KR20090109104A - 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 저분자량 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환원 말단에서 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 저분자량 헤파린, 이의 제조 방법, 요법에 있어서의 이의 용도, 및 상기 바이오틴화된 저분자량 헤파린을 중화시키기 위해서 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하는 방법에 관한 것이다.
저분자량 헤파린, 환원 말단, 공유 결합, 바이오틴, 바이오틴 유도체, 아비딘, 스트렙트아비딘
Description
본 발명은 저분자량 헤파린, 보다 일반적으로는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 함유하는 헤파리노이드-기재의 다당류 혼합물, 및 또한 이들의 제조 방법, 이를 함유하는 제약 조성물, 및 이들의 치료 용도에 관한 것이다.
헤파린은 15,000 달톤 (Da) 범위의 분자량을 갖는 동물 기원의 황산화 뮤코다당류들의 혼합물로서, 특히 그의 항-응고성 및 항-혈전성 때문에 사용된다. 그러나, 헤파린은 사용 조건에 제약이 있다는 단점이 있다. 특히, 이것의 높은 항-응고 활성 (특이, 이것의 높은 항-인자 IIa 활성)은 출혈을 야기할 수 있다 [Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999].
예를 들어 3,000 내지 7,000 Da 사이, 더욱 특히 3,500 내지 5,500 달톤 사이의 저분자량 헤파린, 특히 헤파린 에스테르의 염기성 탈중합으로 수득되고 에녹사파린과 같이 현재 시판되고 있는 것들 역시 높은 항-인자 IIa 활성을 갖는다.
헤파린 유도체는 이러한 바람직하지 못한 출혈 부작용에 대하여 공지되어 있다. 그러나, 상기 제품을 사용하여 혈전증을 치료하는 경우에는 출혈이 유도되는 것을 피하면서 혈액의 유동을 재확립하거나 유지시키는 것이 목적이다. 사실, 치료를 받고 있는 환자에서는 어떠한 우발적인 이유로도 출혈이 유발될 수 있다는 것이 알려져 있다. 항-혈전 처치를 받고 있는 환자에게 외과적 수술을 수행할 필요가 있을 수도 있다. 추가로, 특정 외과적 수술 도중에 혈액 응고를 예방하기 위하여 항응고제가 고용량으로 사용될 수 있고, 수술 종료시에 이를 중화시킬 수 있는 것이 유용하다. 따라서, 언제든지 항-응고 활성을 중단시키는 중화가능한 항-혈전제가 필요하다.
중화가능한 항-혈전제, 예컨대 바이오티닐화된 합성 다당류는 특허 출원 WO 02/24754 및 WO 06/030104에 기재되어 있다. 이것들의 합성법, 특히 상기 언급한 다당류 자체가 아니라 이들 다당류의 보호된 등가물에 수행되는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체의 그래프팅(grafting)을 포함하는 합성법은 본 발명의 화합물에 적용가능하지 않다. 이러한 이유는, 바이오티닐화는 완성된 생성물에 수행되는 것이 바람직한데, 상기 완성된 생성물이 헤파린-기재 다당류들의 혼합물이어서 불균질 생성물이기 때문에 여기에 상기 언급한 특허 출원서에 기재된 바와 같이 바이오틴을 그래프팅하는 것은 그래프팅 위치의 충분한 위치선택성을 유도할 수 없게 하고, 저분자량 헤파린의 모든 관능화가능한 다당류 쇄에 바이오티닐화가 일어나는 것이 아니기 때문이다.
오스몬드(Osmond) 등은 문헌 [Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207] 에서 돼지 헤파린을 바이오티닐화하는 여러가지 기술을 기재하였고, 이러한 기술 중 하나는 환원적 아미노화 이후에 바이오틴과의 커플링을 통해 바이오틴을 헤파린의 환원 말단에 커플링시키는 것을 포함하는 것으로 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에 기재된 작업 조건으로는 바이오티닐화된 헤파린이 완전하고 재현가능하게 수득되지 못한다. 이들은 헤파린의 구조적 다양성 및 시판 헤파린에 존재하는 것과 같은 다당류 쇄의 실제 구조를 고려하지 않았다. 시판 헤파린은 환원 말단에 상기 문헌 [Osmond et al.]에 기재된 프로토콜에 따라서는 바이오틴으로 관능화할 수 없는 분해된 글리코세린을 함유하는 다당류 쇄를 높은 비율로 포함한다. 따라서, 돼지 헤파린의 바이오티닐화에 대하여 상기 간행물에 기재된 작업 조건으로는 효율적인 중화가 일어나기에 충분한 정도로 바이오티닐화된 것과 같은 기대되는 특성을 갖는 바이오티닐화된 헤파린이 완전하고 재현가능하게 수득되지 못한다.
쳉(Tseng) 등은 문헌 [Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636]에서 헤파린을 아비딘과 상호작용시킨 후에 바이오틴으로 관능화함으로써 헤파린을 필름에 고정시키는 기술을 기재하였다. 헤파린의 바이오티닐화는 요오드를 사용한 산화 이후 락톤의 형성 및 이후 바이오틴 2-(4-아미노페닐)에틸아민 유도체와의 커플링을 통해 수행된다. 그러나, 쳉 등이 제시한 작업 조건으로는 환원 말단에서 바이오티닐화된 헤파린이 전반적이고 재현가능하게 생성될 것이라고 기대되지 않으며, 구체적으로는 산화 단계가 환원 말단에 선택적일 수 있다거나 헤파린의 생물학적 활성이 이러한 처리 이후에도 보존된다는 것이 확인되지 않는다.
따라서, 본 출원인은 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 중화시킬 수 있고 출 발 저분자량 헤파린과 유사한 생물학적 성질, 특히 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성을 보유하는 신규한 저분자량 헤파린을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 평균 분자량이 3,000 내지 7,000 Da이고 이들의 성분 다당류가 그의 환원 말단에서 바이오틴 또는 바이오틴 유도체에 공유 결합된 것을 특징으로 하는, 이하 "바이오티닐화된 저분자량 헤파린"이라 지칭되는 신규한 변형된 저분자량 헤파린에 관한 것이다.
놀랍게도, 바이오틴 또는 바이오틴 유도체를 다당류 쇄의 환원 말단에 도입하는 것이 저분자량 헤파린의 약리 활성을 변형시키지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 대상인 신규한 바이오티닐화된 저분자량 헤파린은 천연 저분자량 헤파린, 즉, 바이오티닐화 이전의 헤파린과 유사한 항-혈전 활성을 갖는다.
