TWI769176B

TWI769176B - 生合成肝素

Info

Publication number: TWI769176B
Application number: TW106130506A
Authority: TW
Inventors: 立傅; 凱文李; 羅伯特林赫德特; 強納森多迪克; 大輔森; 馬克杜埃斯; 納迪格羅佛; 帕耶爾達塔; 伊蓮娜帕卡列娃; 蕾林; 伯德福爾保羅; 崔佛Ｊ賽門斯; 大西章浩; 平金真
Original assignee: 瑞瑟勒綜合技術協會
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2022-07-01
Also published as: CN109923208B; ES2952428T3; WO2018048973A1; CN109923208A; EP3510147B1; CA3035912A1; AU2017324960A1; EP3510147A4; PH12019500459A1; RU2019105262A3; US20190225998A1; BR112019004449A2; HUE062448T2; US20230151400A1; JP2019531067A; US11591628B2; MY193343A; EP3510147A1; KR20190052025A; JP7033330B2

Abstract

本發明係關於可與豬USP肝素鈉生物等效之肝素的合成。該合成可涉及始於肝素前體之三種中間物。

Description

生合成肝素

本發明大體係關於一種多醣化學領域且更特定言之係關於可與豬USP肝素生物等效之生合成肝素領域；製備該生合成肝素之方法；可用於該等製備方法的中間物；及使用該生合成肝素之方法。

一個實施例為一種包含一定量之N-硫酸化(NS)雙醣基的醣胺聚醣，該量對產生生合成肝素有效。NS基團雙醣基之量可為78%至99%或81%至97%或83%至95%或85%至93%。另一實施例為一種包含一定量之N-硫酸化，2-硫酸化(NS2S)雙醣基的醣胺聚醣，該量對產生生合成肝素有效。NS2S雙醣基之量可為44%至80%或50%至78%或55%至77%或60%至76%。又一實施例為一種包含一定量之N-硫酸化，2-硫酸化，6-硫酸化(NS2S6S)雙醣基及N-硫酸化，6-硫酸化(NS6S)雙醣基的醣胺聚醣，其中該等量對產生生合成肝素有效。NS6S基團及NS2S6S雙醣基之對應量可為6%至40% NS6S基團及31%至73% NS2S6S基團；6%至32% NS6S基團及36%至70% NS2S6S基團；6%至26% NS6S基團及40%至67% NS2S6S基團；或6%至22% NS6S基團及43%至64% NS2S6S基團。又一實施例為一種用於產生生合成肝素之方法，其包含：a.獲得包含31%至73%之NS2S6S雙醣基，6%至40%之NS6S雙醣基，0%至27%之NS2S基團及1%至22%之NS基團的醣胺聚醣；及b.在硫酸鹽供體存在下用酶(為3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1))處理該醣胺聚醣以產生生合成肝素批次。又一實施例為一種製備包含44%至80%之NS2S基團及13%至39%之NS基團的第二醣胺聚醣中間物的方法。該方法可包含a.轉換肝素前體中一定量之N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含78%至99%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一醣胺聚醣，其中經轉換之N-乙醯基葡糖胺殘餘物的量對應於第一醣胺聚醣中間物中NS基團之量；及b.在硫酸鹽供體存在下用兩種酶(C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一醣胺聚醣中間物以產生第二醣胺聚醣中間物。且又一實施例為一種製備包含31%至73%之NS2S6S雙醣基，6%至40%之NS6S雙醣基，0%至27%之NS2S基團及1%至22%之NS基團的第三醣胺聚醣中間物的方法。該方法可包含在硫酸鹽供體存在下用酶(6-O-轉磺酶同功異構物1及/或3 (6OST-1/3))處理包含44%至80%之NS2S基團及13%至39%之NS基團的第二醣胺聚醣中間物以將第二醣胺聚醣中間物轉換成第三醣胺聚醣中間物。

相關申請案 本申請案主張2016年9月7日申請之美國臨時申請案第62/384,341號之優先權，該申請案以全文引用之方式併入本文中。肝素廣泛用作溶液中及植入裝置上兩者的抗凝血劑。肝素之化學合成通常視為不可行的，且因此醫藥級別肝素已衍生自遍及肝素製造史之多種動物組織。但對動物源之依賴引發了品質控制及供應的問題。肝素之主要來源為豬腸，但亦可用牛肺及腸肝素，及綿羊的腸肝素。產物品質可隨環境因素及動物亞種而變化，提供對於藥物管制之額外困難。對朊病毒疾病(諸如牛海綿狀腦病(BSE，「瘋牛病」，其引起人類的庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)及綿羊的綿羊瘙癢病朊病毒的嚴重憂慮導致使用牛及綿羊組織作為肝素源的減退。在2008年，過硫酸化硫酸軟骨素(OSCS)引入至產自中國豬的肝素中，導致接近100個美國人死亡及顯著降低的肝素供應。此故意摻雜極其難以偵測，因為當前屠宰場中肝素的組織供應鏈缺乏現行良好作業規範(cGMP)監管。近年來，已懷疑由不同動物種類獲得之肝素混合。牛肺肝素、牛腸肝素、綿羊腸肝素及豬腸肝素可藉由其抗凝血酶五碳醣結合位點之結構性變體的不同分佈及其雙醣組成的差異彼此區別。然而，甚至使用現代化分析方法亦極其難以偵測少量牛腸肝素或綿羊腸肝素在豬腸肝素產物中的存在。供應亦為一嚴重難題。儘管全世界每年所屠宰的豬有12億或大於12億，產生100噸/年的肝素，但商業供應商可能不能夠跟得上增加之全世界的需求，特定言之在發展中國家的需求。最新市場份額分析展示大部分粗製肝素源自中國，其供應約57%之全世界的市場。動物群對傳染病(諸如中國的豬流行病)的易感性、過度屠殺或環境問題可顯著減少可自其製備肝素之動物的供應。肝素之現貨短缺引發關於再引入牛肝素至US市場的重大考量。然而，牛腸肝素不能滿足USP肝素規格且此限制其商業用途。牛腸肝素之接受亦增加混合豬及牛肝素的風險，其難以偵測且改變最終產物的性質。考慮到需要生物等效肝素之替代及可信賴來源，研究人員已嘗試自肝素前體合成肝素。化學及酶步驟之組合得到接近肝素之產物，但盡發明人知識內所知，化學酶所合成之生合成肝素仍未滿足USP標準。在多個測試實例中努力研究之後，發明人已合成出可滿足USP所有要求的肝素。發明人已闡明三種具有特定特徵之中間物，其對獲得該生物等效肝素可為必要的。定義出於本申請案之目的，以下術語具有此等定義：除非尤其指定意指僅一個，否則如本文所使用，「一(a)」或「一(an)」意指一或多個。「約」明確地涵蓋技術人員所理解之對於等效於規定值的典型變化。當使用數值時，「約」涵蓋±20%或±15%或±10%或±8%或±7%或±6%或±5%或±3%或±2%或±1%之規定值。除非另有說明，否則當關於雙醣含量提供%時，其典型地係指莫耳/莫耳百分比。如本文所使用，BSH係指生合成肝素，亦即經由以下方法中的一或多者製得的肝素：化學方法；酶方法；組合之化學及酶方法；微生物及哺乳動物細胞培養方法。在一些實施例中，生合成肝素可包含與豬USP肝素生物等效之肝素，亦即豬肝素鈉，例如「生物等效肝素」。如本文所使用，就活性層級及分子量分佈而言，「生物等效肝素」(BEqH)與豬USP肝素鈉等效。在一些實施例中，生物等效肝素可以如揭示於下表2中之等效於豬USP肝素的量含有雙醣基NS、NS2S、NS6S及NS6S2S。如本文所使用，術語「批次」可指意欲在指定限值內具有均一特性及品質之藥物或其他物質(諸如肝素)的特定數量，且在相同製造週期期間根據單一製造順序製造。肝素及肝素前體 肝素前體為具有重複雙醣單元[→4) β-D-葡糖醛酸(GlcA) (1→4)N -乙醯基-α-D-葡糖胺(GlcNAc) (1→]_n 之不同長度直鏈多醣的群體。肝素為具有抗凝血性質之直鏈陰離子醣胺聚醣的不同群體。肝素可消化為獨特的雙醣群(Yang, B., Chang, Y., Weyers, A. M., Sterner, E., & Linhardt, R. J. (2012).及由液相層析法-紫外光譜法(LC-UV)進行之分析(P. Mourier 等人Analytical Chemistry Research 3 (2015) 46-53)中。由LC-UV法獲得之資料與以習知所使用之液相層析質譜法(LC-MS)所獲得之資料具有高度的可比性。在用三種肝素解離酶之混合物消化之後，肝素提供以下雙醣： 0S [ΔUA-GlcNAc] NS: [ΔUA-GlcNS] 6S [ΔUA-GlcNAc6S] 2S [ΔUA2S-GlcNAc] NS2S [ΔUA2S-GlcNS] NS6S [ΔUA-GlcNS6S] 2S6S [ΔUA2S-GlcNAc6S] TriS (NS2S6S) [ΔUA2S-GlcNS6S] 其中ΔUA對應於4-去氧-α-L-蘇-己-4-烯橋哌喃糖基糖醛酸。GlcN對應於D-葡糖胺，Ac對應於乙醯基且S對應於磺酸基。在本說明書中，雙醣含量可根據上述八種雙醣之總含量計算。因為肝素及肝素前體及相關衍生物係複雜分子，所以其亦可根據其重量平均分子量(Mw)及分子量分佈來表徵。肝素可進一步以其抗凝血活性來表徵。美國藥典版本39 (USP39)標準，「肝素鈉，USP」需要肝素具有特定層級之活性及分子量分佈。根據USP，肝素具有15,000至19,000 Da之平均重量；分子量大於24,000 Da之肝素鏈的百分比不大於總量之20%；且介於8,000至16,000 Da之間分子量的鏈與介於16,000至24,000 Da之間分子量的鏈的比率不小於1.0。在本發明中，介於8,000至16,000 Da之間分子量的鏈與介於16,000至24,000 Da之間分子量的鏈的比率不小於1.0，較佳在1.0與2.5之間，1.0與2.0之間，1.2與1.8之間，1.4與1.7之間，1.5或1.6。效能藉由生物檢定使用基於每毫克肝素活性之單位的USP參考標準來測定。此等規格需要不小於180 U/mg之因子IIa(亦即抗IIa)之肝素的抗凝血活性，且因子Xa與因子IIa(亦即抗Xa/抗IIa)之活性比率在0.9與1.1之間。針對豬肝素鈉之當前USP 專論(USP 39)沒有與雙醣組成相關之要求。然而，按理說肝素之性質自結構產生。因此，發明人闡明豬USP肝素之某些結構性特徵。表1展示源自利用三種肝素解離酶處理之後的豬USP肝素之雙醣基的統計範圍。量測總共15批次之豬USP肝素。計算樣品之算術平均值(平均)及標準差(SD)。分析誤差之標準差基於發明人累積資料獲得。應用表1之最左行中的以下等式計算各雙醣之範圍。表1.豬USP肝素批次之組成分析及對可與豬USP肝素生物等效之生合成肝素的目標範圍測定。

假定15個肝素樣品為代表性的，3個標準差涵蓋99.7%之所期望變化。在一些實施例中，與豬USP肝素鈉生物等效之生合成肝素中各雙醣的含量在源自USP肝素之經估計平均值的3個標準差內，如上表1中所示出且提供於表2中。表2. 3個標準差可變性內之豬USP肝素的組成。

