ES2567079T3 - Composiciones de polisacáridos que no son anticoagulantes - Google Patents

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Takashi Kei Kishimoto
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Abstract

Una preparación de polisacáridos que tiene una actividad anti- Xa y una actividad anti-IIa cada una de ellas de menos que 50 UI/mg, en que la preparación no tiene residuos de un ácido urónico escindidos en glicol y en que la preparación se compone de unos polisacáridos de Fórmula I: -U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n en que n es un número entero tal que n >= 1-20; w >= -2OS o -2OH; x >= -NS o -NAc; y >= -3OS o -3OH; z >= -6OS o -6OH; y en que U indica un residuo de un ácido urónico y H indica un residuo de una hexosamina; y en que los w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo de U o H, y en que la preparación es obtenible por un método que comprende digerir una heparina no fraccionada (UFH) con la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de polisacaridos que no son anticoagulantes ANTECEDENTES
Un compuesto de heparina, que es un glucosaminoglucano similar a heparina, que esta sulfatado en alto grado (HLGAG acronimo de “heparin like glycosaminoglycan”) que ha sido producido por unas celulas cebadas y aislado a partir de unas fuentes naturales, es un agente anticoagulante clmico ampliamente usado. Sin embargo, los efectos de una heparina natural, o no fraccionada, pueden ser diffciles de predecir y los pacientes deben de ser vigilados estrechamente para evitar un efecto de anticoagulacion excesiva o deficitaria. Las heparinas de bajo peso molecular (LMWHs acronimo de “low molecular weight heparins”), que se han obtenidas por diversos metodos de fraccionamiento o despolimerizacion de una heparina polimerica, tienen una mas predecible accion farmacologica como agentes anticoagulantes, unos reducidos efectos colaterales, una actividad antitrombotica prolongada, y una biodisponibilidad mejor que la de una heparina no fraccionada (UFH acronimo de “unfractionated heparin”). Varias LMWHs han sido aprobadas para el tratamiento de unas condiciones tromboticas de pacientes externos.
Existe un creciente interes en el cometido potencial de ciertos agentes antitromboticos en la gestion de los pacientes de cancer. Los resultados procedentes de diversas pruebas clrnicas recientes han sugerido la existencia de una ventaja de supervivencia para ciertos tipos de pacientes de cancer, que han sido tratados con unas LMWHs (como se ha recopilado en la cita bibliografica de Lemoine, 2005, Journal of Clinical Oncology, 23: 2119-20).
SUMARIO
La presente divulgacion esta basada, en parte, en el desarrollo de unas preparaciones de polisacaridos, p.ej. de unas preparaciones de polisacaridos que se derivan de una heparina, que carecen de una actividad anticoagulante sustancial (p.ej. que sustancialmente no tienen ninguna actividad anticoagulante), pero que retienen una actividad en otros procesos biologicos que no son mediados por una coagulacion, y de unos metodos para producirlas. Estos compuestos pueden tener una o mas de las siguientes caractensticas: 1) una actividad anti-Xa y una actividad anti- Ila, cada una de ellas de menos que 50 Ul/mg, y 2) una actividad anti-metastasica, anti-angiogenica, anti-fibrotica y/o anti-inflamatoria. Los polisacaridos que aqrn se divulgan pueden tener tambien unas caractensticas estructurales que los distinguen con respecto de otros polisacaridos (p.ej. de unas heparinas que estan disponibles comercialmente). Por ejemplo, una preparacion de polisacarido que aqrn se describe puede tener una o mas de las siguientes caractensticas: la preparacion tiene un peso molecular medio ponderado comprendido entre 3.500 y
7.000 Da; la preparacion no tiene sustancialmente residuos modificados de hexosaminas o de acidos uronicos, p.ej. no tienen sustancialmente residuos de acidos uronicos en los se ha escindido por lo menos una de sus funciones de glicol; la preparacion tiene mas de 40 % de unos residuos del disacarido U2sHns,6s; un grado de sulfatacion de la preparacion de menos que 40 % ; una o mas cadenas de polisacaridos de la preparacion tiene(n) una insaturacion en la posicion 4,5 de un residuo de un acido uronico con un extremo no reductor, y la preparacion tiene menos que 10 % del tetrasacarido -UHnac,6sGHns,3s,6s. Esta divulgacion incluye unas preparaciones que tienen una o mas de estas propiedades y caractensticas, asf como unos metodos para producir y usar dichas preparaciones.
De acuerdo con el presente invento, se proporciona una preparacion de polisacaridos tal como se definira en las reivindicaciones adjuntas. Tambien se proporcionan unas composiciones farmaceuticas, unos metodos para su produccion y unos usos que se definiran en las reivindicaciones adjuntas.
Mas generalmente, la presente divulgacion tiene como caractenstica una preparacion de polisacaridos (p.ej. una preparacion que se deriva de una heparina) que incluye (p.ej. que consiste esencialmente en) unos polisacaridos de la Formula I:
-U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n
en que n es un numero entero tal que n es = 1-20 (p.ej., 1-10, 1-11,1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16,1-17,1-18 o
1-19); w es = -2OS o -2OH; x es = -NS o -nAc; y es = -3OS o -3OH; z es = -6OS o -6OH; y
en que U indica un residuo de un acido uronico y H indica un residuo de una hexosamina; y en que los w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo de U o H.
