，Jann B.，Jann K.Eur.J.Biochem116，359-364(1981))，具有与肝素和硫酸类肝素(N-乙酰基肝素糖)前体一样的序列。该化合物已被进行化学修饰(Lormeau等，US5,550,116和Casu等(Carb.Res 263-1994-271-284))，或者已被化学和酶促修饰(Jann等，WO 92/17509和Casu等，Carb.Letters1，107-114(1994))。这些修饰虽可使产物在体外试验中产生凝结生物活性，但是其作用水平不及从动物器官中提取的肝素。
                      发明概述
我们发现了由来源于大肠杆菌的K5多糖所衍生的新颖葡糖胺聚糖，其分子量为2000-30,000D，包含25-50％重量具有高ATIII亲合力的链，其高抗凝和抗血栓形成活性以HCII/抗Xa活性来表示(该比值为1.5-4)，对凝血酶表现出广泛的(prevalence)抑制活性。
采用包括化学和酶促处理的几个步骤，即可制得上述葡糖胺聚糖，该方法的特征在于：在特定二价阳离子的存在下，采用溶液或固定化形式的葡糖醛酰基C-5表异构酶，将D-葡糖醛酸经差向异构化转化成L-艾杜糖醛酸，所述酶选自重组葡糖醛酰基C-5表异构酶、来源于鼠肥大细胞瘤的葡糖醛酰基C-5表异构酶和来源于牛肝提取物的葡糖醛酰基C-5表异构酶，所述二价阳离子选自Ba、Ca、Mg和Mn。
                       发明详述
本发明涉及由来源于大肠杆菌的K5多糖(以下简称为K5)所衍生的葡糖胺聚糖，通过包括以下步骤的方法制得：
a)由大肠杆菌制备K5多糖
b)N-去乙酰化/N-硫酸化
c)C-5差向异构化
d)过硫酸化(Supersulfation)
e)选择性O-脱硫酸化
f)(任选)选择性6-O-硫酸化
g)N-硫酸化
下面将对上述步骤作详细描述。a)由大肠杆菌制备K5多糖
按照专利M199A001465，采用以下介质，首先在锥形瓶中进行发酵：
脱脂大豆粉                      2gr/l
K2HPO4                        9.7gr/l
KH2PO4                        2gr/l
MgCl2                          0.11gr/l
枸橼酸钠                        0.5gr/l
硫酸铵                          1gr/l
葡萄糖                          2gr/l
泉水                            1000ml
pH＝7.3
介质于120℃灭菌20分钟。
葡萄糖单独制成溶液形式并于120℃灭菌30分钟，然后采用无菌操作加入到介质中。
锥形瓶中接入大肠杆菌E.Coli Bi 8337/41细胞(010：K5：H4)悬浮液(取自Triptic大豆琼脂斜面)，并在控制搅拌下(160rpm，6cm转(run))于37℃保温24小时。用显微镜计数细胞，测定细菌的生长。
在接下来的操作中，将0.1％上述锥形瓶中的培养物接入包含同样介质的Chemap-Braun发酵罐(14升)中，在1vvm(vvm＝空气体积/液体体积/分钟)换气、400-rpm搅拌和37℃下发酵18小时。在发酵过程中，测量pH、氧、剩余的葡萄糖、制得的K5多糖和细菌生长。
在发酵结束时，温度调至80℃放置10分钟。介质经离心(10,000rpm)分离出细胞，采用配有PES膜(标示分子量截流为800和10,000D)的SS 316模块(module)(MST)对上清液进行超滤，将体积降至1/5。然后，4℃下加入4体积丙酮对K5多糖进行沉淀，沉淀于4℃过夜放置，最后经10,000rpm离心20分钟或过滤回收。
然后，于37℃，在0.1M NaCl缓冲液和0.15M EDTA(pH8，包含0.5％SDS(10mg/l滤液))中，采用来源于米曲霉(AspergillusOrizae)的II型蛋白酶，对所得固体进行脱蛋白处理90分钟。
所得溶液用配有膜(标示分子量截流为10,000D)的SS 316模块超滤，用1M NaCl提取2次，并用水洗涤直至超滤液的吸光度消失。然后用丙酮沉淀K5多糖，产率为850mg/l发酵罐。
通过测定糖醛酸(咔唑法)、质子和13C NMR、UV和蛋白质含量，来测定所得多糖的纯度。测得纯度大于80％。
经HPLC测定，所得多糖由两种级分(平均分子量分别为30,000D和5000D)所组成，所述HPLC条件为：2个Bio-sil SEC 250(Bio Rad)串联柱，以Na2SO4为流动相，室温，流速为0.5ml/分钟。由已知分子量的肝素级分标准曲线测得。
将适量Triton X-100加到纯化K5多糖的1％水溶液中，得一浓度为5％的溶液。该溶液于55℃搅拌下放置2小时。温度升高到75℃，然后室温冷却，期间可形成两相。
在上层相(有机相)中，再重复热处理两次，形成两相。包含多糖的含水相减压下浓缩，并用丙酮或乙醇沉淀。弃去有机相。用质子NMR控制试样的纯度(95％)。
经这种处理后，测得产率为90％。b)N-去乙酰化/N-硫酸化
将10g纯化K5多糖溶于100-2000ml 2N氢氧化钠中，于40-80℃反应至脱乙酰完全(用时不超过30小时)。溶液调至室温并用6N盐酸将pH调至中性。