在一些實施例中，生合成肝素中各雙醣的含量在源自USP肝素之經估計平均值的2.5、2.0、1.5或1.0標準差內。在一些實施例中，主要雙醣(NS、NS6S、NS2S及TriS)中之每一者的含量在源自USP肝素之對應經估計平均值的3.0、2.5、2.0、1.5或1.0標準差內。 Mulloy等人「USP compendial methods for analysis of heparin: chromatographic determination of molecular weight distributions for heparin sodium」Anal Bioanal Chem (2014) 406:4815-4823回顧了豬USP肝素鈉之尺寸分佈。根據圖3，8至16 kDa種類至多55%，且16至24 kDa種類不低於25%。因此，在此研究中18-16/16-24比率為2.2(亦即55/25)。自肝素前體合成肝素肝素前體為具有重複雙醣單元[→4) β-D-葡糖醛酸(GlcA) (1→4)N -乙醯基-α-D-葡糖胺(GlcNAc) (1→]_n 的多醣。肝素前體以細菌中之多醣膠囊形式生合成，包括大腸桿菌 (Escherichia coli )及多殺巴斯德氏菌 (Pasteurella multicida )。Lindahl U等人(1998)「Regulated diversity of heparan sulfate」J Biol Chem 273(39):24979-24982。實驗室規模研究表明由E.coli K5菌株獲得之＞10,000之重量平均分子量(M_w )的肝素前體可化學酶轉換成稱為新生肝素的抗凝血劑多醣，其與豬USP肝素鈉不生物等效。Lindahl等人(2005)J Med Chem 48(2):349-352；Zhang等人(2008)Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007；美國專利第6,162,797號；US 2014/0349962。以下文獻描述對豬USP肝素鈉不生物等效的生合成肝素。無一者描述具有本文所述之性質的中間物的產生，亦未製得與豬USP肝素生物等效的肝素。當報導時，此類肝素之雙醣含量不在源自豬USP肝素之經估計平均值的1、2或3個標準差內，亦無與生物等效肝素所需之中間物一致的任何中間物。本發明與先前技術之間的其他差異包括尤其第三中間物NS2S6S，亦稱為TriS。使用硫酸化之化學方法的某些先前方法無法製備不具有3S雙醣的中間物NS2S6S。某些化學酶方法不控制足以獲得NS2S6S中間物之各化學酶步驟中的主要雙醣基含量。在 Bhaskar, U.等人(2015).Carbohydrate Polymers , 122, 399-407中，主要雙醣組成(諸如預3OST中間物之NS6S、NS2S、NS2S6S)分別為7.8、15.7及67.9% (w/w)。所得「肝素」與豬USP肝素不生物等效，且此文獻中預3OST中間物之雙醣組成不同於生物等效肝素所需之第三中間物NS2S6S/TriS。在此文獻中所製備之「肝素」的經報導最高抗IIa活性為151 U/mg，其小於所需的180 U/mg，使得其與豬USP肝素不等效。另外，由Bhaskar等人製備之產物的分子量＞25,000 dal。在Zhang, Z.等人(2008)Journal of the American Chemical Society , 130(39), 12998-13007中，「肝素」，第三中間物NS2S6S之對應物不含有代表0S、2S、6S及2S6S的N-乙醯基基團。所得「肝素」與豬USP肝素不生物等效，且此文獻中預3OST中間物之雙醣無法滿足生物等效肝素所需之第三中間物NS2S6S的要求。此肝素之活性藉由基於凝塊之活化部分凝血活酶時間(APTT)檢定確定為180 U/mg。此檢定與描述於當前USP中之抗IIa活性不等效，因而此是否會滿足豬USP肝素之活性規格不明確。此外，無抗Xa檢定在此研究中實施，因而此「肝素」之抗Xa/抗IIa比率未定義。總而言之，在無N-乙醯基及未定義之抗IIa及抗Xa活性存在下，此肝素與豬USP肝素不生物等效。J Med Chem 48(2): 349-352 (2005)展示具有大致8,000之分子量；抗Xa 162；抗IIa 62；抗Xa/抗IIa 2.6，亦即不生物等效的分子「新生肝素」。考慮到新生肝素與生物等效肝素之間的分子量及化學酶程序中後3OST反應的抗凝活性的差距，新生肝素之預3OST中間物不同於生物等效肝素所需之第三中間物NS2S6S。美國專利第6,162,797號提供一種藉由差向異構化N-去乙醯化，N-硫酸化肝素前體之逐步化學硫酸化獲得的肝素衍生物。然而，此衍生物具有抗Xa 500-600，抗IIa 250-320(儘管在本說明書中，使用「APTT」替代抗IIa，且「APTT」非常可能為抗IIa)，亦即不生物等效。由此得出，此文件不教示或表明與生物等效肝素所需之第三中間物NS2S6S等效的中間物。此專利亦不教示以下所揭示之第一(NS)中間物或第二中間物。 US 2014/0349962 A1展示一種肝素衍生物，由肝素前體之化學酶功能化獲得的「Mitrin」。「Mitrin」為具有比USA肝素更高抗Xa活性之無2-O硫酸化艾杜糖醛酸(iduronic acid)基的六醣。因此，本文件不教示或表明第二中間物(NS2S)或與第三中間物(NS2S6S)等效的中間物。因此，儘管描述於上述文獻中之「生合成肝素」與豬USP肝素共用一些性質，其與豬USP肝素並不化學上等效或生物等效 。上述文獻亦不教示或表明什麼因子遺失，什麼步驟更改或如何更改其以製備生合成肝素。本文所述之生合成肝素中間物並未發現於活體內肝素產生之中間物中。特定言之，天然肝素中間物結合至蛋白聚糖連接體(Sugahara K, Kitagawa H. (2002) Heparin and heparan sulfate biosynthesis.IUBMB Life , 54(4): 163-75)，且因此不以本發明中給定規格的自由形式存在。因此，生合成肝素非天然產物。發明人已生成可與豬USP肝素生物等效的生合成肝素。發明人已闡明三種中間物，其對自肝素前體經由化學酶程序合成與豬USP肝素生物等效之肝素可為必要的。以下根據其顯性雙醣基標記為NS中間物、NS2S中間物及NS2S6S中間物(或TriS中間物)的此等中間物以經修飾糖種類(諸如雙醣基)之特定範圍來表徵。其可進一步以分子量性質及分佈來表徵。此等中間物可能不會具有抗凝血酶介導的抗凝血活性。本發明係關於自肝素前體合成生合成肝素，諸如衍生自細菌胞外多醣肝素前體，且闡明關鍵中間物之性質，其對獲得生物等效肝素可為有必要的。在一些實施例中，生合成肝素可滿足US藥典(USP)對於活性的要求，尤其肝素對因子IIa(亦即抗IIa )之抗凝血活性不低於或大於180 U/mg，且因子Xa與因子IIa(亦即抗Xa/抗IIa)之活性的比率在0.85至1.15或0.9與1.1之間或約1.0。生合成肝素亦可滿足分子量分佈的USP要求：15,000至19,000 Da之平均重量；分子量大於24,000 Da之肝素鏈的百分比不大於總量之20%(此處包括0至15%、0至10%及5至10%)；且8,000至16,000 Da之間分子量的鏈與16,000至24,000 Da之間分子量的鏈的比率不小於1.0(此處包括1.0至2.5之間；1.0至2.0之間，1.2至1.8之間，1.4至1.7之間，1.5或1.6)。因此，生合成肝素可與豬USP肝素生物等效。在一個實施例中，第一中間物NS可為包含有效量之N-硫酸化(NS)雙醣基的醣胺聚醣物質。舉例而言，N-硫酸化(NS)雙醣基可構成78%至99.5%或78%至99%或81%至97%或83%至95%或84%至94%或85%至93%或84%至87%或85%至86%或87.5%至94%或90%至93.5%或90.5%至93%或90.3%至91.3%或92.2%至93.2%或在第一中間物NS之此等範圍內的任何值或子範圍。在一些相關實施例中，第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。在所有情況下，NS必須含有一些可量測的NAc基。第一中間物之分子量性質可適於形成生合成肝素，該生合成肝素可滿足使用例如以下所揭示之任一方法的豬USP肝素鈉的分子量規格。在一些實施例中，第一中間物NS為包含84.7至93.8重量%之N-硫酸化(NS)雙醣基的醣胺聚醣物質。在相關實施例中，剩餘物為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc)(0S)雙醣基。在一些實施例中，第一中間物NS可包括83.4%至87.4%或83.9%至86.9%或84.4%至86.4%或84.9%至85.9%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。該第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。在一些實施例中，第一中間物NS可包括87.9%至92.9%或88.4%至92.4%或88.9%至91.9%或89.4%至91.4%或89.9%至90.9%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。該第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。在一些實施例中，第一中間物NS可包括88.8至94.7%或89.3%至94.2%或89.8至93.7%或90.3%至93.2%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。該第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。在一些實施例中，第一中間物NS可包括88.8至92.8%或89.3至92.3%或89.8至91.8%或90.3至91.3%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。該第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。在一些實施例中，第一中間物NS可包括90.1至94.7%或90.6至94.2%或91.1%至93.7%或91.6%至93.2%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。另一實施例可為醣胺聚醣第二中間物NS2S，其可為包含有效量之N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基的醣胺聚醣物質。舉例而言，在一些實施例中，N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基可構成44至80%或45至79%或50至78%或50至77%或55至78%或55至76%或58至77%或59至76%或60至75%或58至62%或59至61%或65至77%或在醣胺聚醣第二中間物NS2S之此等範圍內的任何值或子範圍。除了N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基之外，醣胺聚醣第二中間物NS2S亦可包含NS雙醣基。舉例而言，NS雙醣基可構成12%至40%或13%至39%或15%至34%或15%至29%或16%至29%或16%至26%或17%至25%或16%至18%或19%至26%或在醣胺聚醣第二中間物NS2S之此等範圍內的任何值或子範圍。NS雙醣基之範圍中之每一者可與用於N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基之上述範圍中之每一者一起使用。除了N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及NS雙醣基之外，醣胺聚醣第二中間物NS2S亦可包括微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及2-O-硫酸化，NAc(2S)雙醣基中之一或多者。在某些實施例中，除N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基以外，醣胺聚醣第二中間物NS2S之唯一組分可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基。在一些實施例中，0S及2S雙醣基之組合量可為0.4至25%或4至24%或5至24%或6至20%或6至18%或6至16%或7至23%或7至20%或7至17%或7至15%之第二中間物NS2S。第二中間物之分子量性質可適於形成生合成肝素，該生合成肝素可滿足使用例如以下所揭示之任一方法的豬USP肝素鈉的分子量規格。在一些實施例中，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含73.8至75.3重量%的N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及18.5至20.2重量%的NS雙醣基。醣胺聚醣第二中間物NS2S之剩餘物可包含微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。在一些實施例中，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含57.5至62.5%或58至62%或58.5至61.5%或59至61%或59.5至60.5%或在NS2S雙醣基之此等範圍內的值或子範圍。另外，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含23.2至27.2%或23.7至26.7%或24.2至26.2%或24.7至25.7%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。醣胺聚醣第二中間物NS2S之剩餘物可包含微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。0S及2S基之組合量可由13.3至16.3%或13.8至15.8%或14.3至15.3%之第二中間物構成。在一些實施例中，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含65.8至77.4%或66.3至76.9%或66.8至76.4%或67.3至75.9%或在NS2S雙醣基之此等範圍內的值或子範圍。另外，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含14.8至26%或15.3至25.5%或15.8至25%或16.3至24.5%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。醣胺聚醣第二中間物NS2S之剩餘物可包含微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。0S及2S基之組合量可由5.6至10.8%或6.1至10.3%或6.6至9.8%之第二中間物構成。在一些實施例中，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含65.8至74.4%或66.3至73.9%或66.8至73.4%或67.3至72.9%或在NS2S雙醣基之此等範圍內的值或子範圍。另外，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含17.9至26%或18.4至25.5%或18.9至25%或19.4至24.5%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。醣胺聚醣第二中間物NS2S之剩餘物可包含微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。0S及2S基之組合量可由5.6至10.8%或6.1至10.3%或6.6至9.8%之第二中間物構成。在一些實施例中，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含73.4至77.4%或73.9至76.9%或74.4至76.4%或74.9至75.9%或在NS2S雙醣基之此等範圍內的值或子範圍。另外，醣胺聚醣第二中間物NS2S可包含14.8至18.8%或15.3至18.3%或15.8至17.8%或16.3至17.3%或在NS雙醣基之此等範圍內的任何值或子範圍。醣胺聚醣第二中間物NS2S之剩餘物可包含微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。0S及2S基之組合量可由5.8至9.8%或6.3至9.3%或6.8至8.8%之第二中間物構成。第二中間物對於形成具有符合豬USP肝素之尺寸及活性要求的肝素可為合適的。換言之，第二中間物可以使得具有符合豬USP肝素鈉之尺寸及活性要求的肝素可使用例如以下所揭示之任一方法形成。舉例而言，第二中間物可具有適於形成具有與豬USP肝素鈉符合之尺寸及活性要求的最終肝素產物的重量平均分子量。第二中間物中有效量之N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基可以使得具有符合豬USP肝素鈉之尺寸及活性要求的肝素可使用例如以下所揭示之任一方法形成。另一實施例為醣胺聚醣第三中間物NS2S6S，其可為包含有效量之N-硫酸化，2-O-硫酸化，6-O-硫酸化(NS2S6S或亦稱為TriS)雙醣基及N-硫酸化，6-O-硫酸化(NS6S)雙醣基的醣胺聚醣物質。舉例而言，NS2S6S雙醣基可構成30至74%或31至73%或36至70%或40至67%或40至66%或42至65%或44至64%或42至45%或48至65%或在醣胺聚醣第三中間物NS2S6S之此等範圍內的任何值或子範圍。NS6S雙醣基可構成5至40%或5至32%或5至26%或5至23%或5至7%或8至16%或18至23%或6至69%或6至32%或6至26%或6至21%或在醣胺聚醣第三中間物NS2S6S之此等範圍內的任何值或子範圍。NS6S雙醣基之範圍中之每一者可與NS2S6S雙醣基之上述範圍中之每一者一起使用。較佳地，醣胺聚醣第三中間物NS2S6S不含有3S雙醣基。除了NS2S6S及NS6S雙醣基之外，醣胺聚醣第三中間物NS2S6S亦可包含N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及/或NS雙醣基。NS2S雙醣基可構成1至28%或1至27%或4至28%或8至28%或10至28%或11至28%或12至27%或11至22%或19至27%或3至23%或5至19%或7至16%或在醣胺聚醣第三中間物NS2S6S之此等範圍內的任何值或子範圍。NS雙醣基可構成0.5至23%或0.5至20%或0.5至19%或0.5至18%或0.5至17%或1至21%或1至19%或1至18%或1至17%或1至15%或在醣胺聚醣第三中間物NS2S6S之此等範圍內的任何值或子範圍。除NS2S6S、NS6S、NS2S及NS雙醣基之外，醣胺聚醣第三中間物NS2S6S亦可包含一或多個0S、2S、6-O-硫酸化，NAc (6S)及2-O-硫酸化，6-O-硫酸化，NAc (2S6S)雙醣基。在某些實施例中，醣胺聚醣第三中間物NS2S6S之唯一組分可為(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及/或(d) 2S6S。醣胺聚醣第三中間物NS2S6S中(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及/或(d) 2S6S之總量可為例如28%或小於28%或27%或小於27%或23%或19%或16%。在一些實施例中，醣胺聚醣第三中間物NS2S6S中(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及/或(d) 2S6S之組合量可為0.5至28%或1至27%或2至24%或3至23%或4至20%或5至19%或8至17%或7至16%或在此等範圍內的任何值或子範圍。在一些實施例中第三中間物可包含57.4至62.0重量% (53.3至59.4莫耳%)N-硫酸化，2-O-硫酸化，6-O-硫酸化(NS2S6S或亦稱為TriS)雙醣基，17.7至22.2重量% (10.6至15.1莫耳%)N-硫酸化，6-O-硫酸化(NS6S)雙醣基，8.4至10.9重量%(12.0至13.8莫耳%) N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及3.1至8.1重量% (5.0至12.2莫耳%) NS雙醣基。在相關實施例中，剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化，NAc (6S)及2-O-硫酸化，6-O-硫酸化，NAc (2S6S)雙醣基或由其組成。在另一實施例中，第三中間物(NS2S6S)包含不大於10重量%之選自(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及/或(d) 2S6S的總微量雙醣序列。較佳地，該第三中間物不含有3S雙醣基。在一些實施例中，第三中間物可包含41.5至45.5%或42至45%或42.5至44.5%或43至44%之NS2S6S雙醣基，8.5至12.5%或9至12%或9.5至11.5%或10至11%之NS6S雙醣基，12至15%或12.5至14.5%或13至14%之NS2S雙醣基及14.6至18.6%或15.1至18.1%或15.6至17.6%或16.1至17.1%之NS雙醣基。剩餘物可包含一或多個(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及(d) 2S6S或由其組成。第三中間物中0S、6S、2S及/或2S6S基之組合量可構成14.4至17.4%或14.9至16.9%或15.4至16.4%之第三中間物。較佳地，該第三中間物不含有3S雙醣基。在一些實施例中，第三中間物可包含51.3至60.3%或51.8至59.8%或52.3至59.3%或52.8至58.8%之NS2S6S雙醣基，8.6至13.5%或9.1至13%或9.6至12.5%或10.1至12%之NS6S雙醣基，10至15.8%或10.5至15.3%或11至14.8%或11.5至14.3%之NS2S雙醣基及7.4至15.2%或7.9至14.7%或8.4至14.2%或8.9至13.7%或8.9至9.9%或11.7至13.7%之NS雙醣基。剩餘物可包含一或多個(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及(d) 2S6S或由其組成。在一些實施例中，2S6S基可能不會存在於第三中間物中。第三中間物中0S、6S、2S及/或2S6S基之組合量可構成7.3至11.6%或7.8至11.1%或8.3至10.6%之第三中間物。較佳地，該第三中間物不含有3S雙醣基。在一些實施例中，第三中間物可包含41.5至65.7%或42至65.2%或42.5%至64.7%或43至64.2%之NS2S6S雙醣基，4.1至23.3%或4.6至22.8%或5.1%至22.3%或5.6至21.8%之NS6S雙醣基，10至28.6%或10.5至28.1%或11至27.6%或11.5至27.1%或11.1至17.8%或19至27.6%之NS2S雙醣基及0.4至15.9%或0.7至15.4%或1至14.9%或1至14.4%或0.4至5.5%或10.2至14.9%之NS雙醣基。剩餘物可包含(a) 0S；(b) 6S；(c) 2S；及(d) 2S6S中之一或多者或由其組成。在一些實施例中，2S6S基可能不會存在於第三中間物中。第三中間物中0S、6S、2S及/或2S6S基之組合量可構成5.3至9.7%或5.8至9.2%或6.3至8.7%之第三中間物。較佳地，該第三中間物不含有3S雙醣基。第三中間物之分子量性質可適於形成生合成肝素，該生合成肝素可滿足使用例如以下所揭示之任一方法的豬USP肝素的分子量規格。第三中間物可適於形成具有與豬USP肝素符合之尺寸及活性要求的肝素。換言之，第三中間物可以使得具有與豬USP肝素符合之尺寸及活性要求的肝素可得以形成。舉例而言，第三中間物可具有適於形成具有與豬USP肝素符合之尺寸及活性要求的最終肝素產物的重量平均分子量。換言之，第三中間物可以使得具有與豬USP肝素符合之尺寸及活性要求的肝素可得以形成。第三中間物中NS2S6S及NS6S雙醣基之有效量可以使得具有與USP肝素符合之尺寸及活性要求的肝素可得以形成。可能的是，第一、第二及第三中間物中無一者具有抗凝血活性。此等中間物中無一者可在自然界中發現。本發明申請人已能夠使用以上所揭示之三種中間物獲得肝素，該肝素可為具有與豬USP肝素符合之尺寸及活性要求的生物等效USP肝素。亦提供製備可與豬USP肝素生物等效之肝素的方法。一個實施例可為一種自第三中間物NS2S6S產生可與豬USP肝素生物等效之肝素的方法。在某些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得如上文所揭示之醣胺聚醣第三中間物NS2S6S；及 (b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理第三中間物NS2S6S以產生可與豬USP肝素鈉生物等效的肝素。在一些實施例中，第三中間物NS2S6S之處理可在PAPS再循環系統存在下實施，其可包含對硝基苯硫酸(PNPS)及PAPS。PAPS再循環系統可進一步包含催化劑，諸如芳基轉磺酶IV (AST-IV)，其可用於使用對硝基苯硫酸(PNPS)作為硫酸鹽供體催化PAP至PAPS的轉換，其中基於藉由3OST-1酶莫耳轉換第三中間物NS2S6S的反應中具有足夠的PNPS。在一些實施例中，處理可在無PAPS再循環系統下實施，其在基於藉由3OST-1酶莫耳轉換第三中間物NS2S6S的反應中具有足夠的PAPS。在一些實施例中，處理可在3OST-1酶存在下在緩衝液2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)反應緩衝液中實施。可使用此項技術中彼等已知之其他適合的緩衝液及緩衝液濃度，諸如磷酸鹽緩衝液。可存在硫酸鹽供體，諸如PAPS或PAP加PNPS。緩衝液可具有7.0至7.4，諸如約7.2之pH值。處理可在諸如30℃至45℃或33℃至42℃或35℃至40℃之高溫下進行。較佳地，為了處理，使用新鮮酶類，諸如3OST-1。酶類可經固定或呈溶液。在處理之後，含有生合成肝素之處理產物可經純化以移除反應後化合物，諸如PAP、PAPS、PNPS及/或PNP。在一些實施例中，所產生之生合成肝素可使用層析方法純化，諸如強陰離子交換層析(Strong Anion Exchange chromatography)，其可含有諸如(例如)Q瓊脂糖樹脂之陰離子交換樹脂。所產生之生合成肝素可於鹽溶液中結合至該樹脂，該鹽溶液可為例如NaCl溶液。經純化之生合成肝素可隨後去鹽且濃縮。在一些實施例中，若所期望活性，抗凝血活性及/或抗IIa活性在所產生肝素中未達成，則處理可重複以產生具有所期望活性之肝素。舉例而言，最初所產生之肝素可具有小於0.9(諸如在0.6至0.9或0.7至0.9內之值)或大於1.1(諸如在1.1至1.5或1.1至1.4或1.1至1.3或1.1至1.2範圍內的值)之對因子Xa與因子IIa的活性比率(亦即抗Xa/抗IIa)，用3OST-1處理可重複以產生具有0.9至1.1或約1.0之對因子Xa與因子IIa的活性比率(亦即抗Xa/抗IIa)的肝素。舉例而言，在一些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得醣胺聚醣，其較佳不含有3S雙醣基，然而包含： (i) 57.4至62.0重量%之N-硫酸化，2-硫酸化，6-硫酸化(TriS)雙醣基； (ii) 17.7至22.2重量%之N-硫酸化，6-硫酸化(NS6S)雙醣基； (iii) 8.4至10.9重量%之N-硫酸化，2-硫酸化(NS2S)雙醣基；及 (iv) 3.1至8.1重量%之N-硫酸化(NS)雙醣基；及 (v) 視情況，含有微量雙醣基0S、2S、6S及2S6S之N-乙醯化葡糖胺殘餘物的組合，其包含其餘部分； (b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理醣胺聚醣以生成可與USP肝素生物等效的生合成肝素。在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物可轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物以獲得肝素，該肝素可具有不低於或大於180單位/mg之抗IIa活性及0.85至1.15或0.9至1.1或約1.0之抗Xa/抗IIa比率。在一些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得醣胺聚醣，其較佳不含有3S雙醣基，然而包含： (i) 30至74%或31至73%或36至70%或40至67%或40至66%或42至65%或44至64%或42至45%或48至65%之NS2S6S雙醣基， (ii) 5至40%或5至32%或5至26%或5至23%或5至7%或8至16%或18至23%或6至39%或6至32%或6至26%或6至21%之NS6S雙醣基， (iii) 1至28%或1至27%或4至28%或4至27%或8至28%或8至27%或10至28%或11至28%或12至27%或11至22%或19至27%之NS2S雙醣基， (iv) 0.5至23%或0.5至20%或0.5至19%或0.5至18%或0.5至17%或1至21%或1至19%或1至18%或1至17%或1至15%之NS雙醣基，及 (v) 視情況，一或多種包含醣胺聚醣之剩餘物的雙醣基0S、2S、6S及2S6S； (b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理醣胺聚醣以生成可與USP肝素生物等效的生合成肝素。在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物可轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物以獲得肝素，該肝素可具有不低於或大於180單位/mg之抗IIa活性及0.85至1.15或0.9至1.1或約1.0之抗Xa/抗IIa比率。在一些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得醣胺聚醣，其較佳不含有3S雙醣基，然而包含： (i) 41.5至45.5%或42至45%或42.5至44.5%或43至44%之NS2S6S雙醣基， (ii) 8.5至12.5%或9至12%或9.5至11.5%或10至11%之NS6S雙醣基， (iii) 12至15%或12.5至14.5%或13至14%之NS2S雙醣基， (iv) 14.6至18.6%或15.1至18.1%或15.6至17.6%或16.1至17.1%之NS雙醣基及 (v) 視情況，一或多種包含醣胺聚醣之剩餘物的基團0S、2S、6S及2S6S； (b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理醣胺聚醣以生成可與USP肝素生物等效的生合成肝素。在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物可轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物以獲得肝素，該肝素可具有不低於或大於180單位/mg之抗IIa活性及0.85至1.15或0.9至1.1或約1.0之抗Xa/抗IIa比率。在一些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得醣胺聚醣，其較佳不含有3S雙醣基，然而包含： (i) 51.3至60.3%或51.8至59.8%或52.3至59.3%或52.8至58.8%之NS2S6S雙醣基， (ii) 8.6至13.5%或9.1至13%或9.6至12.5%或10.1至12%之NS6S雙醣基， (iii) 10至15.8%或10.5至15.3%或11至14.8%或11.5至14.3%之NS2S雙醣基， (iv) 7.4至15.2%或7.9至14.7%或8.4至14.2%或8.9至13.7%或8.9至9.9%或11.7至13.7%之NS雙醣基及 (v) 視情況，一或多種包含醣胺聚醣之剩餘物的雙醣基0S、2S、6S及2S6S； (b)在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理第三中間物NS2S6S以生成可與USP肝素生物等效的生合成肝素。在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物可轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物以獲得肝素，該肝素可具有不低於或大於180單位/mg之抗IIa活性及0.85至1.15或0.9至1.1或約1.0之抗Xa/抗IIa比率。在一些實施例中，該方法可包含： (a) 獲得醣胺聚醣，其較佳不含有3S雙醣基，然而包含： (i) 41.5至65.7%或42至65.2%或42.5%至64.7%或43至64.2%之NS2S6S雙醣基， (ii) 4.1至23.3%或4.6至22.8%或5.1%至22.3%或5.6至21.8%之NS6S雙醣基， (iii) 10至28.6%或10.5至28.1%或11至27.6%或11.5至27.1%或11.1至17.8%或19至27.6%之NS2S雙醣基， (iv) 0.4至15.9%或0.7至15.4%或1至14.9%或1至14.4%或0.4至5.5%或10.2至14.9%之NS雙醣基及 (v) 視情況，一或多種包含醣胺聚醣之剩餘物的雙醣基0S、2S、6S及2S6S； (b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理醣胺聚醣以生成可與USP肝素生物等效的生合成肝素。在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物可轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物以獲得肝素，該肝素可具有不低於或大於180單位/mg之抗IIa活性及0.85至1.15或0.9至1.1或約1.0之抗Xa/抗IIa比率。另一實施例可為一種製備如上文所揭示之第一中間物NS的方法。該方法可包含獲得肝素前體，且隨後將肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物NS中N-硫酸化(NS)雙醣基的量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。在另一實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中使肝素前體與鹼性水溶液(諸如含水氫氧化鈉或含水氫氧化鉀)反應且使用N-轉磺酶催化劑以磷酸腺苷磷酸硫酸(PAPS) N-磺化。N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物NS中N-硫酸化(NS)雙醣基的量。在另一實施例中，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應至肝素前體中之N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物NS中N-硫酸化(NS)雙醣基的量。在各方法中，可為較佳的是，化學或酶N-磺化之後剩餘的未經取代之胺基的數目應不大於可見於豬USP肝素鈉中未經取代之胺基的數目，每鏈一個或更少個(T. Toida, H. Yoshida, H. Toyoda, I. Koshiishi, T. Imanari, R.E. Hileman, J.R. Fromm, R.J. Linhardt, Biochemical Journal, 322, 499-506, 1997)。所產生之第一中間物之NS基的量可藉由控制化學或酶過程得以控制。(Z. Wang等人(2011),Journal of Biotechnology , 156, 188-196; A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, PhD dissertation, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY, USA)。第一所產生中間物之分子量性質可以使得其適合於使用例如以下所揭示之方法中之一者形成滿足豬USP肝素之分子量規格的生合成肝素。用於本發明之方法中的肝素前體可為例如使用細菌所產生的肝素前體，諸如大腸桿菌 (E . coli )或多殺巴斯德菌 。舉例而言，肝素前體可產生自E . coli K5或E . coli Nissle 1917。在產生第一中間物之前，肝素前體可如揭示於(例如)Z. Wang等人(2011),Journal of Biotechnology , 156, 188-196中N-去乙醯化及解聚合。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含84.7至93.8重量%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中84.7至93.8重量%之殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應將肝素前體中84.7至93.8重量%之N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以使肝素前體中84.7至93.8重量%之N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換以產生第一中間物NS。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含78至99.5%或78至99%或81至97%或83至95%或84至94%或85至93%或84至87%或85至86%或87.5至94%或90至93.5%或90.5至93%或90.3至91.3%或92.2至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中一定量的N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體，該量對應於第一中間物中NS基之量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含83.4至87.4%或83.9至86.9%或84.4至86.4%或84.9至85.9%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體，該量對應於第一中間物中NS基之量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。所產生之第一中間物NS可具有足以經由本方法轉換以得到具有合適分子量性質的BSH的重量平均分子量。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含87.9%至92.9%或88.4%至92.4%或88.9%至91.9%或89.4%至91.4%或89.9%至90.9%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換一定量肝素前體中N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體，該量對應於第一中間物中NS基之量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)的N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以得到第一中間物NS。所產生之第一中間物NS可具有足以經由本方法轉換以得到具有合適分子量性質的BSH的重量平均分子量。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含88.8至94.7%或89.3%至94.2%或89.8至93.7%或90.3%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體，該量對應於第一中間物中NS基之量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含88.8至92.8%或89.3至92.3%或89.8至91.8%或90.3至91.3%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體。在相關實施例中，第一中間物NS可由肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量(該量對應於第一中間物中NS基之量)N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS。在一些實施例中，將肝素前體轉換成第一中間物可涉及獲得或製備肝素前體溶液。溶液可具有0.05至12%或0.1至10%或0.1至5%或0.1至3%或0.5至2%之濃度的肝素前體。溶劑可為例如水或水基溶劑。因此，溶液可為水溶液。溶液可與鹼反應，諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀。反應可在高溫下，諸如30至70℃或40至65℃或50至55℃下進行。隨後酸(諸如HCl)可添加至反應混合物以將pH值調節至約7。產物墊曝露於N-磺化反應，其可例如使用一或多種N-磺化試劑進行，可為例如三氧化硫或硫三氧化硫錯合物，諸如硫胺錯合物。硫胺錯合物之非限制性實例包括硫三烷基胺錯合物，諸如硫三甲胺錯合物、三氧化硫二甲基乙胺錯合物及三氧化硫甲基二乙胺錯合物，以及含三氧化硫-胺的芳基錯合物，諸如三氧化硫-吡啶錯合物。隨後，N-磺化產物可分級分離以得到所期望之分子量性質。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含90.1至94.7%或90.6至94.2%或91.1%至93.7%或91.6%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS的方法。第一中間物NS之剩餘物可為微量未修飾之N-乙醯化葡糖胺(NAc) (0S)雙醣基。該方法可包含轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生N-去乙醯化，N-硫酸化的肝素前體，該量對應於第一中間物中NS基之量。在相關實施例中，第一中間物NS可自肝素前體製備，其中藉由在合適條件下使肝素前體與化學試劑、含水氫氧化鈉及磺化試劑(諸如三乙胺-三氧化硫錯合物)反應以將肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物(該量對應於第一中間物中NS基之量)轉換成N-磺酸基葡糖胺殘餘物，從而得到第一中間物NS。