이것들은 천연 저분자량 헤파린에 비해 상당한 이점을 갖는다: 이것들은 비상시에 특정 해독제를 사용하여 신속하게 중화시킬 수 있다. 이러한 특정 해독제는 사량체 또는 단량체 형태의 아비딘, 또는 스트렙트아비딘으로, 각각의 질량은 약 66,000, 16,400 및 60,000 Da이다 [The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages 151-152, Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook].
이것들은 또한 사용 용량이 보다 높은 치료 적응증에 유용한 동시에 출혈의 위험은 적다는 이점이 있고, 이에 따라 동맥 치료 영역에 유용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "저분자량 헤파린"은 헤파린의 성분 다당류의 일반적인 구조를 갖는 황산화된 다당류들의 혼합물로서, 평균 분자량은 3,000 내지 7,000 Da이고, 헤파린의 탈중합으로 수득된다. 이하, 용어 "저분자량 헤파린" 또는 "천연 저분자량 헤파린"은 바이오티닐화 이전의 다당류 혼합물을 나타내는 반면, 용어 "바이오티닐화된 저분자량 헤파린"은 본 발명에 따른 화합물로서 바이오틴 또는 그의 유도체와의 공유 결합을 포함한다.
용어 "환원 말단"은 말단 글루코사민 또는 만노사민 (만노사민은 글루코사민의 염기성 매질 중에서의 에피머화로 인해 생성됨)이 하기 화학식 II에 상응하는 시클릭 헤미아세탈 관능기를 갖는 다당류 쇄의 말단을 의미한다:
상기 식에서,
X는 H 또는 SO3Na을 나타내고,
Y는 COCH3 또는 SO3Na을 나타내며,
물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합 (아래: 글루코사민, 위: 만노사민)을 나타낸다.
본 발명에서 사용될 수 있는 저분자량 헤파린 중 일부는 이들의 다당류 쇄의 75％ 이상이 환원 말단에 헤미아세탈 형태의 글루코사민을 포함하는 것일 수 있고, 이것들이 상기 혼합물의 관능화가능한 다당류이다. 혼합물 중에 존재하는 특정 다당류 쇄는 25％ 이하의 함량까지가 1,6-무수 형태일 수 있는데, 이러한 다당류는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체로 관능화가능하지 않다.
용어 "혼합물의 '관능화가능한 성분 다당류'"는 환원 말단에 화학식 II에서 정의한 바와 같은 헤미아세탈 형태의 글루코사민을 포함하는 다당류를 의미한다.
용어 "헤파린의 성분 다당류"는 유론산 잔기 (D-글루쿠론산 또는 L-이두론산) 및 D-글루코사민 잔기를 함유하는 이당류 단위가 반복되어 있는 것을 특징으로 하는 다당류를 의미하며, 상기 잔기는 N-황산화 또는 N-아세틸화된 것일 수 있다. 상기 이당류 단위는 또한 D-글루코사민의 위치 C6 및/또는 C3 및 유론산의 위치 C2에서 O-황산화될 수도 있다 [Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1].
유리하게는, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린은 이들의 성분 다당류가 하기 화학식 I 및 그의 제약상 허용가능한 염에 상응한다는 것을 특징으로 한다:
상기 식에서,
i는 0 또는 1이고,
R1은 화학식 
또는 
의 배열 (sequence)을 나타내고, 여기서의 j 및 k는 동일하거나 상이할 수 있으며, 1 내지 10의 임의의 값일 수 있는 정수이고,
Biot는 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체를 나타내고,
PE는 헤파린의 성분 다당류 구조를 갖는 다당류 쇄를 나타내고,
X는 H 또는 SO3Na를 나타내고,
Y는 SO3Na 또는 COCH3을 나타내며,
물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합을 나타낸다.
상기 언급한 바이오틴 (Biot)기는 헥사히드로-2-옥소-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-펜탄산에서 유래한 라디칼이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 화학식 I의 Biot기는 화학식 
에 상응한다.
바이오틴 유도체는 시판되거나 ("피어스(Pierce)" 바이오틴-아비딘 제품 카탈로그, 2005, 제7면 내지 제11면), 또는 당업자에게 공지된 표준 방법으로 제조될 수 있다. 특히, 특허 출원 WO 02/24754에서 언급된 바이오틴 유도체를 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린에서, 지수 i는 0일 수 있고, 이 경우에는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 결합이 다당류 쇄의 환원 말 단에 존재하는 당 단위가 보유하는 아민 관능기에서 직접적으로 이루어진다.
별법으로, i는 1일 수 있고, 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체와의 결합은 예를 들어 상기 화학식 (a)에서 j가 5인 배열 또는 상기 화학식 (b)에서 j 및 k가 동일하게 5인 배열로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 화학식 I에서 R1은 예를 들어 화학식 -CO-(CH2)5-NH 또는 -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-의 배열을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린은 이의 성분 다당류 중 60％ 이상, 유리하게는 80％ 이상, 훨씬 더욱 유리하게는 90％ 이상이 그의 환원 말단에 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 공유 결합을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 저분자량 헤파린은 예를 들어 에녹사파린, 아르데파린, 베미파린, 파르나파린 및 틴자파린으로부터 선택될 수 있다.
특허 US 5 389 618 및 US RE38 743에서 정의된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 저분자량 헤파린은 특히 다음과 같을 수 있다:
· 이들의 성분 다당류 중 9％ 내지 20％가 평균 분자량이 2,000 Da 미만이고,
· 이들의 성분 다당류 중 5％ 내지 20％가 평균 분자량이 8,000 Da 초과이고,
· 이들의 성분 다당류 중 60％ 내지 86％가 평균 분자량이 2,000 내지 8,000 Da이고,
· 질량-평균 분자량과 수-평균 분자량 사이의 비율이 1.3 내지 1.6이며,
· 상기 저분자량 헤파린이 헤파린에 비해 더 우수한 생체이용률 및 항-혈전 활성을 갖고, 평균 분자량이 대략 3,500 내지 5,500 Da 사이이다.
본 발명은 임의의 제약상 허용가능한 염 형태의 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 포함한다.