包含脱乙酰化K5的溶液保持在20-65℃，并一次加入10-40g碳酸钠和10-40g硫酸化剂，所述硫酸化剂选自例如吡啶-SO3加合物、三甲胺-SO3等试剂。
加入硫酸化剂用时在12小时以内。如有需要，在反应结束时，将溶液调至室温，然后用5％盐酸溶液将pH调至7.5-8。
采用已知技术，例如使用1000D螺旋膜(prepscaleCartridge-Millipore)进行渗滤，从盐中纯化产物。当透过液电导(permeate conductivity)低于1000μS、优选低于100μS时停止操作。在浓缩中，采用同样的过滤系统，将所得产物浓缩至10％的多糖。如有需要，可采用常规方法干燥浓缩的溶液。
经13C NMR测定，N-硫酸根/N-乙酰基比例为10/0-7/3。c)C-5差向异构化：
按照本发明，采用溶液或固定化形式的葡糖醛酸基C-5表异构酶(即C-5表异构酶)，进行C-5差向异构化步骤。- 采用溶液酶的C-5差向异构化
将1.2×107-1.2×1011cpm(每分钟计数，按Campbell P.等，Analytical Biochemistry 131，146-152(1983)描述的方法计算)的天然或重组C-5表异构酶，溶于2-2000ml 25mM Hepes缓冲液(pH5.5-7.4)，该Hepes缓冲液包含0.001-10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5和浓度为10-60mM的选自钡、钙、镁、锰之一种或多种离子。在30-40℃、优选37℃下反应进行1-24小时。在反应结束时，酶于100℃灭活10分钟。
产物过DEAE树脂或DEAE Sartobind Cartridge纯化，并用2M NaCl除杂，最终在Sephadex G-10树脂上进行脱盐，或者用2体积乙醇沉淀纯化并过IR 120 H+树脂而再转化成钠盐形式。
按照WO96/14425描述的方法，采用1H-NMR测得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为40∶60-60∶40。- 用固定化酶进行C-5差向异构化
天然或重组C-5表异构酶，可固定于各种惰性载体上，这些载体包括采用反应性官能团经普通酶结合技术衍生化的树脂或膜或玻璃珠，所述酶结合技术例如经溴化氰、戊二醛、碳二亚胺或经酶与离子交换树脂反应或者使其吸附于膜上。按照本发明，应在N-脱乙酰化的N-硫酸化K5底物的存在下，进行酶对惰性载体的攻击反应，这样可防止出现与酶活性位点结合而导致活性损失。
将一定量的N-脱乙酰化的N-硫酸化K5(理论上可转换成表示固定化酶单位的cpm)溶于25mM Hepes缓冲液、0.1M KCl、0.01％TritonX-100和0.15M EDTA(pH7.4)中，然后循环通过包含固定化酶的柱子，于37℃以0.5ml/分钟的流速过夜，测量固定化酶的活性。产物经DEAE色谱系统纯化和在Sephadex G-10上脱盐之后冻干，并用质子NMR技术测定艾杜糖醛酸的含量。
艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例约为30∶70。
将30-40℃恒温的20-1000ml 25mM Hepes溶液(pH6-7.4)，以30-160ml/小时的流速在包含1.2×107-到3×1011cpm当量固定化酶(负载于30-40℃恒温的惰性载体上)的柱子中循环1-24小时，所述Hepes溶液中包含选自钡、钙、镁、锰的一种或多种离子(浓度为10-60mM)和0.001-10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5。在反应结束时，按上述在溶液中进行差向异构化相同的步骤，对试样进行纯化。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为40∶60-60∶40。d)过硫酸化
将包含步骤c)的差向异构化产物的溶液(浓度为10％)冷却至10℃，然后通过IR-120 H+阳离子交换树脂或类似装置(35-100ml)。柱和洗脱液容器均保持在10℃。溶液通过之后，树脂用去离子水洗涤，直至透过液的pH大于6(约3体积去离子水)。用叔或季胺例如氢氧化四丁铵(15％水溶液)将酸溶液调至中性，得到相应的铵盐。将溶液浓缩至最小体积并冻干。所得产物混悬于20-500ml DMF或DMSO中，并加入15-300g硫酸化剂例如吡啶-SO3加合物(固体形式或溶于DMF或DMSO中的溶液形式)。于20-70℃、优选40-60℃下进行2-24小时。
在反应结束时，将溶液冷却至室温，并加入氯化钠饱和的丙酮至完全析出。
经过滤从溶剂中分离出沉淀，用最少量的去离子水(例如100ml)溶解，并加入氯化钠，得到浓度为0.2M的溶液。用2N氢氧化钠将溶液pH调至7.5-8，并加入丙酮直至完全析出。
经过滤从溶剂中分离出沉淀。用100ml去离子水溶解所得固体，并按步骤b)所述的超滤操作，从残余盐中纯化。
取等分试样冻干，供过硫酸化产物的13C-NMR结构分析。