可替代地，肝素前體可與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應以轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物(該量對應於第一中間物中NS基之量)以得到第一中間物NS。另一實施例可為一種製備如上所揭示之第二中間物NS2S的方法。該方法可包含(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS (N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物NS中N-硫酸化(NS)雙醣基的量)，且隨後(b)用酶(C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。在一些實施例中，第二中間物之鏈長可不明顯地不同於第一中間物之鏈長。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。肝素前體至第一中間物的轉換可如上文所論述進行。在一些實施例中，處理可在PAPS再循環系統存在下進行，該系統可包含對硝基苯硫酸(PNPS)及PAPS。PAPS再循環系統可進一步包含催化劑，諸如芳基轉磺酶IV (AST-IV)，其可用於使用PNPS作為硫酸鹽供體在基於藉由C5-epi及2OST酶類之第一中間物的莫耳轉換反應中催化PAP至PAPS的轉換。在一些實施例中，處理可在無PAPS再循環系統下實施，但在基於第一中間物NS2S6S的莫耳轉化的反應中具有足夠量的PAPS。在一些實施例中，處理可例如在緩衝液中進行，諸如2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)反應緩衝液。熟習此項技術者已知之其他適合的緩衝液及緩衝液濃度可在C5 epi及2OST酶類存在下使用。可存在硫酸鹽供體，諸如PAPS或PAP加PNPS。緩衝液可具有7.0至7.4，諸如約7.2之pH值。(處理可在高溫下，諸如30至45℃或33至42℃或35至40℃下進行。較佳地，為了處理，使用諸如C5 epi及/或2OST之新鮮酶類。酶類可經固定或呈溶液。在處理之後，含有第二中間物之處理產物可純化以移除反應後化合物，諸如PAP、PAPS、PNPS及/或PNP。經純化第二中間物可收集且濃縮以用於進一步使用，諸如分析及/或產生第三中間物。在一些實施例中，若所期望雙醣特徵(諸如NS2S百分比)在由於處理所產生之醣胺聚醣中未達成，則處理可重複以產生具有雙醣特徵之醣胺聚醣，諸如第二中間物所期望之NS2S百分比。舉例而言，在一些實施例中，該方法可為一種製備包含73.8至75.3重量%之N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)雙醣基及18.5至20.2重量%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中84.7至93.8重量%之N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS，及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含44至80%或45至79%或50至78%或50至77%或55至78%或55至76%或58至77%或59至76%或60至75%或58至62%或59至61%或65至77%之NS2S雙醣基及12至40%或13至39%或15至34%或15至29%或16至29%或17至25%或16至26%或16至18%或19至26%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含78至99.5%或78至99%或81至97%或83至95%或84至94%或85至93%或84至87%或85至86%或87.5至94%或90至93.5%或90.5至93%或90.3至91.3%或92.2至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量；及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含57.5至62.5%或58至62%或58.5至61.5%或59至61%或59.5至60.5%之NS2S雙醣基及23.2至27.2%或23.7至26.7%或24.2至26.2%或24.7至25.7%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含83.4至87.4%或83.9至86.9%或84.4至86.4%或84.9至85.9%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含65.8至77.4%或66.3至76.9%或66.8至76.4%或67.3至75.9%之NS2S雙醣基及14.8至26%或15.3至25.5%或15.8至25%或16.3至24.5%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含88.8至94.7%或89.3%至94.2%或89.8至93.7%或90.3%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中NS基團之量)；及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含65.8至74.4%或66.3至73.9%或66.8至73.4%或67.3至72.9%之NS2S雙醣基及17.9至26%或18.4至25.5%或18.9至25%或19.4至24.5%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含88.8至92.8%或89.3至92.3%或89.8至91.8%或90.3至91.3%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。在一些實施例中，該方法可為一種製備包含73.4至77.4%或73.9至76.9%或74.4至76.4%或74.9至75.9%之NS2S雙醣基及14.8至18.8%或15.3至18.3%或15.8至17.8%或16.3至17.3%之NS雙醣基的第二中間物NS2S的方法。第二中間物NS2S中之剩餘物可包含微量未修飾之NAc (0S)雙醣基及/或2-O-硫酸化，NAc (2S)雙醣基或由其組成。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含90.1至94.7%或90.6至94.2%或91.1%至93.7%或91.6%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中NS基團之量)；及(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S。較佳地，處理涉及C5-epi與2OST酶類兩者。另一實施例可為一種製備如上所揭示之第三中間物NS2S6S的方法。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS(N-乙醯基葡糖胺殘餘物的經轉換量可對應於第一中間物中N-硫酸化(NS)雙醣基之量)；(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理該第一中間物NS以產生第二中間物NS2S及(c) 在硫酸鹽供體(諸如磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS))存在下用酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。轉換肝素前體以產生第一中間物及第一中間物之處理可如上文所揭示來進行。在一些實施例中，處理可在PAPS再循環系統存在下進行，該系統可包含對硝基苯硫酸(PNPS)及PAPS。PAPS再循環系統可進一步包含諸如芳基轉磺酶IV (AST-IV)之催化劑，其可用於使用PNPS作為硫酸鹽供體催化PAP至PAPS的轉換，其中在基於藉由酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))之第二中間物的莫耳轉換反應中具有足夠量的PNPS。在一些實施例中，處理可在無PAPS再循環系統下實施，但在基於藉由諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3)之酶的第二中間物的分子轉換反應中具有足夠量的PAPS。在一些實施例中，處理可在6OST-1及6OST-3酶類存在下在緩衝液中進行，諸如2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)反應緩衝液。可存在硫酸鹽供體，諸如PAPS或PAP加PNPS。緩衝液可具有7.0至7.4，諸如約7.2之pH值。處理可在諸如30至45℃或33至42℃或35至40℃之高溫下進行。較佳地，為了處理，使用諸如6OST-1及/或6-OST-3之新鮮酶類。酶類可經固定或呈溶液。在處理之後，含有第三中間物之處理產物可經純化以移除反應後化合物，諸如PAP、PAPS、PNPS及/或PNP。經純化第三中間物可濃縮且收集以用於進一步使用，諸如分析及/或產生生合成肝素。在一些實施例中，若所期望雙醣特徵(諸如NS2S6S及NS6S百分比)在由於第二中間物NS之處理所產生之醣胺聚醣中未達成，則處理可重複以產生具有雙醣特徵之醣胺聚醣，諸如第三中間物所期望之NS2S6S及NS6S百分比。舉例而言，在一些實施例中，方法可為一種製備包含57.4至62.0重量%之N-硫酸化，2-O-硫酸化，6-O-硫酸化(NS2S6S)的雙醣基，17.7至22.2重量%之N-硫酸化，6-O-硫酸化(NS6S)雙醣基，8.4至10.9重量%之N-硫酸化，2-O-硫酸化(NS2S)的雙醣基及3.1至8.1重量%之NS雙醣基的第三中間物NS2S6S的方法。第三中間物NS2S6S之剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc (6S) 2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc (2S6S)雙醣基中之一或多者或由其組成。第三中間物較佳不含有3S雙醣基。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中84.7至93.8重量% N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生第一中間物NS；(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理第一中間物NS以產生第二中間物NS2S；及(c) 在硫酸鹽供體(諸如磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS))存在下用酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。在一些實施例中，該方法可為一種製備第三中間物NS2S6S的方法，該第三中間物NS2S6S包含30至74%或31至73%或36至70%或40至67%或40至66%或42至65%或44至64%或42至45%或48至65%之NS2S6S雙醣基，5至40%或5至32%或5至26%或5至23%或5至7%或8至16%或18至23%或6至39%或6至32%或6至26%或6至21%之NS6S雙醣基，1至28%或至1至27%或4至28%或4至27%或8至28%或8至27%或10至28%或11至28%或12至27%或11至22%或19至27%之NS2S雙醣基；及0.5至23%或0.5至20%或0.5至19%或0.5至18%或0.5至17%或1至21%或1至19%或1至18%或1至17%或1至15%之NS雙醣基。第三中間物NS2S6S之剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc (6S) 2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc (2S6S)雙醣基中之一或多者或由其組成。第三中間物較佳不含有3S雙醣基。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含78至99.5 %或78至99%或81至97%或83至95%或84至94%或85至93%或84至87%或85至86%或87.5至94%或90至93.5%或90.5至93%或90.3至91.3%或92.2至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的中間物NS (N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理第一中間物NS以產生包含44至80%或45至79%或50至78%或50至77%或55至78%或55至76%或58至77%或59至76%或60至75%或58至62%或59至61%或65至77%之NS2S雙醣基及12至40%或13至39%或15至34%或15至29%或16至29%或16至26%或17至25%或16至18%或19至26%之NS雙醣基的第二中間物NS2S；及(c)在硫酸鹽供體(諸如磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS))存在下用酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。在一些實施例中，該方法可為一種製備第三中間物NS2S6S之方法，該第三中間物NS2S6S包含41.5至45.5%或42至45%或42.5至44.5%或43至44%之NS2S6S雙醣基，8.5至12.5%或9至12%或9.5至11.5%或10至11%之NS6S雙醣基，12至15%或12.5至14.5%或13至14%之NS2S雙醣基及14.6至18.6%或15.1至18.1%或15.6至17.6%或16.1至17.1%之NS雙醣基。第三中間物NS2S6S之剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc (6S) 2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc (2S6S)雙醣基中之一或多者或由其組成。第三中間物較佳不含有3S雙醣基。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含83.4至87.4%或83.9至86.9%或84.4至86.4%或84.9至85.9%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS (N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理第一中間物NS以產生包含57.5至62.5%或58至62%或58.5至61.5%或59至61%或59.5至60.5%之NS2S雙醣基及23.2至27.2%或23.7至26.7%或24.2至26.2%或24.7至25.7%之NS雙醣基的第二中間物NS2S；及(c) 在硫酸鹽供體(諸如磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS))存在下用酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。在一些實施例中，該方法可為一種製備第三中間物NS2S6S之方法，該第三中間物NS2S6S包含51.3至60.3%或51.8至59.8%或52.3至59.3%或52.8至58.8%之NS2S6S雙醣基，8.6至13.5%或9.1至13%或9.6至12.5%或10.1至12%之NS6S雙醣基，10至15.8%或10.5至15.3%或11至14.8%或11.5至14.3%之NS2S雙醣基及7.4至15.2%或7.9至14.7%或8.4至14.2%或8.9至13.7%或8.9至9.9%或11.7至13.7%之NS雙醣基。第三中間物NS2S6S之剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc (6S) 2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc (2S6S)雙醣基中之一或多者或由其組成。第三中間物較佳不含有3S雙醣基。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含88.8至94.7%或89.3%至94.2%或89.8至93.7%或90.3%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS (N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；(b) 在硫酸鹽供體(諸如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理第一中間物NS以產生包含65.8至74.4%或66.3至73.9%或66.8至73.4%或67.3至72.9%之NS2S雙醣基及17.9至26%或18.4至25.5%或18.9至25%或19.4至24.5%之NS雙醣基的第二中間物NS2S；及(c) 在硫酸鹽供體(諸如磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS))存在下用酶(諸如6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3))處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。在一些實施例中，該方法可為一種製備第三中間物NS2S6S之方法，該第三中間物NS2S6S包含41.5至65.7%或42至65.2%或42.5%至64.7%或43至64.2%之NS2S6S雙醣基，4.1至23.3%或4.6至22.8%或5.1%至22.3%或5.6至21.8%之NS6S雙醣基，10至28.6%或10.5至28.1%或11至27.6%或11.5至27.1%或11.1至17.8%或19至27.6%之NS2S雙醣基及0.4至15.9%或0.7至15.4%或1至14.9%或1至14.4%或0.4至5.5%或10.2至14.9%之NS雙醣基。第三中間物NS2S6S之剩餘物可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc (6S) 2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc (2S6S)雙醣基中之一或多者或由其組成。第三中間物較佳不含有3S雙醣基。此方法可包含：(a)轉換肝素前體中一定量N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含90.1至94.7%或90.6至94.2%或91.1%至93.7%或91.6%至93.2%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一中間物NS (N-乙醯基葡糖胺殘餘物之經轉換量可對應於第一中間物中NS基之量)；(b) 在硫酸鹽供體(3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS))存在下用酶(諸如C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST))處理第一中間物NS以產生包含65.8至77.4%或66.3至76.9%或66.8至76.4%或67.3至75.9%之NS2S雙醣基及14.8至26%或15.3至25.5%或15.8至25%或16.3至24.5%之NS雙醣基的第二中間物NS2S；及(c) 在磷酸腺苷磷酸硫酸鹽(PAPS)存在下用6-O-轉磺酶1及3 (6OST-1,3)處理第二中間物NS2S以產生第三中間物NS2S6S。另一實施例可為一種製備可與UPS肝素生物等效之肝素的方法，其包含在硫酸鹽供體(諸如PAPS)存在下用諸如3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)之酶處理如上文所揭示之第三中間物NS2S6S以將葡糖胺殘餘物之3-羥基轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物，由此產生可與豬UPS肝素鈉生物等效之肝素。在與2OST，3OST-1，6OST-1或6OST-3中之一個或兩個的前述轉磺酶反應中，酶類可能需要硫酸鹽供體，其典型地為PAPS及再生系統。一或多種酶類，諸如2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3中之一個或兩個及硫酸鹽供體諸如PAPS可呈溶液。酶類可經固定。在一些實施例中，反應活體外進行。在其他實施例中，一或多個步驟在用於NDST、C5-Epi、2OST、3OST-1中之一或多者，6OST-1或6OST-3中之一者及PAPS來源的微生物宿主編碼基因內部進行。儘管以上所揭示之方法可產生與豬USP肝素生物等效之肝素，在一些實施例中，所產生之肝素可以使得其不滿足豬USP肝素之生物等效性的一或多個要求。在一些實施例中，所產生之肝素批次可滿足豬USP肝素對於分子量及抗凝血活性的要求，然而不滿足豬USP肝素對於抗IIa活性的要求。舉例而言，所產生之肝素批次可滿足豬USP肝素對於分子量及抗凝血活性的要求，同時具有小於0.9(諸如0.5至0.9或0.6至0.9或0.7至0.9範圍內之值)或大於1.1(諸如1.1至1.5或1.1至1.4或1.1至1.3或1.1至1.2範圍內之值)之因子Xa與因子IIa的活性比率(亦即抗Xa/抗IIa)。該批次用額外酶處理，諸如用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理可轉換為可與豬USP肝素生物等效之肝素批次，該處理可在硫酸鹽供體(諸如PAPS)存在下進行。在一些實施例中，所產生之肝素批次可滿足豬USP肝素對於抗凝血活性的要求，然而不滿足豬USP肝素對於抗IIa活性及分子量的要求。舉例而言，所產生批次可具有小於0.9(諸如0.5至0.9或0.6至0.9或0.7至0.9內之值)或大於1.1(諸如1.1至1.5或1.1至1.4或1.1至1.3或1.1至1.2範圍內之值)之因子Xa與因子IIa的活性比率(亦即抗Xa/抗IIa)且使用額外酶處理，諸如用3-O-轉磺酶同功異構物1 (3OST-1)處理，該處理可在硫酸鹽供體(諸如PAPS)存在下進行以提供滿足豬USP肝素對於抗IIa活性之要求的因子Xa與因子IIa的活性比率。儘管所產生之肝素可與豬USP肝素生物等效，但在一些實施例中，所產生肝素可與天然產生之肝素(諸如牛或豬肝素)物理上不同，仍與豬USP肝素生物等效。舉例而言，本發明方法可允許產生可與豬USP肝素生物等效之肝素批次，從而使得所產生批次相比於天然產生之肝素批次(諸如自來牛腸之肝素批次)在a)化學組成，b)分子量，諸如重量平均分子量，及c)分子量分佈中之一或多個方面彼此間更為一致或均一。本發明方法可產生至少50 mg或至少80 mg或至少100 mg或至少200 mg或至少1 g或至少2g的肝素批次。所產生批次在分子量、雙醣組成及生物活性方面彼此之間可為一致的。以上所鑑別規模之所產生批次皆可滿足豬USP肝素的要求，諸如分子量、雙醣組成及生物活性要求。恆定批次之數量可為至少2或至少3或至少5或至少7或至少10或至少12或至少15或至少20。本發明亦提供一種包含使用上述所揭示方法所產生之生物等效肝素的醫藥組合物。醫藥組合物亦可包括一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，肝素可例如調配於水中或等張生理食鹽水或葡萄糖中。在一些實施例中，肝素組合物可包括一或多種防腐劑，諸如亞硫酸氫鹽或抗菌劑，諸如苄醇。在一些實施例中，根據本發明所產生之生物等效肝素可以醫藥學上可接受之鹽的形式使用，該鹽可為例如鈉鹽或鉀鹽。醫藥上可接受鹽之非限制性實例包括鋰、鈉、鈣、鋇、鉀、鎂及銨。在一些實施例中，以上根據本發明所產生之生物等效肝素可用作製備低分子量肝素的起始材料。此可例如藉由僅僅用根據本發明所產生之生物等效肝素替換豬腸肝素，且隨後使用用於合成低分子量肝素之已知方法中之一者進行。在一個實施例中，根據本發明所產生之生物等效肝素的鹽(諸如鈉鹽或鉀鹽)可轉化成苄索銨鹽，其隨後可苯甲基化且用諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀之鹼處理以部分解聚合。所得低分子量肝素產物會轉化成鹽，諸如鈉鹽或鉀鹽且予以純化。此方法可得到低分子量肝素，依諾肝素(enoxaparin)。其他方法可用於將根據本發明所產生之生物等效肝素轉換成其他低分子量肝素，諸如Δ肝素(daltaparin)或亭紮肝素(tinzaparin)。本發明亦包括稀化個體(諸如人類)內血液的方法，包含使用上文所揭示方法中之一者產生生物等效肝素，且向個體投與有效量之所產生生物等效肝素。本發明亦包括一種治療及/或預防對肝素敏感之疾病或病況的方法，包含使用上文所揭示方法中之一者產生生物等效肝素，及向個體(諸如人類)投與有效量之所產生生物等效肝素。此類疾病或病況之非限制性實例包括深靜脈、血栓、肺栓塞及動脈血栓栓塞。生物等效肝素亦可用於包括用於患有腎衰竭之患者的腎臟滲析的體外療法中，或用於在開放心臟手術中進行心肺繞通之患者的血液充氧中。生物等效肝素之有效量可意指可足以產生所期望效應的量，諸如稀化血液或治療對肝素敏感的疾病或病況。生物等效肝素之劑量可與用於天然產生之USP肝素(諸如豬或牛肝素)的劑量相同。生物等效肝素可使用多種投與模式投與。在一些實施例中，生物等效肝素可非經腸投與。舉例而言，生物等效肝素可經靜脈內、皮下或肌內注射。本發明亦提供一種包含如上文所揭示之第一中間物NS的組合物。該組合物可包含至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%或至少99.5%之第一中間物NS。除第一中間物NS以外，組合物可無或實質上無任何多醣。術語「實質上無」可意指任何其他多醣無法以可量測到的量來偵測。偵測方法可包括核磁共振(NMR)波譜學或用三種肝素解離酶處理，分解肝素或肝素中間物至可經由滲析或尺寸排外層析法移除的雙醣。其他非肝素或非肝素中間物會耐受肝素解離酶處理且可使用習知方法(諸如NMR波譜學)回收及偵測。本發明亦提供一種包含如上所揭示之第二中間物NS2S的組合物。該組合物可包含至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%或至少99.5%之第二中間物NS2S。除第二中間物NS2S以外，套組或組合物可無或實質上無任何多醣。本發明亦提供一種包含如上所揭示之第三中間物NS2S6S的組合物。該套組或組合物可包含至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%或至少96%或至少97%或至少98%或至少99%或至少99.5%之第三中間物NS2S6S。除第三中間物NS2S6S以外，套組或組合物可無或實質上無任何多醣。舉例而言，在一些實施例中，套組或組合物可為無或實質上無肝素。本文所述之實施例進一步藉由以下實施例(儘管絕不限於以下實施例)說明。實例實例1：肝素前體之產生。大腸桿菌 K5(Serovar O10:K5:H4; ATCC #23506)或大腸桿菌 Nissle 1917 (Serovar O6:K5:H1)用於肝素前體產生(Cress, B. F., Toparlak, O. D., Guleria, S., Lebovich, M., Stieglitz, J. T., Englaender, J. A., Jones, J. A., Linhardt, R. J.,及Koffas, M. A. G. (2015) CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.ACS Synthetic Biology .4 , 987-1000; Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S.,及Linhardt, R. J. (2010) E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.Biotechnology and Bioengineering .107 , 964-973; Wang, Z., Dordick, J. S., and Linhardt, R. J. (2011) Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering.Bioengineered bugs .2 , 63-67)。較高細胞密度饋料批次醱酵分別使用Eppendorf BioFlo 320或Biostat醱酵槽(fermenter)以5 L或45 L至90 L進行。細胞在含有葡萄糖(通常20 g/L)、單鹼性磷酸鉀(通常13.5 g/L)、磷酸銨(通常4.0 g/L)、七水合硫酸鎂(通常1.4 g/L)、檸檬酸(通常1.7 g/L)及痕量金屬溶液(通常10.0 ml/L)的葡萄糖限定的培養基(pH 6.8±0.01)中生長。5 M HCl (1.5 L)中的痕量金屬溶液由FeSO₄ ·7H₂ O (15 g)、CaCl₂ (3.0 g)、ZnSO₄ .7H₂ O (3.3 g)、MnSO₄ .H₂ O (568 mg)、CuSO₄ .5H₂ O (1.5 g)、(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ .4H₂ O (0.15 g)及Na₂ B₄ O₇ .10H₂ O (0.03 g)構成。含有葡萄糖限定培養基(pH 6.8±0.01)之晶種燒瓶(晶種I)用甘油原料接種且在旋轉搖動器上以200至250 RPM在37℃下培育8至16 h。接下來，含有葡萄糖限定培養基(pH 6.8±0.01)之晶種燒瓶(晶種II)以10%晶種I的播種密度來接種，且在旋轉搖動器上以200至250 RPM在37℃下培育8至16 h。接下來，來自晶種II之細胞在含有除菌葡萄糖限定的培養基(pH 6.8±0.01)的醱酵槽中以5至10%的播種密度接種。細胞在30%溶解氧，37℃下生長且pH值使用2N HCl/5M NH₄ OH保持在6.8±0.01處。在整個醱酵中監測溶解氧含量、pH值及細胞生長(用光密度量測，OD_600nm )。細胞按指數律成比例饋送且饋送速率受控制以保持培養物中的葡萄糖濃度及溶解氧含量，濃縮除菌饋料含有葡萄糖(700 g/L)，補充有單鹼性磷酸鉀(47 g/L)七水合硫酸鎂(20 g/L)、硫胺(0.4 g/L)及痕量金屬溶液(20 ml/L)。當OD₆₀₀ 達到135至200(通常140)時醱酵停止。上清液(含有肝素前體)在4℃下藉由離心收集。來自培養物上清液之肝素前體的純化方法包括用1.2 (%，w / w )之次氯酸鈉漂白且通常60%飽和之硫酸銨沈澱。沈澱溶解於水中且滲析以獲得肝素前體(Bhaskar, U. Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative. PhD dissertation, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY, USA (2014))。實例2：中間物#1 (NS)之產生。由實例1獲得之肝素前體如先前所報導化學上N-去乙醯化且解聚合(Z. Wang, J. Li, S. Cheong, U. Bhaskar, A. Onishi, F. Zhang, J. S. Dordick, R. J. Linhardt (2011), Response surface optimization of the heparosan N-deacetylation in producing bioengineered heparin, Journal of Biotechnology, 156, 188-196)。1%濃度之肝素前體與1M氫氧化鈉在50℃至55℃下反應18至28 h。隨後，反應混合物用HCl調節至pH 7，接著藉由過量三氧化硫三甲胺錯合物化學N-磺化48 h。隨後，乙醇沈澱用於分級分離具有所期望分子量性質的第一中間物NS(A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, PhD dissertation, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY, USA)。第一中間物NS之NS雙醣基含量為78.3至99.3莫耳%。分子量為15,100至18,100 Da，具有大於24,000之分子量的肝素多醣鏈百分比為7,0至17.4；具有16,000至24,000 Da分子量範圍的鏈百分比為1.1至2.3。實例3：雙醣分析，及分子量分析，及活性分析。整體雙醣分析 雙醣分析用於量測豬USP肝素或生物工程化肝素中間物之雙醣組成。樣品藉由用肝素酶I、II及III處理消化成八個組成性雙醣。所產生之雙醣隨後分離且藉由高壓液相層析-紫外線(HPLC-UV)光譜測定法來量測。對於NS(第一中間物)而言，¹ H-核磁共振(NMR)波譜學亦可用於定量兩種組成性雙醣(亦即0S及NS)。儘管本發明之雙醣組成描述為莫耳%，但此項技術中熟知的是，其亦可描述為曲線下面積(AUC) %、重量%或本發明之範疇內的其他已知術語。應注意，在本發明中，假設八種雙醣在232 nm處皆具有相同的莫耳消光係數(因若干種原因被認為係合適假設)，則雙醣AUC%等於雙醣莫耳%。首先，熟知的是，八種雙醣中之每一者在結構中恰好具有一個Δ-4-5不飽和糖醛酸(ΔUA)。第二，關於肝素雙醣分析之最新論文指示，雙醣定量係基於Δ-4-5不飽和寡糖之232 nm處的莫耳消光係數恆定之資料驅動的共識假設(P. Mourier等人 Quantitative compositional analysis of heparin using exhaustive heparinase digestion and strong anion exchange chromatography. Anal. Chem. Res. 3, 46-53 (2015))。第三，在五種不同肝素衍生之寡糖(5063 +/- 10%、5331 +/-0.6%、5066 +/-3.7%、5657 +/-1.4%及5275 +/-%, M^- ¹ cm^- ¹ )中存在232 nm處莫耳消光係數的一致性(K.G. Rice及R.J. Linhardt. Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparan monosulfate lyases. Carbohydr. Res. 190, 219-233 (1989))。最後，幾乎相同的假設實際上用於當前豬USP肝素中；豬USP肝素之分析方法假設該等八種雙醣在非常接近234 nm波長處皆具有相同的莫耳消光係數(USP40 Chemical Tests, ＜207＞ Test for 1,6-Anhydro Derivative for Enoxaparin Sodium,第261-266頁(United States Pharmacopoeial Convention, Rockville, MD, USA, 2017))。在¹ H-NMR中，相對AU %等效於莫耳%。藉由 1H - NMR 之中間物分析 1D¹ H-NMR在以下條件下進行：溫度298 K、再循環延遲時間至少2-s、採集時間至少0.75 s、掃描次數至少16次，溶劑為D2O。經純化肝素前體、各中間物、生合成肝素及USP豬肝素之1D¹ H-NMR波譜展示於圖3中。自前驅體肝素前體至最終產物之化學酶修飾的四個步驟，所得生合成肝素具有相比於USP豬肝素之高度相似的化學結構。關於藉由1H-NMR之第一中間物的雙醣分析，葡糖胺殘餘物之H-1質子的峰面積用於定量。N-乙醯基葡糖胺(0S雙醣)的H-1質子在約5.31 ppm處出現，同時N-磺酸基葡糖胺(NS雙醣)之H-1質子在約5.55 ppm處出現。雙醣組成表示為莫耳%；AUC %等效於莫耳%。藉由 HPLC - UV 之雙醣分析 簡言之，分析樣品藉由肝素酶消化，且隨後所生成雙醣分離且藉由強陰離子交換(SAX)-HPLC-UV來量測。典型的分析條件如下；應注意，可應用不影響雙醣組成之非必需細微修改，諸如肝素酶消化反應之線性比例降低/比例擴大，SAX管柱溫度改變高達50℃。分析樣品(100 μg)與濃縮消化緩衝液(最終濃度為50 mM NH₄ OAc, 2 mM CaCl₂ )、來自黃桿菌屬肝素 (Flavobacterium heparinum )之肝素I、II及III(各肝素酶＞100 mIU，藉由如描述於(Zhang,F.等人Structural characterization of heparins from different commercial sources.Anal . Bioanal . Chem . 401 , 2793-2803 (2011)., Zhang Z, X.J., Liu H, Liu J, Linhardt RJ. Quantification of Heparan Sulfate Disaccharides Using Ion-Pairing Reversed-Phase Microflow High-Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Trap Mass Spectrometry.Anal . Chem . 81 , 4349-4355 (2009))中之吾等實驗室製備)及水混合，因此總體積為200 μL。混合物在35℃下培育2小時。在培育之後，所生成之雙醣藉由使用以下中之任一者與肝素酶分離：(a)用3 kDa分子量截斷離心柱超過濾(Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)或(b)在95℃下培育至少5 min，隨後離心。藉由使用第二中間物NS2S、第三中間物NS2S6S及USP肝素之直接對比研究展示(a)與(b)之間的差值至多為2.6w / w %。將20 μL之所生成雙醣注入SAX層析管柱上(Spherisorb-SAX chromatography column, 4.0×250 mm, 5 μm, Waters, France)。管柱溫度為40℃。移動相A為用磷酸調節至pH 3.0的1.8 mM NaH2PO4且移動相B為用1 M NaClO4調節至pH 3.0的1.8 mM NaH2PO4。利用0.45 mL/min之流動速率應用移動相B之線性梯度(0 min，3% B；20 min，35%；50 min，100% B；60 min，3% B，80 min，3% B)。UV偵測在232 nm處進行，因為各雙醣之不飽和糖醛酸(ΔUA)在此波長處具有UV吸收。雙醣標準購自Iduron (Manchester, UK)以鑑別在232 nm處屬於各雙醣的峰值。為確保分析之精確性及精確度，商業肝素鈉有效藥劑成份(Celsus, Cincinnati, OH, USA)亦經消化且在各分析中分析。為確保HPLC峰面積的線性，雙醣標準之一系列稀釋液在各分析中分析。雙醣組成表示為w/w%及/或莫耳%。w/w%值基於一系列商業標準之標準曲線來計算。莫耳%值由下列式計算：雙醣i 莫耳% = (100×Ai ) / (Σx Ax )，其中Ai 為雙醣i 在232 nm處的峰面積。Ax 為峰面積；總和係關於出現在說明書定義中之所有八種雙醣。此外，在本發明中，假設所有8種雙醣在232 nm處具有相同的莫耳消光係數，則雙醣之AUC%等於雙醣之莫耳%。藉由 HPLC - MS 之雙醣分析 分析如論文中所述來進行(Bhaskar, U.Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative . PhD dissertation, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY (2014)。詳言之，25 μL水中之10 μg分析樣品在5 μL之濃縮緩衝液(25 mM Tris，500 mM NaCl，300 mM咪唑，pH 7.4)中與來自黃桿菌屬肝素(各肝素酶＞10 mIU)之肝素酶I、II及III混合。混合物在35℃下培育10 h。在培育之後，所生成之雙醣藉由用10 kDa分子量-截斷離心柱離心過濾來回收(YM-10微濃縮儀(micro-concentrator), EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。將流過物溶解於水中至50至100 ng/2 μL之濃度以用於液相層析(LC)-質譜(MS)分析。 LC-MS分析在配備有6300離子阱及二元泵繼之以UV偵測器之Agilent 1200 LC/MSD儀器(Agilent Technologies, Inc. Wilmington, DE, USA)上進行。所用管柱為Poroshell 120 C18管柱(2.1×100 mm, 2.7 μm, Agilent, USA)。溶離劑A為水/乙腈(85:15)v / v ，且溶離劑B為水/乙腈(35:65)v / v 。兩種溶離劑均含有12 mM三丁胺及38 mM乙酸銨，pH值利用乙酸調節至6.5。使用在150 μL/min之流動速率下的5 min溶液A之梯度，隨後 5至15 min之線性梯度(0至40%溶液B)。分子量及濃度測定 分子量經由凝膠滲透層析法(GPC)根據USP 37肝素專論方法以非必需細微修改來測定。保護管柱TSK SWXL 6-mm×4-cm，7-µm直徑與兩個分析管柱串聯使用：TSK G4000 SWXL 7.8 -mm×30 cm, 8-µm與TSK G3000 SWXL 7.8-mm×30-cm, 5-µm 串聯(Tosoh Corporation, Minato-Ku, Tokyo, Japan)。此等管柱連接至由Shimadzu LC-20AD泵、Shimadzu CBM-20A控制器、Shimadzu SIL-20AHT自動取樣器、Shimadzu CTO-20AC管柱烘箱及Shimadzu RID-20A折射率偵測器組成之HPLC系統(Shimadzu, Kyoto, Japan)。管柱及RID偵測器保持在30℃。移動相為具有0.02重量%疊氮化鈉之0.1 M乙酸銨且流動速率為0.6 mL/min。樣品注入體積為20 µL。GPC層析圖用LC溶液版本5.73軟件(Shimadzu, Kyoto, Japan)記錄，且用其「GPC Postrun」功能分析。為了分子量測定，USP肝素鈉分子量Calibrant RS(參考標準)用作校準物且USP肝素鈉識別RS (USP, MD, US)用於確認系統適用性。此外，注入以若干個濃度製備之USP肝素鈉識別RS以得到標準曲線，從而使用曲線下面積(AUC)計算反應樣品之濃度。所有資料通過USP專論中所規定之系統適用性要求。三階多項等式用於計算中。以下為分子量參數之定義。重量平均分子量(MW)用下式計算