본 발명은 또한
a) 아민 염 및 환원제의 존재하에 20℃ 내지 80℃의 온도에서 상기 정의한 바와 같은 저분자량 헤파린에 환원적 아미노화를 수행하고,
b) 이후, 수성 매질 또는 유기 매질 중 염기의 존재하에 활성화된 -(R1)i-Biot기 (여기서, R1, i 및 Biot는 앞서 화학식 I과 관련하여 정의된 바와 같음)와의 아실화를 수행한다는 것
을 특징으로 하는, 상기 언급한 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조 방법의 단계는 예를 들어 특허 출원 WO 2004/027087에 기재된 방법을 이용한 분석적 HPLC 모니터링, 특히 SAX 유형의 분석적 HPLC 모니터링, 또는 임의로 예를 들어 문헌 [Robert J. Linhardt in J. Biol. Chem., 2004, 279 (4), p. 2608-2615]에 기재된 방법을 이용한 LC-MS를 통해 제어될 수 있다.
바이오티닐화된 저분자량 헤파린은 또한 피어스(Pierce)사가 시판하는 지지된 단량체 아비딘에서의 친화도 크로마토그래피를 상기 제조업체가 기재한 분석 조 건에 따라 수행하여 분석되고 특징규명될 수도 있다.
특히, 환원적 아미노화 단계 a) 이후에는 상기 저분자량 헤파린의 성분 다당류 중 90％ 이상이 그의 환원 말단에 -NH2 관능기를 보유 (아미노-환원된 다당류)한다는 것이 확인된다.
특히, 아실화 단계 b) 이후에는 상기 아미노-환원된 다당류 중 90％ 이상이 바이오티닐화된다는 것이 확인된다.
따라서, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 제조 방법의 전체 수율은 80％ 이상이고, 유리하게는 90％ 이상이다.
본 발명에 따른 화합물의 제조 방법은 출발 저분자량 헤파린 ("천연" 저분자량 헤파린)으로서 기존 문헌에서 이미 보고된 바와 같이 제조된 저분자량 헤파린을 사용한다. 특히, 에녹사파린의 경우에는 특허 US RE38 743, 아르데파린의 경우에는 특허 US 4 757 057, 베미파린의 경우에는 특허 EP 0 293 539, 파르나파린의 경우에는 특허 US 4 791 195, 및 틴자파린의 경우에는 특허 US 5 106 734를 참조한다.
상기 제조 방법 중의 환원적 아미노화 단계 a)에서, 아민 염은 4급 아민 염일 수 있고, 유리하게는 화학식 NH4Z (여기서, Z는 할로겐 원자, 예를 들어 염소, 불소, 브롬 또는 요오드 원자를 나타냄)에 상응하는 암모늄 할라이드 염이다.
상기 제조 방법 중의 환원적 아미노화 단계 a)에서, 환원제는 보로하이드라이드 염, 예를 들어 시아노보로하이드라이드 염일 수 있다.
상기 제조 방법 중의 환원적 아미노화 단계 a)에서, 온도는 50℃ 내지 80℃인 것이 유리하다.
상기 제조 방법 중의 아실화 단계 b)에서, 염기는 탄산염 또는 탄산수소염, 특히 나트륨 염 또는 칼륨 염 형태이거나, 또는 별법으로 당업자에게 공지된 임의의 수용성 또는 지용성 유기 염기일 수 있다.
상기 제조 방법 중의 아실화 단계 b)에서, 용어 "유기 매질"은 예를 들어 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드를 의미한다.
본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 제조 방법은
a) 암모늄 할라이드 염 및 보로하이드라이드 염의 존재하에 50℃ 내지 80℃의 온도에서 저분자량 헤파린에 환원적 아미노화를 수행하는 단계,
b) 이후, 수성 매질 중 염기의 존재하에 활성화된 에스테르 형태의 상기 정의한 바와 같은 -(R1)i-Biot기와의 아실화를 수행하는 단계
를 포함하는 것이 유리하다.
상기 정의한 바와 같은 바이오티닐화된 유도체 -(R1)i-Biot는 활성화된 에스테르의 형태로 아실화 반응에 직접 사용될 수 있으며, 이것은 당업자에게 공지된 표준 커플링 반응을 이용하여 계내 수행되거나 생성된다. 특히, N-히드록시숙신이미드 유도체 형태 또는 3-술포-N-히드록시숙신이미드 유도체 형태의 활성화된 에스테르를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법은 하기 반응식 1로 예시된다:
반응식 1에 따라서, 저분자량 헤파린은 아민 염 및 환원제, 예컨대 보로하이드라이드 염의 존재하에 환원적 아미노화를 통해 환원 말단에 유리 아민 관능기를 함유하는 유도체 A를 생성한다.
이후, 상기 유도체는 상기 정의한 바와 같은 활성화된 바이오틴 유도체 -(R1)i-Biot와의 반응을 통해 아실화되어 바이오티닐화된 유도체 B를 생성할 수 있다. 상기 반응은 예를 들어 R1이 -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-의 배열을 나타내는 경우에는 에스테르 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도헥사노일 헥사노에이트의 나트륨 염과 수행되거나, 또는 R1이 -CO-(CH2)5-NH-의 배열을 나타내는 경우에는 에스테르 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트의 나트륨 염과 수행되거나, 또는 별법으로 R1이 존재하지 않는 (i = 0) 경우에는 바이오티노일-3-술포숙신이미딜 에스테르의 나트륨 염과 수행될 수 있다.
반응식 1에서, 유도체 A 및 B는 다당류 쇄들의 혼합물인 저분자량 헤파린 유도체로서 단지 이론적으로 도시한 것임을 이해해야 한다.
이하, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 및 이들을 수득하는데 유용한 각종 중간체의 합성예를 예시를 통해 상세히 기술한다.
하기 약어가 사용된다:
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
SAX: 강음이온 교환 크로마토그래피
LC-MS: 액체 크로마토그래피-질량 분광법
qs: 충분량
LC: 6-아미노헥사노일 배열에 상응하는 장쇄
LC-LC: 2개의 LC 배열을 나타내며, 아미도-헥사노일-6-아미노헥사노일 배열에 상응함
술포-NHS: 3-술포숙신이미딜 에스테르의 나트륨 염
헤파리나제 1: 플라보박테륨 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)의 헤파린 라이아제 I 효소 (EC 4.2.2.7)
도 1은 실시예 1에 따른 에녹사파린의 전환을 HPLC SAX로 반응 모니터링한 것을 예시한다.
도 2, 도 3 및 도 4는 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 수득된 생성물 각각을 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 통과시킨 후에 얻어진 바이오티닐화된 분획물 및 바이오티닐화되지 않은 분획물을 HPLC SAX로 분석한 것을 예시한다.