按照Casu等，Carbohyd。Res.39卷，168-176页(1975)所述方法，测得所得产物的每二糖中硫酸含量为2.0-3.5。在6-位氨基糖有80-95％被硫酸化，但2-位完全没有被硫酸化。其他硫酸根基团出现在氨基糖的3-位和糖醛酸的2和3-位。e)选择性O-脱硫酸化
将包含步骤d)所得产物的溶液通过IRl20 H+阳离子交换或类似装置(35-100ml)。待溶液通过之后，用去离子水洗涤树脂，直至透过液的pH大于6(约用3体积的去离子水)。加入吡啶将酸溶液调至中性。溶液浓缩至最小体积并冻干。所得产物用20-2000ml DMSO/ml甲醇(9/1 V/V)溶液处理，并将所得溶液于45-90℃放置1-8小时。最后，向溶液中加入10-200ml去离子水，然后用例如可产生完全析出量的氯化钠饱和的丙酮处理。
经选择性O-脱硫酸化，首先从氨基糖的6-位上除去硫酸根基团，然后顺序除去糖醛酸3-位和2-位以及氨基糖3-位上的硫酸根基团。
按步骤b)所述的渗滤方法纯化所得固体。
取等分试样冻干，供13C-NMR结构分析。
如果经NMR分析显示氨基糖6-位上硫酸根的含量大于60％(按Casu等在Arzneimittelforschiung Drug Research 33-1，135-142(1983)中所述的方法计算)，则直接进行步骤g)。
否则进行以下步骤。f)选择性6-0-硫酸化(任选)
按步骤d)所述的方法，但是操作温度改为20-25℃，处理包含步骤e)产物的溶液，得到叔或季盐。
将铵盐混悬于20-500ml的DMF中。悬浮液冷却至0℃，并用适量硫酸化剂例如吡啶-SO3加合物处理，以氨基糖6-位上硫酸根的百分数(6-O-硫酸根的含量最低为60％)为函数，计算出硫酸化剂的用量。所述量的硫酸化剂(2-10当量)可将羟基硫酸化。硫酸化剂可一次加入，或者用时最多20分钟连续加入。
硫酸化剂可呈粉状或溶于少量DMF中。
溶液于0-5℃放置0.5-3小时，然后用例如可完全析出量的氯化钠饱和的丙酮处理。
按步骤b)所述的渗滤方法纯化所得固体。
取等分试样冻干，供13C-NMR结构分析。
如果经NMR技术测得6-O-硫酸的含量低于60％，则重复步骤f)。g)N-硫酸化
将步骤f)或者步骤e)得到的溶液，按步骤b)所述的方法处理，供N-硫酸化。
通过质子和13C NMR和采用生物试验(例如，抗Xa、APTT、HCII、抗IIa和ATIII亲合力)，对本发明方法得到的葡糖胺聚糖进行了表征。
通过柱色谱技术或超滤对所得产物进行级分，可得到低分子量级分(2000-8000D)和高分子量(25000-30,000D)级分，或者得到可用已知技术(例如，WO8203627中所述的用亚硝酸脱氨基)进行解聚的产物。
本发明方法得到的葡糖胺聚糖(IN-2018 UF和IN2018 LMW)的典型生物活性特征如表1所示，并与肝素UF(4thint.Std)和LMW肝素(1Stint.Std)进行比较。
表1：按所述方法得到的产物的生物活性
试样     UF肝素(4thint.Std)   LMW肝素(1St int.Std)     IN-2018UF  IN-2018 LMW
  1   抗Xa     100     84    70-250   40-100
  2   APTT     100     30    40-90   25-80
  3   HCII     100     未测    300-500   100-200
  4   抗IIa     100     33    100-600   20-210
  5   平均分子量     13500     4500    18000-30000   4000-8000
 6   ATIII亲合力     32％     未测    25-50   20-40
参考
1.Thomas D.P.等，Thrombosis and Haemostasis 45，214-(1981)，IV肝素国际标准(int.Std)。
2.Andersson等，Thrombosis Res.9，575(1976)，IV肝素国际标准。
3.该试验中，将溶液于水中的20ml HCII(Stago)0.05血浆当量单位(PEU)/ml、不同待试浓度的80μl试样溶液和在0.02M Tris缓冲液(pH7.4)中的50μl凝血酶(0.18U/ml-Boehringer)进行混合，所述Tris缓冲液中包含0.15M NaCl和0.1％PEG-6000。溶液于37℃保温60秒，然后加入50μl Spectrozyme(American Diagnostic)显色底物(1mM)。用ACL-7000-(IL)自动凝血时间测定仪，读取每秒钟在405nm处的数据，反应连续记录180秒。
4.该试验中，将溶液于0.1M Tris缓冲液中(pH7.4)的30μlATIII(Chromogenix)0.5U/ml溶液、30μl不同待试浓度的试样溶液和在0.1M Tris缓冲液(pH7.4)中的60μl凝血酶(5.3微卡特(nKat)/ml-Chromogenix)进行混合。所得溶液于37℃保温70秒，然后加入在水中的60μl S-2238(Chromogenix)显色底物(0.5mM)。用ACL-7000-(IL)自动凝血时间测定仪，读取每秒钟在405nm处的数据，反应连续记录90秒。
5.Harenberg和De Vries，J.Chromatography 261，287-292(1983).