，其中Ni為分子量Mi之分子數目。M24000為分子量大於24,000 Da之肝素鏈的百分比。M8000-16000/M16000-24000為8,000至16,000 Da範圍內分子量之肝素百分比與16,000至24,000 Da範圍內分子量之肝素百分比的比率。活體外抗凝血活性量測 肝素之抗Xa及抗IIa活性使用BIOPHEN肝素抗Xa(兩個階段)及抗IIa(兩個階段)套組來測定(Aniara, West Chester, Ohio)。在80 μL R1緩衝液(Tris 0.05 M，NaCl 0.175 M， EDTA 0.0075 M，pH值為8.40，含有0.1重量%之聚乙二醇，且0.02重量%疊氮化鈉作為防腐劑)中之人類ATIII 40 mU用於抗Xa檢定。與不同質量之肝素(範圍為0、5、10、15及20 ng)混合之80 μL R2緩衝液(Tris 0.05 M，NaCl 0.175 M，EDTA 0.0075 M，pH值為8.40，含有0.2重量%牛血清白蛋白且0.02重量%疊氮化鈉作為防腐劑)中的人類ATIII 10 mU在37℃下培育2 min。隨後，在37℃下添加預培育之經純化牛因子Xa (40 μL R1緩衝液中之320 ng)或經純化人類凝血酶(40 μL R2緩衝液中之960 mU)且培育2 min，然後添加對因子Xa (CS-01(65)，1.2 mM，40 μL)具有特異性的發色受質或對凝血酶(CS-01(38)，1.25 mM，40 μL) 具有特異性的發色受質。反應混合物在37℃下培育2 min以用於抗Xa檢定及1 min以用於抗IIa檢定，且隨後用檸檬酸停止(20 mg/mL，80 μL)。量測405 nm處之吸光度。抗Xa及抗IIa活性使用不同濃度之肝素(0-1 U/mL)的標準曲線來計算。實例4：酶類之產生(C5-表異構酶、2OST、6OST-1、6OST-3、3OST-1、AST-IV)。 MBP標記酶類(C5 epi、2OST、6OST-1及6OST-3)之細胞小球(10 g濕重)分散於50 mL含有蛋白酶抑制劑(Sigma，USA)及8000 kU/L DNAse I (Sigma，USA)之純化緩衝液(25 mM Tris-HCl (BioRad, USA), 500 mM NaCl (Sigma, USA), pH 7.5)中。所得細胞懸浮液以15000 psi穿過微射流均質機(microfuidizer)(Microfluidics LM20, USA)以用於細胞分解。細胞碎片藉由在4℃下，在13000 g處離心30 min移除。可溶酶根據製造商之說明書使用10 mL之直鏈澱粉樹脂(NEB, USA)來純化。 His6標記酶類(3OST-1及AST-IV)之細胞小球(10 g濕重)分散於50 ml含有蛋白酶抑制劑及8000 kU/L DNA酶I的純化緩衝液(25 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，30 mM咪唑，pH 7.5)中。細胞分解如先前所述進行，且可溶酶根據製造商方案使用10 mL Ni-NTA瓊脂糖(GE Healthcare, Sweden)來純化。純化酶類藉由SDS-PAGE凝膠(BioRad, USA)分析來分析。實例5：固定酶催化劑之製備及活性表徵。 His6標記酶類(3OST-1及AST-IV)用含有500 mM NaCl及500 mM咪唑的25 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液自Ni-NTA瓊脂糖珠粒溶離且MBP標記酶類(C5 epi，2OST，6OST-1及6OST-3)用含有500 mM NaCl及40 mM麥芽糖之25 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液自直鏈澱粉樹脂溶離。經溶離酶類之緩衝液使用10 kDa離心過濾器(Millipore, USA)用偶合緩衝液(磷酸鈉緩衝液(Alfa Aesar, USA)，100 mM；NaCl，150 mM；pH 7.5)來置換。為了酶類之共價固定，30至40 mg之商業珠粒例如CNBr瓊脂糖(GE Healthcare, Sweden)、吖內酯類Ultralink Biosupport (ThermoFisher, USA)及NHS-瓊脂糖(Thermo Fisher, USA)與1至2 mg酶類在室溫下單獨培育1 h，同時輕緩翻轉(根據製造商說明書)。在共價固定之後，對應珠粒用偶合緩衝液洗滌且珠粒上之殘餘官能基使用淬滅緩衝液猝滅(100 mM Tris-HCl及1 M NaCl，在pH值為8.0處)(根據製造商說明書)。對應珠粒上之酶類的偶合效率藉由量測上清液中最初加入的酶及非結合酶、洗滌及淬滅溶液來計算。酶之量使用藉由ImageLab軟件(BioRad, USA)之SDS-Page凝膠分析及BCA (Thermo Fisher, USA)檢定來計算。牛血清白蛋白(BSA) (ThermoFisher, USA)用作偶合效率計算之標準。實例6：中間物#2 (NS2S)之產生。此硫酸化步驟可在具有或不具有包含PNPS、PAPS及固定AST-IV之PAPS再循環系統的情況下進行。第一中間物NS用固定2OST及C5-epi來處理。詳細酶反應條件如下在MES反應緩衝液(50 mM，pH 7.2)中:1 mg/mL NS、0.25 mg/mL C5 epi、0.5 mg/mL 2OST、10 mM對硝基苯硫酸(PNPS)及1 mM PAP(只有當應用再循環系統時)、37℃下之反應溫度及24 h之反應時間。對於非再循環反應而言，使用如上相同條件，除了無PAP、PNPS及AST-IV存在之外，1.2 mM過量之PAPS濃度取決於目標NS2S轉換率。在如描述於實例4及實例5中之反應之前，製備且固定新鮮酶類。為了純化，5 kDa MWCO膜超過濾用於移除反應後化合物，諸如PAP及PAPS(若應用再循環則加上PNP及PNPS)。濃縮且收集保留物以用於雙醣分析。若NS2S%未達到目標，則此步驟可重複。實例7：中間物#3 (NS2S6S及NS6S)之產生。中間物#3之產生的反應步驟遵循用於中間物#2之方法，除了NS2S替代NS且固定的6OST-1及6OST-3(兩者均為0.5 mg/mL)置換C5-epi及2OST。若NS2S6S (TriS)%未達到目標，則此反應可重複。實例8：生合成肝素之產生。固定重組酶3OST-1藉由如在實例5中所提及之相同方式製備。反應在用於第二及第三中間物之相同條件下進行，除了酶類用固定3OST-1替換之外。最終生合成肝素使用強陰離子交換(SAX)層析用Q瓊脂糖樹脂來純化。簡言之，生合成肝素在40 mM NaCl溶液中結合至樹脂，接著400 mM NaCl溶液的洗滌。經純化生合成肝素使用4 M NaCl溶液溶離，隨後去鹽且濃縮。收集經純化生合成肝素用於進一步雙醣組成性分析、分子量分析及如實例3中所指示之活體外抗凝血活性檢定中。若抗凝血活性未達到USP規格，則此步驟可重複。實例9：用於合成兩種具有滿足豬USP肝素之規格之活性及分子量性質的生合成肝素(BSH)及兩種不滿足豬USP肝素之活性及分子量規格的生合成肝素(BSH)的精確方法。生合成肝素批次 h 之產生 總共40 mg NS (85.4% NS含量)在描述於實例6之條件下用2OST及C5-epi處理。反應條件如下在MES反應緩衝液(50 mM，pH 7.2)中：1 mg/mL NS、0.25 mg/mL C5 epi、0.5 mg/mL 2OST及1.45 mM PAPS。反應在滾筒上在37℃下培育24 h。酶珠粒自溶液移除且用3管柱體積(CV) 50 mM MES緩衝液(pH 7.2)洗滌以回收多醣。反應溶液及3 CV洗滌緩衝液組合且裝載至5 kDa MWCO膜離心柱上以用於濃縮及移除反應後化合物。如實例3中所提及，收集且取樣保留物以用於雙醣分析。所得NS2S中間物之雙醣組成如表3中所展示。表3.用於生合成肝素批次h之雙醣組成史及抗凝血活性的概述。