실시예
1:
NH
LC
바이오티노일
에녹사파린
에녹사파린은 특허 US RE38 743에 기재된 방법에 따라 수득되는 저분자량 헤파린이다. 이것을 하기 반응식 2의 반응 순서에 따라 바이오티닐화된 유도체로 전 환시켰다: 에녹사파린을 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 갖는 화합물 1로 전환시켰고, 이후에는 상기 유도체를 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 화합물 2로 전환시켰다.
1.1: 1-아미노
에녹사파린
에녹사파린 1 g을 수성 5 M 염화암모늄 용액 40 mL 중에 용해하였다. 수득된 용액에 시아노수소화붕소나트륨 1 g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도로 냉각시키고, 물 (qs 100 mL)로 희석하였다. 수득된 여액을 세파덱스(Sephadex) G10 컬럼에서 탈염(desalifying)시킨 후에 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 824 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 82％였다. 생성물을 HPLC SAX (도 1 참조)로 제어하고, 추가 의 정제 없이 바이오티닐화 단계에 사용하였다.
1.2:
NH
LC
바이오티노일
에녹사파린
1-아미노 에녹사파린 200 mg을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 5 mL 중에 20℃ 범위의 온도에서 용해하였다. 수득된 용액에 술포-NHS-LC-바이오틴 136 mg을 첨가하였다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 10 mL로 희석하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 136 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 136 mg을 더 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 70 mg을 더 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 200 mL)로 희석하여 0.45 ㎛ 막에서 여과한 후에 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수득된 분획물을 Q-세파로스(Sepharose) 컬럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨 구배로 용출시켰다. 수집된 분획물을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수득된 생성물을 Q-세파로스 컬럼에 통과시키고 세파덱스 G10에서 탈염시켜 다시 정제하였다. 수집된 최종 분획물을 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 190 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 87％였다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 1.3과 1.8 사이 (12H, m), 2.05 (CH3CO, s), 2.25 (2CH2CO 바이오틴, m), 2.80 (1H, d, 12Hz), 3.03 (1H, dd, 12 및 5Hz), 3.15와 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.99 (1H, d, 4Hz).
수득된 생성물을 HPLC SAX로 제어하였다: 도 1 (도면 4개 중 첫번째)은 에녹 사파린이 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 갖는 유도체 1로 전환되는 것을 HPLC SAX로 반응 모니터링한 것을 예시한다 (반응식 2 참조). 이어서, 상기 유도체를 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 유도체 2로 전환시켰다. 이용된 분석 방법은 특허 출원 WO 2004/027087에 기재되어 있다. 도 1은 관능화가능한 글루코사민을 함유하는 종이 90％ 초과의 전환률로 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 유도체로 전환되어 1-아미노 에녹사파린이 생성된 것을 보여준다. 도 1은 또한 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 종이 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 90％ 초과의 전환률로 바이오티닐화된 유도체로 전환되어 NH LC 바이오티노일 에녹사파린이 생성된 것을 보여준다.
예로써, 도 1은 실시예 1에 따라 수득된 올리고당류 혼합물 중에 존재하는 주된 화합물에 상응하는 피크를 나타내며, 상기 화합물의 구조는 아래에서 제시하였다 (사용된 명칭은 특허 출원 WO 2004/027087에서의 명칭에 상응함).
LC-MS 분석은 질량 분광법을 통해 산 형태의 생성물에 상응하는 이들 화합물의 구조를 확인시켜 준다:
추가로, 실시예 1에 따라 수득된 생성물을 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 주입할 수 있다. 용출은 제조업체인 피어스가 기재한 조건에 따라 수행하였다. 이어서, 이로써 수득된 바이오티닐화된 분획물 (아비딘에 대해 친화성을 가짐) 및 바 이오티닐화되지 않은 분획물 (아비딘에 대한 친화성이 없음)을 HPLC SAX에 주입하였다 (도 2 (도면 4개 중 두번째) 참조): 도 2는 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 통과시킨 후에 얻어진 바이오티닐화된 분획물 및 바이오티닐화되지 않은 분획물을 HPLC SAX로 분석한 것을 예시한다. 도 2는 관능화가능한 글루코사민을 함유하는 종이 90％ 초과의 전환률로 상응하는 바이오티닐화된 종으로 전환된 것을 보여준다. 친화성이 없는 분획물은 주로 1,6-무수 유도체로 구성되어 있는데, 이것들은 그 성질상 바이오티닐화된 유도체로 전환될 수 없다. 주된 피크 중 일부의 구조를 예로서 제시하여 수득된 생성물을 특징규명하였다 (상기 예시한 구조 참조).
실시예 2:
NH
바이오티노일
에녹사파린
특허 US RE38 743에 기재된 방법에 따라 수득된 저분자량 헤파린인 에녹사파린을 반응식 3에 기재한 반응 순서에 따라 바이오티닐화된 유도체로 전환시켰다: 에녹사파린을 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 화합물 1로 전환시켰고, 이후에는 상기 유도체를 바이오티노일-3-술포숙신이미딜 에스테르, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 화합물 3으로 전환시켰다.
1-아미노 에녹사파린 200 mg을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 5 mL 중에 20℃ 범위의 온도에서 용해하였다. 수득된 용액에 술포-NHS-바이오틴 107 mg을 첨가하였다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 10 mL로 희석하였다. 술포-NHS-바이오틴 107 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 150 mL)로 희석하여 0.45 ㎛ 막에서 여과한 후에 Q-세파로스 컬럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨 구배로 용출시켰다. 수집된 분획물을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수집된 분획물을 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 190 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 약 90％였다.
수득된 생성물을 HPLC SAX로 제어하였고 (도 3 (도면 4개 중 세번째) 참조. "글로벌(Global)" 그래프), 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 종이 바이오티 노일-3-술포숙신이미딜 에스테르, 나트륨 염과의 반응을 통해 90％ 초과의 전환률로 바이오티닐화된 유도체로 전환되었음이 확인되었다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 1.4와 1.8 사이 (6H, m), 2.05 (CH3CO, s), 2.3 (CH2CO 바이오틴, m), 2.80 (1H, dd, 12 및 7Hz), 3.03 (1H, m), 3.20과 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
실시예 2에 따라 수득된 생성물을 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 주입하였다. 용출은 제조업체인 피어스가 기재한 조건에 따라 수행하였다. 이어서, 수득된 바이오티닐화된 분획물 (아비딘에 대해 친화성을 가짐) 및 바이오티닐화되지 않은 분획물 (아비딘에 대한 친화성이 없음)을 HPLC SAX에 주입하였다 (도 3 (도면 4개 중 세번째) 참조). 친화성이 없는 분획물은 주로 1,6-무수 유도체로 구성되어 있는데, 이것들은 그 성질상 바이오티닐화된 유도체로 전환될 수 없다.