6.Hook M.等FEBS Letters 66，90-93(1976).
如上表所示，在评价Xa(1)因子试验中，本发明方法所得产物的活性与提取的肝素相当；在评价抗凝活性(2)的试验中，本发明方法所得产物的活性降低；而在评价抑制凝血酶(3，4)的试验中，本发明方法所得产物的实验值明显提高。这些特征表明所得产物具有更强的抗血栓形成特性和较小的副作用(例如提取肝素存在的出血作用)。
正是凭借这些特性，本发明葡糖胺聚糖可单独或与药用赋形剂或稀释剂组合的形式用于抗凝和抗血栓形成的治疗。
因此，本发明还包括包含有效量所述葡糖胺聚糖和可药用赋形剂或稀释剂的组合物。
最终，本发明还涉及治疗方法，包括施用有效量的所述葡糖胺聚糖用于抗凝和抗血栓形成治疗。
以下实施例旨在进一步说明本发明。
                        实施例1
实施例1按照以下步骤进行：
a)将80％纯度的10g K5多糖(按M199A001465所述方法发酵制得)(附图2)溶于去离子水中，配成1％溶液。加入Triton X-100，得到一5％溶液，搅拌下将溶液置于55℃放置2小时。
溶液加热至75℃并维持该温度直至形成均匀的混浊(turbid)体系，然后将溶液快速冷却至室温。
在冷却过程中，形成了两相。
在上层相(有机相)中，再重复所述热处理2次。将包含K5多糖的含水相减压浓缩至1/10体积，并用丙酮或乙醇沉淀。
弃去有机相。
回收的产物中包含90％纯度的K5多糖，参照内标光谱数据(附图1)，采用质子NMR控制产物的纯度(附图3)。
b)用1000ml 2N氢氧化钠溶解步骤a)得到的产物，并于60℃放置18小时。溶液调至室温，然后用6N盐酸调至中性pH。得到N-脱乙酰化的K5多糖。
将包含N-脱乙酰化K5的溶液保持在40℃，一次加入10g碳酸钠并用时10分钟加入10g吡啶-SO3加合物。在反应结束时，溶液调至室温，然后用5％盐酸溶液将pH调至7.5-8。
采用1000D(prepscale Cartridge-Millipore)螺旋膜，从盐中渗滤纯化包含N-脱乙酰化的N-硫酸化K5多糖的所得产物。当透过液的电导低于100μS时，停止纯化操作。
采用同样的渗滤系统，用膜将产物保持在10％的多糖，然后冻干。
经13C NMR测定，所得产物中N-硫酸根/N-乙酰基比例为9.5/0.5(附图4)。
c)1-制备固定化的C-5表异构酶
向溶于200ml 0.25M Hepes缓冲液(pH7.4)中的按WO98/48006制得的5mg重组C-5表异构酶(相当于1.2×1011cpm(每分钟计数))中，加入100mg N-脱乙酰化的N-硫酸化K5，得到步骤b)所述的溶液，所述Hepes缓冲液包含0.1MKCl、0.1％Triton X-100和15mM EDTA。于4℃，将该溶液置于30,000D的膜中进行膜渗滤，直至渗滤液中N-脱乙酰化的N-硫酸化K5消失。用200mM NaHCO3(pH7)经渗滤置换膜中的缓冲液，然后浓缩至浓度50ml，加入50ml CNBr Sepharose 4b活化的树脂，于4℃反应过夜。
在反应结束时，离心之后，采用Quantigold(Diversified Biotec)方法测定上清液中残余酶的量。测得上清液中没有酶，这表明采用所述方法可100％固定酶。用100mM Tris-HCl缓冲液(pH8)洗涤树脂，以占据树脂中剩余的可用部位。
为了测量固定化酶的活性，将一定量(理论上等于1.2×107cpm)的固定化酶上样到柱上。将按步骤b)方法得到1mg N-脱乙酰化的N-硫酸化K5溶于25mM Hepes缓冲液、0.1M KCI、0.015M EDTA、0.01％Triton X-100中(pH7.4)，然后于37℃下，以0.5ml/分钟的流速过夜循环通过所述柱子。
经DEAE色谱系统纯化和在Sephadex G10上脱盐之后，冻干试样，并按W096/14425描述的质子NMR技术测定艾杜糖醛酸的含量。
艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为30/70(附图5)。
2-差向异构化
将10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5多糖溶于600ml 25mM HEPES缓冲液(pH6.5，包含50mM CaCl2)。所得溶液循环通过50ml柱(负载有包含固定化酶的树脂)。
于37℃进行上述操作24小时，流速为200ml/小时。
所得产物用超滤纯化并用乙醇析出。
将沉淀再溶于水中，浓度为10％。
得到的差向异构化产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为48/52，而起始产物的比例为0/100。
用1H-NMR计算差向异构化的百分率(附图6)。
采用咔唑方法(Bitter和Muir.Anal.Biochem.39，88-92-1971)，测定糖醛酸相对于标准品的含量，计算出产率为90％。
d)用冷却浴，将步骤c)所得的包含10％差向异构化产物的溶液冷却至10℃，然后通过IR-120H+(50ml)阳离子交换树脂。柱和洗脱液容器均保持在10℃。待溶液通过之后，用3体积去离子水洗涤树脂。测得透过液的pH大于6。用15％氢氧化四丁铵水溶液将酸溶液调至中性。于40℃，采用旋转蒸发器将所得溶液真空浓缩至1/10体积，然后冻干。