在第二酶步驟中，3 mg具有60% NS2S含量的所得NS2S中間物用固定6OST-1及6OST-3處理以生成NS2S6S中間物。固定方法如實例5中所提及。硫酸化反應條件與實例7中所提及的相同。在反應完成之後，回收多醣，如上文所提及純化且分析以用於NS2S產生。在初次6OST處理之後之此NS2S6S中間物的雙醣組成在表3中展示。為了增加TriS%高達大於40%，6OST處理使用相同方法再次重複。二次處理後所得NS2S6S中間物獲得43.5%之NS2S6S雙醣及10.5%之NS6S雙醣。二次6OST處理之後的此NS2S6S中間物(85.4-60.0-43.5)進一步用固定3OST-1處理以生成生合成肝素批次h。3OST-1固定如實例5中所描述進行。生合成肝素批次h之硫酸化反應條件及純化方法與實例8中所描述的相同，且接著為實例3中所提及的分子量、雙醣測定及活體外活性檢定。在初次3OST-1處理之後，生合成肝素批次h僅達到160 U/mg之抗IIa活性，低於豬USP肝素180 U/mg規格(表3)。因此，中間物再次用3OST-1處理，隨後使用如上所述之相同純化及分析。在二次3OST-1處理之後，生合成肝素批次h具有396 U/mg之抗IIa、365 U/mg之抗Xa及0.92之抗Xa/抗IIa，其具有17,500 Da之重量平均分子量，16.8之Mw高於24,000之部分的百分比且Mw介於8,000至16,000與Mw介於16,000至24,000之各部分之間的比率為1.3。生合成肝素批次h之抗凝血活性及分子量性質兩者均在豬USP肝素規格內。生合成肝素批次 w 之產生 總共25 mg NS (92.7% NS含量)在描述於實例6之條件下用2OST及C5 epi處理。簡言之，反應條件如下：50 mM MES緩衝液(pH 7.2)中之1 mg/mL (2.23 mM) NS、0.25 mg/mL C5-epi、0.5 mg/mL 2OST、0.5 mg/mL AST-IV、10 mM PNPS及1.61 mM PAPS。反應在滾筒上在37℃下培育24 h。酶珠粒自溶液移除且使用50 mM MES緩衝液(pH 7.2)用3管柱體積(CV)洗滌以回收所有多醣。反應溶液及3 CV洗滌緩衝液組合且裝載至5 kDa MWCO膜離心柱中以用於濃縮及移除反應後化合物。如實例3中所提及，收集且取樣保留物以用於雙醣分析。所得NS2S中間物之雙醣組成如表4中所展示。在初次2OST/C5-epi處理之後，此受質僅達到68.9%之NS2S%。因此，2OST-1/C5反應使用相同方法重複兩次以提高NS2S%至75%(表4)。總共3 mg具有75.4% NS2S雙醣基之所得NS2S中間物進一步用固定6OST-1及6OST-3處理以生成NS2S6S中間物。固定方法如實例5中所提及。硫酸化反應條件與實例7中所提及的一樣利用PAPS再循環系統。在反應完成之後，回收多醣，如上文所提及純化且分析以用於NS2S產生步驟。在6OST-1&3處理之後，此NS2S6S中間物之雙醣組成展示於表4中，且含有54.5%之NS2S6S (TriS)雙醣及14.3%之NS6S雙醣。此NS2S6S中間物進一步用固定3OST-1處理以生成生合成肝素批次w。3OST-1固定如實例5中所提及。生合成肝素批次w之硫酸化反應條件及純化方法與實例8中相同使用PAPS再循環，且接著為實例3中所提及的分子量、雙醣測定及活體外活性檢定。3OST-1處理後之生合成肝素批次w達到343 U/mg之抗IIa活性，393 U/mg之抗Xa及1.10之抗Xa/抗IIa，其具有15,500 Da之重量平均分子量，6.6之分子量高於24,000之部分的百分比且Mw介於8,000至16,000與Mw介於16,000至24,000之各部分之間的比率為1.7。生合成肝素批次w之抗凝血活性及Mw兩者均在豬USP肝素規格內。表4.用於生合成肝素批次w之雙醣組成史及抗凝血活性的概述。