예로써, 도 3은 올리고당류 혼합물의 특정 주요 화합물의 구조를 기재한다. 언급된 구조는 아래에서 제시하였다.
LC-MS 분석은 질량 분광법을 통해 산 형태의 생성물에 상응하는 이들 화합물의 구조를 확인시켜 준다:
실시예
3:
NH
-
LC
-
LC
바이오티노일
에녹사파린
특허 US RE38 743에 기재된 방법에 따라 수득된 저분자량 헤파린인 에녹사파린은 반응식 4에 기재한 반응 순서에 따라 바이오티닐화된 유도체로 전환시킬 수도 있다: 에녹사파린을 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 화합물 1로 전환시켰고, 이후에는 상기 유도체를 에스테르 3-술포-숙신이미딜 6-바이오틴아미도헥사노일 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 화합물 4로 전환시켰다.
1-아미노 에녹사파린 200 mg을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 5 mL 중에 20℃ 범위의 온도에서 용해하였다. 수득된 용액에 술포-NHS-LC-LC-바이오틴 164 mg을 첨가하였다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 10 mL로 희석하였다. 술포-NHS-LC-LC-바이오틴 164 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 150 mL)로 희석하여 0.45 ㎛ 막에서 여과한 후에 Q-세파로스 컬럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨 구배로 용출시켰다. 수집된 분획물을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수집된 분획물을 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 210 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 약 92％였다.
수득된 생성물을 HPLC SAX로 제어하였고 (도 4 (도면 4개 중 네번째) 참조. "글로벌" 그래프), 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 종이 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도헥사노일 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 90％ 초과의 전환률로 바이오티닐화된 유도체로 전환되었음이 확인되었다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 1.3과 1.8 사이 (16H, m), 2.05 (CH3CO, s), 2.25 (6H, m), 2.80 (1H, dd, 12 및 7Hz), 3.03 (1H, m), 3.20과 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
실시예 3에 따라 수득된 생성물을 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 주입하였다. 용출은 제조업체인 피어스가 기재한 조건에 따라 수행하였다. 이어서, 수득된 바이오티닐화된 분획물 (아비딘에 대해 친화성을 가짐) 및 바이오티닐화되지 않은 분획물 (아비딘에 대한 친화성이 없음)을 HPLC SAX에 주입하였다 (도 4 참조). 친화성이 없는 분획물은 주로 1,6-무수 유도체로 구성되어 있는데, 이것들은 그 성질상 바이오티닐화된 유도체로 전환될 수 없다.
주요 화합물의 구조는 LC-MS 커플링으로 확인하였다.
예로써, 도 4는 올리고당류 혼합물의 특정 주요 화합물의 구조를 기재한다. 언급된 구조는 아래에서 제시하였다.
LC-MS 분석은 질량 분광법을 통해 산 형태의 생성물에 상응하는 상기 화합물의 구조를 확인시켜 준다:
실시예
4:
NH
-
LC
바이오티노일
틴자파린
헤파리나제 1 처리로 수득되는 약 6,000 달톤의 저분자량 헤파린인 틴자파린은 반응식 5에 기재한 반응 순서에 따라 바이오티닐화된 유도체로 전환시킬 수도 있다: 틴자파린을 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 화합물 5로 전환시켰고, 이후에는 상기 유도체를 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 화합물 6으로 전환시켰다.
4.1: 1-아미노
틴자파린
틴자파린 250 mg을 수성 5 M 염화암모늄 용액 10 mL 중에 용해하였다. 수득된 용액에 시아노수소화붕소나트륨 250 mg을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 20시간 동안 유지시켰다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도로 냉각시키고, 물 (qs 20 mL)로 희석하였다. 수득된 여액을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시킨 후에 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 215 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 86％였다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 2.05 (CH3CO, s), 3.10 및 3.40 (각각 1H, m, CH2NH2), 3.20과 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
상기 화합물은 실시예 1에서 앞서 요약한 방법을 이용하여 HPLC SAX로 제어 할 수 있다.
상기 생성물을 추가의 정제 없이 바이오티닐화 단계에 사용하였다.
4.2:
NH
LC
바이오티노일
틴자파린
1-아미노 틴자파린 100 mg을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 2.5 mL 중에 20℃ 범위의 온도에서 용해하였다. 수득된 용액에 술포-NHS-LC-바이오틴 47 mg을 첨가하였다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도에서 1시간 45분 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 5 mL로 희석하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 47 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 6시간 동안 교반하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 47 mg을 더 첨가하고, 반응 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 1 mL로 다시 희석하고, 술포-NHS-LC-바이오틴 47 mg을 더 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 6.5 mL로 다시 희석하고, 술포-NHS-LC-바이오틴 47 mg을 더 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 22시간 동안 교반한 후에 물 (qs 100 mL)로 희석하여 0.45 ㎛ 막에서 여과하고 Q-세파로스 컬럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨 구배로 용출시켰다. 수집된 분획물을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수집된 최종 분획물을 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 110 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 정량적이었다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 1.3과 1.8 사이 (12H, m) 사이, 2.05 (CH3CO, s), 2.25 (4H, m), 2.80 (1H, dd, 12 및 7Hz), 3.03 (1H, m), 3.20과 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
수득된 화합물 1-아미노 틴자파린 및 NH LC 바이오티노일 틴자파린 역시 실시예 1에서 앞서 이용한 HPLC SAX 방법을 이용하여 특징규명할 수 있다. 이러한 HPLC 제어는 관능화가능한 글루코사민을 함유하는 종이 90％ 초과의 전환률로 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 유도체로 전환되어 1-아미노 틴자파린이 생성된 것을 보여준다. 이것은 또한 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 종이 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 90％ 초과의 전환률로 바이오티닐화된 유도체로 전환되어 NH LC 바이오티노일 틴자파린이 생성된 것을 보여준다.
실시예 1에서와 동일한 방식으로, 주요 화합물의 구조는 LC-MS 분석으로 확인할 수 있다.
상기 수득된 생성물도 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 주입할 수 있다. 용출은 제조업체인 피어스가 기재한 조건에 따라 수행한다. 수득된 바이오티닐화된 분획물 (아비딘에 대해 친화성을 가짐) 및 바이오티닐화되지 않은 분획물 (아비딘에 대한 친화성이 없음)은 HPLC SAX로 제어할 수 있다.