产物混悬于200ml DMF中，并加入溶于200ml DMF中的150g吡啶SO3加合物。溶液于45℃放置18小时。
在反应结束时，将溶液冷却至室温，并加入1200ml用氯化钠饱和的丙酮。
经过滤，从溶剂中分离出所得沉淀，沉淀用100ml去离子水溶解，并加入氯化钠，得一浓度为0.2M的溶液。溶液用2N氢氧化钠调至pH7.5-8，并加入300ml丙酮。过滤分离出沉淀。所得固体用100ml去离子水溶解，并按步骤b)所述方法从残余盐中渗滤纯化。
取冻干的过硫酸化产物等分试样，进行13C-NMR分析，结果如附图7所示。
e)将包含步骤d)产物的溶液通过IR-120H+(50ml)阳离子交换树脂。待溶液通过之后，用3体积去离子水洗涤树脂。测得透过液的pH大于6。用吡啶将酸溶液调至中性。于40℃，采用旋转蒸发器将所得溶液真空浓缩至1/10体积，然后冻干。
向所得吡啶盐形式的产物中，加入500ml DMSO/甲醇(9/1 V/V)溶液。溶于60℃放置3.5小时，然后加入50ml去离子水，然后用氯化钠饱和的丙酮1,650ml处理。
按步骤b)所述渗滤纯化所得固体，得到10％浓度的溶液。
取等分冻干试样，进行13C-NMR分析，结果如附图8所示，氨基糖上6-位硫酸化的含量为35％。
f)将包含步骤e)产物的溶液通过IR-120 H+(50ml)阳离子交换树脂。待溶液通过之后，用3体积去离子水洗涤树脂。测得透过液的pH大于6。用15％氢氧化四丁铵水溶液将酸溶液调至中性。于40℃，采用旋转蒸发器将所得溶液真空浓缩至1/10体积，然后冻干。
将四丁基铵盐形式的产物混悬于200ml DMF中。
悬浮液冷却至0℃，并用溶于100ml DMF中的40g吡啶-SO3加合物处理。一次加入硫酸化剂。
溶液于0℃放置1.5小时，然后用氯化钠饱和的750ml丙酮处理。
按步骤b)的渗滤方法纯化所得固体。
g)按步骤b)所述方法，对步骤f)得到的溶液进行处理，供N-硫酸化。
取等分冻干的所得产品，进行13C-NMR分析，结果如附图9所示。
与IV肝素国际标准和低分子量肝素国际标准相比，所得产物的化学-物理学和生物特性见表2-第3行。
                      实施例2
重复实施例1操作，不同的是：步骤c)中的固定化C-5表异构酶是从鼠肥大细胞瘤中提取的(Jacobsson等，J.Biol.Chem.254，2975-2982(1979))，和包含40mM CaCl2的反应缓冲液(pH7.4)。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为59.5∶40.5，其特征参见表2第4行。
                      实施例3
重复实施例1，不同的是：步骤c)中的固定化C-5表异构酶是从牛肝中提取的(如WO96/14425所述)，和反应缓冲液(pH7.4)，反应时间为32小时。另外，步骤e)中的反应时间为4小时。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为55.4∶44.6，其特征参见表2第5行。
                      实施例4
重复实施例1，不同的是：步骤c)中的重组C-5表异构酶为溶液形式，用于溶于1000ml HEPES缓冲液(25mM，pH6.5，包含50mM CaCl2)中的10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5的差向异构化。向该溶液中加入1.5×1011cpm当量的实施例1所述的重组酶。溶液于37℃放置24小时。然后，将溶液于100℃处理10分钟使酶变性，最终经过0.45μ的滤器过滤，得到包含产物的澄清溶液。然后所得产物用渗滤纯化，并用乙醇或丙酮析出。沉淀再溶于水，浓度为10％，并按实施例1方法处理，但是步骤e)的反应时间为2小时。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为56∶44，其特征参见表2第6行。
                      实施例5
重复实施例4，步骤c)中溶液形式的酶来源于鼠肥大细胞瘤(与实施例2相同)，和包含40mM BaCl2的反应缓冲液(pH7.4)，反应进行18小时。另外，步骤e)的反应时间为3小时。所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为40.1∶59.9，其特征参见表2第7行。
                      实施例6
重复实施例4，步骤c)中溶液形式的C-5表异构酶来源于牛肝(与实施例3相同)，和包含12.5mM MnCl2的反应缓冲液，反应进行14小时。另外，步骤e)的反应时间为4小时。所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为44.3∶55.7，其特征参见表2第8行。
                      实施例7