在生合成肝素批次之一些情況下，用於第二及第三中間物之單一酶處理分別滿足豬USP肝素規格。不滿足豬 USP 肝素活性及分子量規格之生合成肝素批次 1 的產生 總共140 mg NS (92.7% NS含量)在實例6中所提及之條件下用2OST-1及C5-epi處理。簡言之，反應條件如下：50 mM MES緩衝液(pH 7.2)中之1 mg/mL (2.23 mM) NS、0.25 mg/mL C5 epi、0.5 mg/mL 2OST及2 mM PAPS。反應在滾筒上在37℃下培育24 h。酶珠粒自溶液移除且使用50 mM MES緩衝液(pH 7.2)用3管柱體積(CV)洗滌以回收所有受質。反應溶液及3 CV洗滌緩衝液組合且裝載至5k Da MWCO膜離心柱中以用於濃縮及移除反應後化合物。如實例3中所提及，收集且取樣保留物以用於雙醣分析。根據雙醣分析，第二中間物NS2S達到72.4%之NS2S雙醣(表5)。總共10 mg具有72.4% NS2S雙醣含量之所得NS2S中間物進一步用固定6OST-1及6OST-3處理以生成NS2S6S中間物。固定方法如實例5中所提及。硫酸化反應條件與實例7中所提及的相同。在反應完成之後，多醣如上文在NS2S硫酸化步驟中所提及回收、純化且分析。在6OST-1&3處理之後，此NS2S6S中間物之雙醣組成展示於表5中，且由41.0%之NS2S6S (TriS)雙醣及3.7%之NS6S雙醣組成。此NS2S6S中間物進一步用固定3OST-1處理。3OST-1固定如實例5中所提及。硫酸化反應條件及純化方法與實例8相同，且接著為實例3中所提及的重量平均分子量、雙醣組成及活體外活性檢定。此批次3OST-1處理後僅達到112 U/mg之抗IIa活性，93 U/mg之抗Xa及0.80之抗Xa/抗IIa。為增加抗IIa活性以滿足USP規格，此非等效批次1使用如實例8中所提及之相同方法再次用固定3OST-1處理。然而，抗IIa活性仍保持較低(114 U/mg)，未達到根據豬USP肝素規格之要求的180 U/mg。表5.用於生合成肝素批次1之雙醣組成史及抗凝血活性的概述。