실시예
5:
NH
LC
바이오티노일
베미파린
알칼리성 탈중합을 통해 수득되는 약 3,500 달톤의 저분자량 헤파린인 베미파린 역시 하기 반응식 6에 기재한 반응 순서에 따라 바이오티닐화된 유도체로 전환시킬 수 있다: 베미파린을 환원적 아미노화 반응을 통해 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 화합물 7로 전환시켰고, 이후에는 상기 유도체를 3-술포숙신이미 딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 바이오티닐화된 화합물 8로 전환시켰다.
5.1: 1-아미노
베미파린
베미파린 250 mg을 수성 5 M 염화암모늄 용액 10 mL 중에 용해하였다. 수득된 용액에 시아노수소화붕소나트륨 250 mg을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 20시간 동안 유지시켰다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도로 냉각시키고, 물 (qs 20 mL)로 희석하였다. 수득된 여액을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시킨 후에 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 227 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 91％였다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 2.05 (CH3CO, s), 3.10 및 3.40 (각각 1H, m, CH2NH2), 3.20과 5.80 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
상기 화합물은 실시예 1에서 앞서 요약한 방법을 이용하여 HPLC SAX로 제어할 수 있다.
상기 생성물을 추가의 정제 없이 바이오티닐화 단계에 사용하였다.
5.2:
NH
LC
바이오티노일
베미파린
1-아미노 베미파린 100 mg을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 5 mL 중에 20℃ 범위의 온도에서 용해하였다. 수득된 용액에 술포-NHS-LC-바이오틴 80 mg을 첨가하였다. 상기 용액을 20℃ 범위의 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 10 mL로 희석하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 80 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 40 mg을 더 첨가하고, 반응 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 50 mL)로 희석한 후에 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수득된 분획물을 Q-세파로스 컬럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨 구배로 용출시켰다. 수집된 분획물을 세파덱스 G10 컬럼에서 탈염시켰다. 수득된 생성물을 Q-세파로스 컬럼에 통과시켜 다시 정제하고, 세파덱스 G10에서 탈염시켰다. 수집된 최종 분획물을 냉동 건조시켰다. 백색의 동결건조물 101 mg이 수득되었다. 관찰된 수율은 92％였다.
D2O 중 올리고당류 혼합물의 1H NMR 스펙트럼 (25℃, ppm): 1.3과 1.8 사이 (12H, m), 2.05 (CH3CO, s), 2.25 (4H, m), 2.80 (1H, dd, 12 및 7Hz), 3.03 (1H, m), 3.20과 5.65 사이 (다당류 양성자), 5.98 (1H, d, 4Hz).
수득된 화합물 1-아미노 베미파린 및 NH LC 바이오티노일 베미파린 역시 실시예 1에서 앞서 이용한 HPLC SAX 방법을 이용하여 특징규명할 수 있다. 이러한 HPLC 제어는 관능화가능한 글루코사민을 함유하는 종이 90％ 초과의 전환률로 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 유도체로 전환되어 1-아미노 베미파린이 생성된 것을 보여준다. 이것은 또한 환원 말단에 아미노 관능기를 함유하는 종이 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트, 나트륨 염과의 반응을 통해 90％ 초과의 전환률로 바이오티닐화된 유도체로 전환되어 NH LC 바이오티노일 베미파린이 생성된 것을 보여준다.
실시예 1에서와 동일한 방식으로, 주요 화합물의 구조는 LC-MS 분석으로 확인할 수 있다.
상기 수득된 생성물도 지지된 아비딘 단량체 컬럼에 주입할 수 있다. 용출은 제조업체인 피어스가 기재한 조건에 따라 수행한다. 수득된 바이오티닐화된 분획물 (아비딘에 대해 친화성을 가짐) 및 바이오티닐화되지 않은 분획물 (아비딘에 대한 친화성이 없음)은 HPLC SAX로 제어할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물로 생화학 및 약리학 연구를 실시하였다.
1. 항-인자
IIa
활성 및 항-인자
Xa
활성의 측정
인간 혈장 또는 완충제 시스템 중에서의 항-인자 IIa (항-FIIa) 활성 및 항-인자 Xa (항-FXa) 활성을 발색 방법으로 분석하였다: 항-인자 IIa 활성은 발색 기질 S-2238, α-트롬빈 및 인간 ATIII (항-트롬빈 III)를 함유하는 악티크롬 (Actichrome) 헤파린 항-인자 IIa 키트 (아메리칸 다이아그노스티카(American diagnostica))를 사용하여 시험하였다. 항-FXa 활성은 자동화 응고 장치 ACL 7000 (인스트루먼테이션 래버러토리(Instrumentation Laboratory))에서 ATIII, 인자 Xa 및 발색 기질 S-2765를 함유하는 헤파린 키트 (인스트루먼테이션 래버러토리)를 사용하여 결정하였다. 상기 2가지 분석은 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.
하기 표준물이 인간 혈장 및 완충제 시스템 중 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 분획물의 시험관내 활성을 결정하기 위한 표준 보정 곡선을 수립하는데 사용되었다:
- 저분자량 헤파린에 대한 첫번째 국제 표준물 (영국 런던 소재의 국립 생물학 표준 및 통제 연구소(National Institute for Biological Standards and Control). 1987년 수립. 코드 번호 85/600),
- 저분자량 헤파린에 대한 두번째 국제 표준물 (영국 런던 소재의 국립 생물학 표준 및 통제 연구소. 1987년 수립. 코드 번호 01/608. 2006년 6월 이후 사용),
- 에녹사파린 (클렉산(Clexane)®, 프랑스 소재의 사노피-아벤티스(sanofi-aventis))
을 내부 기준물로서 사용하였다.