重复实施例4，步骤c)中的反应缓冲液(pH7.4)包含37.5mMMgCl2，反应进行16小时。另外，步骤e)的反应时间为4小时。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为47.5∶52.5，其特征参见表2第9行。
                      实施例8
重复实施例3，步骤c)中的反应缓冲液(pH7.0)包含10mM MgCl2、5mM CaCl2、10mM MnCl2，反应进行24小时。另外，步骤e)的反应时间为3小时。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为44.8∶55.2，其特征参见表2第10行。
                      实施例9
重复实施例6，步骤c)中的反应缓冲液(pH7.4)包含10mM MgCl2、5mM CaCl2、10mM MnCl2，反应进行24小时。另外，步骤e)的反应时间为3小时。
所得产物中艾杜糖醛酸/葡糖醛酸的比例为52∶48，其特征参见表2第11行。
                      实施例10
采用凝胶过滤技术，对实施例3所得的具有一定分子量分布(附图10，按Harenberg和De Vries，J.Chromatography 261，287-292(1983)测定)的试样进行分离。具体地说，将1g产物溶于20ml NaCl缓冲液(1M)，并用包含1000ml Sephacryl HR S-400-(Amersham-Pharmacia)树脂的柱处理。然后用2000ml NaCl缓冲液(1M)洗脱柱子，并用级分收集器(Gilson)收集(50ml等分级分)。采用咔唑分析(Bitter和Muir，Anal.Biochem.39，88-92-1971)测定每一级分产物的含量之后，将所得级分为级分A和级分B试样，其分别相应于高分子量级分和低分子量级分。用蒸发器将这些级分真空下浓缩至1/10体积，然后用包含500ml Sephadex G-10(Amersham Pharmacia)树脂的柱子进行脱盐。
将包含脱盐产物的溶液冻干，得到级分A和级分B(附图11A和附图11B)。所得产物的特征参见表2第12和13行。
                      实施例11
按WO 8203627方法，用亚硝酸对实施例4得到的试样进行控制降解。具体地说，将5g试样溶于250ml水中，并用恒温浴调至4℃。用冷却至4℃的1N盐酸将pH调至2.0，然后快速加入10ml亚硝酸钠溶液(1％)。如有需要，可用1N盐酸将pH调回至2，并缓慢搅拌15分钟。溶液用冷却至4℃的1N NaOH中和。然后加入溶于13ml去离子水中的250mg硼氢化钠并反应4小时。用1N盐酸将pH调至5.0，然后放置10分钟以破坏过量的硼氢化钠，然后用1N NaOH中和。用3体积乙醇进行沉淀回收产物，然后在真空加热器中干燥。所得产物的特征参见表2第14行。
表2.从所述实施例中所得产物的抗凝和抗血栓形成活性
    1)抗Xa(％)    2)APTT(％)     3)HCII(％)     4)抗IIa(％)     5)MW     6)ATIII亲合力(％)
UF肝素(4thint.STD)     100     100     100     100     13500     32％
LMW肝素(1St int.Std)     84     30     33     4500     未测
实施例1     76.6     43.4     256     118     15200     29
实施例2     94.3     57     294     208     13500     29.5
实施例3     112     88     346     223     14600     28
实施例4     157     71.5     362     600     22500     29
实施例5     150     70     352     213     24000     31
实施例6     150     79     335     333     23000     33
实施例7     120     92     346     247     13000     29
实施例8     153     75     332     240     22500     34
实施例9     157     71     346     233     23000     35
实施例10-A     250     70.8     480     435     30000     48
实施例10-B     43     77.7     145     27.3     7600     24
实施例11     97.5     55.5     230     210     5400     25
参考1)-6)见表1所述。
如上表所示，在评价Xa因子(1)试验中，本发明方法所得产物的活性与提取的肝素相当；在评价总的抗凝活性(2)的试验中，本发明方法所得产物的活性降低；而在评价抑制凝血酶(3，4)的试验中，本发明方法所得产物的活性明显提高。这些特征表明所得产物具有更高的抗血栓形成特性和较小的副作用(例如提取肝素存在的出血作用)。