不滿足豬 USP 肝素活性及分子量規格之生合成肝素批次 2 的產生 總共40 mg NS (92.7% NS含量)在實例6中所提及之條件下用2OST及C5-epi處理。簡言之，反應條件如下：50 mM MES反應緩衝液(pH 7.2)中之1 mg/mL (2.23 mM) NS、0.25 mg/mL C5 epi、0.5 mg/mL 2OST及2 mM PAPS。反應在滾筒上在37℃下培育24 h。酶珠粒自溶液移除且使用50 mM MES緩衝液(pH 7.2)用3管柱體積(CV)洗滌以回收所有多醣。反應溶液及3 CV洗滌緩衝液組合且裝載至5 kDa MWCO膜離心柱中以用於濃縮及移除反應後化合物。如實例3中所提及，收集且取樣保留物以用於雙醣分析。根據雙醣分析，第二中間物NS2S達到81.4%之NS2S雙醣(表6)。總共3 mg具有81.4% NS2S雙醣含量之所得NS2S中間物進一步用固定6OST-1及6OST-3處理以生成NS2S6S中間物。固定方法如實例5中所提及。硫酸化反應條件與實例7中所提及的相同。在反應完成之後，多醣如上文所提及在NS2S硫酸化步驟中回收、純化且分析。在6OST-1&3處理之後，此NS2S6S中間物之雙醣組成展示於表6中，且由61.0%之NS2S6S (TriS)雙醣及2.5%之NS6S雙醣組成。此NS2S6S中間物進一步用固定3OST-1處理。3OST-1固定如實例5中所提及。硫酸化反應條件及純化方法與實例8相同，且接著為實例3中所提及的重量平均分子量、雙醣含量及活體外活性檢定。此批次3OST-1處理後僅達到49 U/mg之抗IIa活性，其與180 U/mg之USP規格相距甚遠。此非等效批次2經證明與豬USP肝素不等效。表6.用於生合成肝素批次2之雙醣組成史及抗凝血活性的概述。