항-FIIa 활성을 측정하기 위해서, 샘플 또는 국제 저분자량 헤파린 표준물 10 ㎕를 인간 혈장, 또는 0.05 M Tris-HCl, 0.154 M NaCl을 함유하는 완충제 시스 템 (pH 7.4) 중 항-트롬빈을 사용하여 1:16으로 희석하였다. 상기 용액 10 ㎕를 96웰 미량역가 플레이트에 첨가하였다. 측정은 3벌 (3개 웰에 대해 수행함)로 반복하였다. 상기 미량역가 플레이트를 37℃로 유지시키면서 300 rpm으로 교반시켰다. 트롬빈 40 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 정확하게 2분 동안 인큐베이션하였다. 스펙트로자임(Spectrozyme) 40 ㎕를 첨가하였다. 90초 후에, 아세트산 40 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 340 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))을 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
항-FXa 활성 측정을 위해서, 샘플 또는 국제 저분자량 헤파린 표준물을 인간 혈장, 또는 0.05 M Tris-HCl, 0.154 M NaCl을 함유하는 완충제 시스템 (pH 7.4) 중에 희석하였다. 혈장 또는 완충제 중 헤파리노이드를 함유하는 샘플을 ATIII을 함유하는 작업 완충제를 사용하여 1:20으로 다시 희석하고, 프로브 로터에 2벌로 넣었다. 인자 Xa 시약 및 발색 기질을 자동화 응고 장치 ACL 7000의 정해진 저장고에 넣었다.
항-FXa 활성 측정은 ACL 7000 소프트웨어에 통합된 "헤파린" 프로토콜로 수행하였다. 분석하는 동안에 샘플 (작업 완충제로 희석한 것) 50 ㎕를 인자 Xa 시약 50 ㎕와 혼합하였다. 37℃에서 60초 동안의 인큐베이션 시간이 지난 후에 1.1 mM 농도의 발색 기질 50 ㎕를 첨가하고, 시간의 함수로서의 흡광도 변화를 405 nm의 파장에서 측정하였다.
얻어진 결과를 특히 하기 표 1에 기재한다:
상기 표에서, MM은 평균 분자 질량 (달톤)을 나타내고, 활성 "보정치"는 측정된 값에서 벌크 희석 효과를 보정할 수 있게 한다. 활성 보정치는 다음과 같이 계산된다:
활성 보정치 = (활성 측정치 × 제조된 화합물의 MM)/출발 물질의 MM
여기서,
. 제조된 화합물의 MM: 제조된 화합물의 이론적인 평균 몰 질량,
. 출발 물질의 MM: 출발 저분자량 헤파린의 평균 몰 질량.
이러한 결과는 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린이 천연 저분자량 헤파린과 유사한 항-인자 Xa 활성 및 항-인자 IIa 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 생물학적 성질의 유지는 이것들을 치료적으로 사용가능하게 한다.
2.
아비딘을
사용한 중화 후 항-
FXa
활성의 측정
용액 중
아비딘을
사용한,
바이오티닐화된
생성물 효과의 중화
생성물-의존적 항-FXa 또는 항-FIIa 항-트롬빈 활성은, 생성물의 바이오틴에 대한 아비딘의 결합이 상기 활성에 미치는 효과를 측정하기 위해서 아비딘의 농도를 증가시켜가며 측정한다.
시험 생성물을 0.9％ NaCl을 함유하는 물 중에 1 mg/mL로 용해시켰다. 이어서, 상기 생성물을 희석하여 항-트롬빈 (인간 항-트롬빈, 이탈리아 밀라노)의 존재하에 인자 Xa (팩터(Factor) Xa, 이탈리아 밀라노 소재의 크로모제닉스(Chromogenix)) 또는 인자 IIa (팩터 IIa, 프랑스 스트라스부르(Strasbourg) 소재의 라보라뚜아 뒤 상(laboratoire du sang) [블러드 래버러토리(Blood Laboratory)])의 활성을 50％ 억제할 수 있는 생성물의 농도가 되도록 하였다. 이후, 아비딘 (시그마(Sigma), 난 흰자의 아비딘, Ref. A-9275, NaCl 중에 희석함)의 농도가 300, 30, 3, 0.3, 0.03, 0.003, 0 ㎍/mL로 감소되도록 하면서 이러한 억제를 측정하였다. 인자 Xa (또는 인자 IIa)의 잔류 활성의 검정은 인자 Xa의 경우에는 S2222 (이탈리아 밀라노 소재의 크로모제닉스), 인자 IIa의 경우에는 기질 S2238 (이탈리아 밀라노 소재의 크로모제닉스)의 특정 발색 기질을 첨가하여 수행하였다. 광학 밀도는 405 nm에서 판독하였다.
완충제
중
비드에
결합된
아미딘에
대한
바이오티닐화된
생성물의 결합 입증
생성물의 아비딘-결합능을 평가하기 위해서, 상기 생성물을 비드에 결합된 아비딘과 접촉하게 두었다. 상기 혼합물을 원심분리한 후, 상등액 중에서 항-FXa 또는 항-FIIa 활성을 측정하였다. 상기 활성은 매질 중에 남아있는 농도를 측정할 수 있게 하여 혼합물의 원심분리 후에 펠렛에 포획된 생성물의 비율을 결정할 수 있다.
시험 생성물을 0.9％ NaCl 용액 중에 1 mg/mL로 용해하였다. 생성물을 희석하여 시험물 중에 존재하는 항-FXa 또는 항-FIIa 활성의 80％를 억제할 수 있도록 하였다. 상기 비드 용액을 세척 완충제 (20 mM tris-말레에이트, 150 mM NaCl, pH 7.35)로 희석하여 1 mg/mL이 되도록 하였다. 상기 용액을 교반하고, 비드 (1 mg/mL)를 함유하는 용액 100 ㎕를 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣었다. 완충제 500 ㎕를 첨가하였다. 상기 튜브를 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후에 펠렛을 완충제 500 ㎕ 중에 취하였다. 교반한 후에 두번째 원심분리를 수행하고 상등액은 다시 버렸다. 이어서, 생성물 용액이 비드를 함유하는 다른 용액과 접촉되도록 하면서 생성물/비드 비율이 아비딘 (시그마 아비딘 Ref. A-9275, 배치에 따라 약 3 mg/mL의 용액) 1 ㎍ 당 생성물의 ㎍으로 표현할 때 1, 0.1, 0.01 및 0.001이 되도록 하였다. 이어서, 상기 혼합물을 교반하고, 1시간 동안 방치한 후에 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 취하여 항-FXa 활성을 검정하여, 상등액 중에 남아있는 생성물의 농도를 결정하였다. 항-FXa 또는 항-FIIa 활성을 문헌 [Teien A.N and Lie M., Thrombosis Research, 1977, 10, 399-410]에 기재된 방법을 변형시킨 방법에 따라 검정하였다. 얻어진 결과를 특히 하기 표 2에 기재하였다:
| 아비딘의 양 (㎍) | 잔류 항- FXa 활성 | |
| NH LC 바이오티노일 에녹사파린 | 0.034 | 19％ |
| NH 바이오티노일 에녹사파린 | 0.0245 | 19％ |
| NH LC LC 바이오티노일 에녹사파린 | 0.0276 | 13％ |
따라서, 저분자량 헤파린이 80％ 초과의 바이오티닐화 정도로 실제로 바이오틴으로 관능화되었고, 실제로 아비딘으로 중화될 수 있다는 것이 확인되었다.