Claims (10)

1.K5多糖的N-脱乙酰化的N-硫酸化衍生物，其中差向异构化的L-艾杜糖醛酸至少占总糖醛酸的40％，所述衍生物的分子量为2000-30,000D，包含25-50％重量的具有高ATIII亲合力的链，该链的高抗凝和抗血栓形成活性以HCII/抗Xa比值表示，该比值为1.5-4。
2.如权利要求1的衍生物，其特征在于分子量为4000-8000D。
3.如权利要求1的衍生物，其特征在于分子量为18000-30,000D。
4.制备如权利要求1的K5多糖衍生物的方法，包括顺序进行以下步骤：从大肠杆菌(Escherichia Coil)中制备K5多糖，N-去乙酰化和N-硫酸化，D-葡糖醛酸经C-5差向异构转化成L-艾杜糖醛酸，过硫酸化，选择性O-脱硫酸化，选择性6-O-硫酸化和N-硫酸化，其特征在于在特定的二价阳离子存在下，采用溶液或固定化形式的葡糖醛酰基C-5表异构酶进行所述的C-5差向异构化。
5.如权利要求4的方法，其特征在于所述酶选自：重组葡糖醛酰基C-5表异构酶、来源于鼠肥大细胞瘤的葡糖醛酰基C-5表异构酶和来源于牛肝提取物的葡糖醛酰基C-5表异构酶。
6.如权利要求4的方法，其特征在于所述二价阳离子选自Ba、Ca、Mg和Mn，其中所述阳离子可单独或组合使用。
7.如权利要求4-6任一的方法，其特征在于采用酶溶液，通过将1.2×107-1.2×1011cpm的C-5表异构酶溶于2-2000ml 25mM Hepes缓冲液中进行所述的C-5差向异构化，所述Hepes缓冲液的pH为5.5-7.4，其中包含0.001-10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5和浓度为10-60mM的一种或多种所述阳离子。
8.如权利要求7的方法，其特征在于采用酶溶液，于30-40℃进行所述C-5差向异构化1-24小时。
9.如权利要求4-6的方法，其特征在于采用固定化形式的酶，将20-1000ml 25mM Hepes缓冲液循环通过包含负载于惰性载体上的1.2×107-3×1011cpm固定化酶的柱子，进行所述的C-5差向异构化反应，所述Hepes缓冲液的pH为6-7.4，其中包含0.001-10g N-脱乙酰化的N-硫酸化K5和浓度为10-60mM的一种或多种所述阳离子。
10.如权利要求9的方法，其特征在于30-40℃使所述溶液以30-160ml/小时的循环流速，进行所述的C-5差向异构化反应1-24小时。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1295251C (zh) * 2000-12-18 2007-01-17 帕斯夸·奥雷斯特 由k5多糖衍生具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖及其制备方法
CN111670038A (zh) * 2018-02-02 2020-09-15 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 糖胺聚糖衍生物及其制备方法和用途

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8227449B2 (en) 2000-03-30 2012-07-24 Glycores 2000 S.R.L. Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation
ITMI20032498A1 (it) 2003-12-17 2005-06-18 Pasqua Anna Oreste Polisaccaridi antitrombotici a basso peso molecolare e
ITMI20010397A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Giorgio Zoppetti Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione
US20120253029A1 (en) 2002-06-18 2012-10-04 Pasqua Anna Oreste Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein
CN1671744A (zh) * 2002-06-18 2005-09-21 格利考斯2000有限公司 低分子量过硫酸化多糖
US8513407B2 (en) * 2002-06-18 2013-08-20 Glycores 2000 S.R.L. Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
ITMI20031618A1 (it) * 2003-08-06 2005-02-07 Inalco Spa Derivati polisaccaridici dotati di alta attivita'
WO2006023487A2 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Rapid two-step synthesis of anti-coagulants