經由三種中間物生成生合成肝素概述下文所述為滿足生物活性及分子量(當量測時)之USP要求的生合成肝素的多個批次。生合成肝素亦呈現等效於豬USP肝素的雙醣含量。此等實驗用高效液相層析及核磁共振光譜協力進行以定量確定硫酸化之程度及性質。生合成肝素之生成要求在本方法之各步驟處所生成的中間物由特定雙醣含量組成。下文所述為關於以下之特定資訊：(a)第一中間物NS之NS雙醣基含量(就整體雙醣組成%而言之所有含量)；(b)第二中間物NS2S之NS2S及NS雙醣基含量；及(c)生物等效肝素之合成中第三中間物NS2S6S/TriS之NS2S6S、NS6S、NS2S及NS雙醣基含量。第一中間物NS具有合適重量平均分子量(Mw)及分子量分佈以得到合適分子量之第二及第三中間物，從而得到USP規格內之生合成肝素。符合豬USP肝素規格之批次的概述批次a、b、c及d揭示於美國臨時申請案62/384,341中。此章節之表中的雙醣資料為莫耳%。所展示之莫耳%值可表示為如呈現在美國臨時申請案62/384,341中的w/w %。

概述資訊：表7.第一中間物NS中NS%之概述

表8.第二中間物NS2S中NS、NS2S%之概述

表9.第三中間物NS2S6S中NS、NS2S、NS6S、TriS%之概述

表10.生合成肝素之反應規模及體積之概述

總而言之，可為重要的是使用具有以上展示之特定NS基團含量、Mw及分子量分佈的第一中間物NS以成功獲得特定第二及第三中間物，且最後得到可滿足USP肝素準則的BSH。表11.BSH批次a、b、c及d之以w / w % 計的雙醣資料。此等批次揭示於美國臨時申請案62/384,341中且亦為BEqH。

一般技術者將理解，雙醣資料可以莫耳%(如本文所使用)或重量%(如臨時申請案中所使用)中任一者表示。出現在美國臨時申請案62/384,341中且不滿足豬USP肝素活性及分子量規格之生合成肝素批次臨時申請案包括兩個不滿足豬USP肝素活性及分子量規格之批次。下表12及表13概述資料。雙醣值以w/w%及莫耳%兩者表示。表12.

#藉由¹ H-NMR所量測，*藉由LC-MS所量測

# 藉由¹ H-NMR所量測表13.分子量之概述

* * * 儘管前述內容涉及特定較佳實施例，但應理解，本發明並非如此受限。一般熟習此項技術者將想到可對所揭示之實施例進行各種修改且此等修改意欲在本發明之範疇內。本說明書中所引用之所有公開案、專利申請案及專利以全文引用的方式併入本文中。

圖1示意性地展示自肝素前體至可與豬USP肝素生物等效之生合成肝素(BSH)的路徑。圖2示意性地說明對中間物及可與豬USP肝素生物等效之生合成肝素的分析方法。圖3展示肝素前體、NS、NS2S、NS6S、NS2S6S中間物、可與豬USP肝素生物等效之生合成肝素及豬USP肝素的1D¹ H-NMR波譜。圖4展示生合成肝素中間物結構之例示性組成範圍，其可提供等效於豬USP肝素的性質。

Claims

一種醣胺聚醣，其包含78至99%之N-硫酸化(NS)雙醣基，且具有適於形成15,000至19,000Da之最終肝素產物的重量平均分子量，分子量大於24,000Da之肝素鏈的百分比不大於總量的20%，且分子量介於8,000至16,000Da之間的鏈與分子量為16,000至24,000Da之鏈的比率不小於1.0。
如請求項1之醣胺聚醣，其包含81至97%之N-硫酸化(NS)雙醣基。
如請求項1之醣胺聚醣，其包含83至95%之N-硫酸化(NS)雙醣基。
如請求項1之醣胺聚醣，其包含85至93%之N-硫酸化(NS)雙醣基。
一種醣胺聚醣，其包含44至80%之N-硫酸化、2-硫酸化(NS2S)基團以及13至39%之NS基團，且具有適於形成15,000至19,000Da之最終肝素產物的重量平均分子量，分子量大於24,000Da之肝素鏈的百分比不大於總量的20%，且分子量介於8,000至16,000Da之間的鏈與分子量為16,000至24,000Da之鏈的比率不小於1.0。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含50至78%之NS2S基團。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含55至77%之NS2S基團。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含60至76%之NS2S基團。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含14至35%之NS基團。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含15至30%之NS基團。
如請求項5之醣胺聚醣，其包含16至26%之NS基團。
一種醣胺聚醣，其包含36至70%之N-硫酸化、2-硫酸化、6-硫酸化(NS2S6S)雙醣基、6至32%之N-硫酸化、6-硫酸化(NS6S)雙醣基、0至27%之NS2S基團及1至22%之NS基團，且具有適於形成15,000至19,000Da之最終肝素產物的重量平均分子量，分子量大於24,000Da之肝素鏈的百分比不大於總量的20%，且分子量介於8,000至16,000Da之間的鏈與分子量為16,000至24,000Da之鏈的比率不小於1.0。
如請求項12之醣胺聚醣，其包含40至67%之NS2S6S雙醣基及6至26%之NS6S雙醣基。
如請求項12之醣胺聚醣，其包含43至64%之NS2S6S雙醣基及6至22%之NS6S雙醣基。
如請求項12之醣胺聚醣，其包含12至27%之NS2S基團及1至17%之 NS基團。
如請求項12至15中任一項之醣胺聚醣，其不含有3-硫酸化(3S)雙醣基。
一種用於產生生合成肝素之方法，其包含：a.獲得包含36至70%之NS2S6S雙醣基、6至32%之NS6S雙醣基、0至27%之NS2S基團及1至22%之NS基團的醣胺聚醣；b.在硫酸鹽供體存在下用酶處理該醣胺聚醣以產生生合成肝素批次，該酶為3-O-轉磺酶同功異構物1(3OST-1)。
如請求項17之方法，其中在步驟(b)中，足夠的葡糖胺殘餘物轉換成3-O-磺酸葡糖胺殘餘物，以使得該所產生批次具有不低於180單位/mg之抗Xa及抗IIa活性及0.85至1.15之抗Xa/抗IIa比率。
如請求項17之方法，其中該抗Xa/抗IIa比率為0.9至1.1。
一種製備包含44%至80%之NS2S基團及13%至39%之NS基團的第二醣胺聚醣中間物的方法，該方法包含：a.轉換肝素前體中78%至99%之N-乙醯基葡糖胺殘餘物以產生包含78%至99%之N-硫酸化(NS)雙醣基的第一醣胺聚醣；及b.在硫酸鹽供體存在下用酶處理該第一醣胺聚醣中間物以產生該第二醣胺聚醣中間物，該酶為C5-表異構酶(C5-epi)及2-O-轉磺酶(2OST)。
如請求項20之方法，其中該轉換包含使該肝素前體與鹼及磺化試劑反應。
如請求項20之方法，其中該轉換包含使該肝素前體與N-去乙醯酶，N-轉磺酶(NDST)反應。
一種製備包含36至70%之NS2S6S雙醣基、6至32%之NS6S雙醣基、0至27%之NS2S基團及1至22%之NS基團的第三醣胺聚醣中間物的方法，該方法包含：在硫酸鹽供體存在下，用酶處理包含44至80%之NS2S基團及13至39%之NS基團的第二醣胺聚醣中間物以將該第二醣胺聚醣中間物轉換成該第三醣胺聚醣中間物，該酶為6-O-轉磺酶同功異構物1及/或3(6OST-1/3)。
如請求項17至23中任一項之方法，其中該硫酸鹽供體包含3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸(PAPS)。
如請求項24之方法，其中PAPS係在溶液中。
如請求項17至23中任一項之方法，其中該硫酸鹽供體包含3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)及對硝基苯硫酸(PNPS)。
如請求項17至23中任一項之方法，其中該處理在包含PAPS、PNPS及催化劑之再循環系統存在下進行。
如請求項27之方法，其中該催化劑為芳基轉磺酶IV(AST-IV)。
如請求項17、20或23之方法，其中該酶呈溶液形式。
如請求項17、20或23之方法，其中該酶經固定。
如請求項17至23中任一項之方法，其中該處理在含有編碼NDST、C5-Epi、2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3中之一個或兩個及PAPS來源之基因的工程微生物菌株內進行。