본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린은 약제의 제조에 사용될 수 있다. 이것들은 특히 항-혈전성 약제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 측면에 따라, 본 발명의 대상은 상기 정의한 바와 같은 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 포함하는 약제이다. 이들 약제는 치료제로서, 특히 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증, 말초 동맥 혈전증, 예컨대 하지 동맥병증, 대뇌 동맥 혈전증 및 졸중의 경우에서의 치료 및 예방에 유용하다. 이것들은 또한 평활근 세포의 증식 또는 혈관신생(angiogenesis)의 예방 및 치료, 및 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증에 대한 신경보호제로서도 유용하다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, 본 발명은 또한 유효 용량의 본 발명에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 언급한 병리를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 상기 언급한 병리의 치료 및 예방에 있어서 상기 정의한 바와 같은 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 용도는 본 발명의 일부를 구성하며, 이들 병리의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서 상기 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 용도 역시 본 발명의 일부를 구성한다.
본 발명의 또다른 측면에 따라, 본 발명의 대상은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하고, 또한 1종 이상의 제약상 허용가능한 불활성 부형제를 포함하는 제약 조성물이다. 상기 부형제는 원하는 제약 형태 및 투여 방식, 예를 들어 경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 경점막(transmucous), 국소 또는 직장 경로에 따라 선택된다.
각각의 투여량 단위에서, 활성 성분은 원하는 예방 또는 치료 효과 달성에 적합하다고 여겨지는 1일 투여량으로 존재한다. 각각의 투여량 단위는 20 내지 150 mg, 유리하게는 40 내지 100 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다. 항-응고제 화합물의 이 정도 용량은 정맥내 주사, 볼루스 또는 주입물로서 0.2 g 내지 2 g 범위 용량의 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 중화될 수 있다.
더 높거나 더 낮은 투여량이 적절한 특수한 경우가 있을 수 있으며, 이때의 투여량이 본 발명의 범위에서 벗어나는 것은 아니다. 통상의 관행에 따라, 각 환자에게 적합한 투여량은 투여 방식 및 환자의 체중 및 반응에 따라 담당 의사가 결정한다.
본 발명에 따른 화합물은 원하는 요법에 유용한 1종 이상의 다른 활성 성분, 예를 들어 항-혈전제, 항-응고제 또는 항-혈소판 응집제와 조합되어 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 중화시킬 수 있다는 것을 특징으로 하는, 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 사용 방법이다. 따라서, 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 본 발명에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 중화시키는 약제를 제조하는데 사용될 수 있다.
Claims (19)
- 평균 분자량이 3,000 내지 7,000 Da이고 성분 다당류가 그의 환원 말단에서 바이오틴 또는 바이오틴 유도체에 공유 결합된 것을 특징으로 하는 저분자량 헤파린.
- 제1항에 있어서, 성분 다당류가 하기 화학식 I에 상응하는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염:<화학식 I>
상기 식에서,i는 0 또는 1이고,R1은 화학식또는
의 배열을 나타내고, 여기서의 j 및 k는 동일하거나 상이할 수 있으며, 1 내지 10의 임의의 값일 수 있는 정수이고,
Biot는 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체를 나타내고,PE는 헤파린의 성분 다당류 구조를 갖는 다당류 쇄를 나타내고,X는 H 또는 SO3Na를 나타내고,Y는 SO3Na 또는 COCH3을 나타내며,물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합을 나타낸다. - 제2항에 있어서, i가 0인 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제2항에 있어서, i가 1이고 R1이 화학식 (a)에서 j가 5인 배열을 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제2항에 있어서, i가 1이고 R1이 화학식 (b)에서 j 및 k가 동일하게 5인 배열을 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Biot가화학식의 바이오틴기를 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성분 다당류 중 60％ 이상이 그의 환원 말단에 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 공유 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제7항에 있어서, 성분 다당류 중 80％ 이상이 그의 환원 말단에 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 공유 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 성분 다당류 중 90％ 이상이 그의 환원 말단에 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 공유 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 에녹사파린, 아르데파린, 베미파린, 파르나파린 및 틴자파린으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,· 성분 다당류 중 9％ 내지 20％가 평균 분자량이 2,000 Da 미만이고,· 성분 다당류 중 5％ 내지 20％가 평균 분자량이 8,000 Da 초과이고,· 성분 다당류 중 60％ 내지 86％가 평균 분자량이 2,000 내지 8,000 Da이고,· 질량-평균 분자량과 수-평균 분자량 사이의 비율이 1.3 내지 1.6이며,· 헤파린에 비해 더 우수한 생체이용률 및 항-혈전 활성을 갖고, 평균 분자량이 대략 3,500 내지 5,500 Da 사이인 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
- a) 아민 염 및 환원제의 존재하에 20℃ 내지 80℃의 온도에서 저분자량 헤파린에 환원적 아미노화를 수행하는 단계, 및b) 이후, 수성 매질 또는 유기 매질 중 염기의 존재하에 활성화된 -(R1)i-Biot기 (여기서, R1, i 및 Biot는 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같음)와의 아실화를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 제조하는 방법.
- 제12항에 있어서,a) 암모늄 할라이드 염 및 보로하이드라이드 염의 존재하에 50℃ 내지 80℃의 온도에서 저분자량 헤파린에 환원적 아미노화를 수행하는 단계, 및b) 이후, 수성 매질 중 염기의 존재하에 활성화된 에스테르 형태의 -(R1)i-Biot기와의 아실화를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 상기 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.
- 활성 성분으로서의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린 또는 상기 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 제약상 허용가능한 염, 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 저분자량 헤파린의 항-혈전성 약제로서의 용도.
- 제16항에 있어서, 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증, 말초 동맥 혈전증, 예컨대 하지 동맥병증, 대뇌 동맥 혈전증 및 졸중의 경우에서의 치료 및 예방, 평활근 세포의 증식 또는 혈관신생(angiogenesis)의 치료 및 예방, 및 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증에 대한 신경보호제로서의 용도.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 중화시킬 수 있다는 점을 특징으로 하는, 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 사용 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 바이오티닐화된 저분자량 헤파린을 중화시키기 위한 약제의 제조에 있어서 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 용도.
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