WO2007058592A1 (en) * 2005-11-21 2007-05-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab A method of chromatography using semi-synthetic heparin ligands
ITMI20091445A1 (it) * 2009-08-07 2011-02-08 Inalco S P A A Socio Unico Derivati semi-sintetici del polisaccaride k5 per la prevenzione ed il trattamento del danno tissutale associato a ischemia e/o riperfusione

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262403A (en) * 1986-03-10 1993-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Glycosaminoglycan derivatives and their use as inhibitors of tumor invasiveness of metastatic profusion-II
FR2669932B1 (fr) * 1990-12-03 1994-07-01 Sanofi Sa Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent.
FR2704861B1 (fr) * 1993-05-07 1995-07-28 Sanofi Elf Fractions d'héparine purifiées, procédé d'obtention et compositions pharmaceutiques les contenant.
IT1271057B (it) * 1994-11-04 1997-05-26 Inalco Spa Polisaccaridi aventi un elevato contenuto di acido iduronico
US5728554A (en) * 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
IT1282994B1 (it) * 1996-05-10 1998-04-03 Inalco Spa Derivati del polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante
IT1290814B1 (it) * 1997-03-24 1998-12-11 Istituto Scient Di Chimica E B Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica
US6329351B1 (en) * 1997-08-28 2001-12-11 Istituto Scientifico Di Chimica E Biochimica “G. Ronzoni” Semi-synthetic sulphaminoheparosansulphates having high anti-metastatic activity and reduced haemorrhagic risk

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1295251C (zh) * 2000-12-18 2007-01-17 帕斯夸·奥雷斯特 由k5多糖衍生具有高抗血栓形成活性的糖胺聚糖及其制备方法
CN111670038A (zh) * 2018-02-02 2020-09-15 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 糖胺聚糖衍生物及其制备方法和用途
CN111670038B (zh) * 2018-02-02 2024-01-26 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 糖胺聚糖衍生物及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001246510A1 (en) 2001-10-08
JP2003528945A (ja) 2003-09-30
EP1268559A1 (en) 2003-01-02
RU2283319C2 (ru) 2006-09-10
CN1177865C (zh) 2004-12-01
US20060281152A1 (en) 2006-12-14
US20030023079A1 (en) 2003-01-30
RU2002129018A (ru) 2004-02-27
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