La divulgacion tiene tambien como caractenstica una preparacion de polisacaridos (p.ej. una preparacion que se deriva de una heparina) que tiene un peso molecular medio ponderado comprendido entre 3.500 y 7.000 Da (p.ej. entre 3.500 y 5.000 Da) y una actividad anticoagulante reducida (p.ej. no tiene sustancialmente ninguna), en que la preparacion incluye (p.ej. consiste esencialmente en) unos polisacaridos que comprenden la Formula I:
-U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n
en que n es un numero entero tal que n es = 1-20 (p.ej., 1-10, 1-11,1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16,1-17,1-18, o
1-19); w es = -2OS o -2OH; x es = -NS o -NAc; y es = -3OS o -3oH; z es = -6OS o -6OH;
en que U indica un residuo de un acido uronico y H indica un residuo de una hexosamina; y en que los w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo de U o H.
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La divulgacion tiene tambien como caractenstica una preparacion de polisacaridos (p.ej. una preparacion que se deriva de una heparina) que carece de actividad anticoagulante sustancial (p.ej. que sustancialmente no tiene ninguna), en que la preparacion se compone esencialmente de unos polisacaridos de la Formula I:
-U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n
en que n es un numero entero tal que n es = 1-20 (p.ej., 1-10, 1-11,1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16,1-17,1-18, o 1-19); w = -2OS o -2OH; x = -NS o -NAc; y = -3OS o -3OH; z = -6OS o -6OH;
en que U indica un residuo de un acido uronico y H indica un residuo de una hexosamina; y en que w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo de U o H, y en que la composicion tiene una actividad anti-Xa y una actividad anti-IIa, cada una de ellas de menos que 50 Ul/mg (p.ej., una actividad anti-Xa de menos que aproximadamente 45 Ul/mg, 40 Ul/mg, 35 Ul/mg, 30 Ul/mg, 25 Ul/mg o 20 Ul/mg y una actividad anti-IIa de menos que aproximadamente 40 Ul/mg, 30 Ul/mg, 20 Ul/mg, 15 Ul/mg, 10 Ul/mg o 5 Ul/mg).
La divulgacion tiene tambien como caractenstica una preparacion de polisacaridos (p.ej. una preparacion que se deriva de una heparina) que tiene las siguientes caractensticas: (a) un peso molecular medio ponderado comprendido entre 3.500 y 7,000 Da (p.ej., comprendido entre 3.500 y 5.000 Da); (b) una actividad anti-Xa y una actividad anti-lla cada una de ellas de menos que 50 Ul/mg (p.ej., una actividad anti-Xa de menos que aproximadamente 45 Ul/mg, 40 Ul/mg, 35 Ul/mg, 30 Ul/mg, 25 Ul/mg o 20 Ul/mg y una actividad anti-lla de menos que aproximadamente 40 Ul/mg, 30 Ul/mg, 20 Ul/mg, 15 Ul/mg, 10 Ul/mg o 5 Ul/mg); y (c) sustancialmente no esta presente en la preparacion ningun residuo de un acido uronico que ha sido escindido en una de sus funciones de glicol (p.ej. menos que 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o nada).
Tambien se divulgan unas sales farmaceuticamente aceptables de cualquiera de las preparaciones que aqrn se describen (p.ej. que mas arriba se han descrito) y unas composiciones (p.ej. unas composiciones farmaceuticas) que comprenden las preparaciones que aqrn se describen y/o sus sales farmaceuticamente aceptables.
Cualquiera de las preparaciones que aqrn se describen, p.ej. que se han descrito mas arriba, puede tener otras propiedades. P.ej., una de las preparaciones o composiciones farmaceuticas que se han descrito mas arriba, puede tener adicionalmente una o mas de las propiedades funcionales o estructurales que se han exponen mas adelante.
En un ejemplo, la preparacion tiene un peso molecular medio ponderado comprendido entre 3.500 y 7.000 Da (p.ej., entre 3.500 y 6.000 Da; entre 3.500 y 5.500 Da; entre 3.500 y 5.000 Da; entre 4.000 y 6.000 Da; entre 4.000 y 5.500 Da; entre 4.000 y 5.000 Da; entre 4.500 y 5.500 Da; entre 4.500 y 5.000 Da).
En un ejemplo, la preparacion tiene una actividad anti-Xa y una actividad anti-lla cada una de ellas de menos que 50 Ul/mg (p.ej., una actividad anti-Xa de menos que aproximadamente 45 Ul/mg, 40 Ul/mg, 35 Ul/mg, 30 Ul/mg, 25 Ul/mg o 20 Ul/mg y una actividad anti-lla de menos que aproximadamente 40 Ul/mg, 30 Ul/mg, 20 Ul/mg, 15 Ul/mg, 10 Ul/mg o 5 Ul/mg).
En un ejemplo, la preparacion incluye mas que un 40 % de residuos del disacarido U2sHns,6s (p.ej., mas que un 50 %, 60 %, 70 % o 80 % de residuos del disacarido U2sHns,6s).
En un ejemplo, las preparaciones incluyen unas cadenas de polisacaridos que tienen un grado de desulfatacion de menos que un 40 % (p.ej. de menos que un 30 %, 20 % o 10 %). El grado de desulfatacion, tal como se usa en el presente contexto, se define como la reduccion porcentual, expresada en moles de sulfato por moles de una unidad de disacarido, en comparacion con una heparina no fraccionada.
En un ejemplo, las preparaciones incluyen unas cadenas de polisacaridos que tienen un grado de sulfatacion mayor que o igual a 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4 o 2,6. El grado de sulfatacion, tal como se usa en el presente contexto, se define como el numero medio de moles de sulfato por moles de una unidad de disacarido.
En un ejemplo, por lo menos una de las cadenas de polisacaridos existentes en la preparacion o composicion tiene una insaturacion en la posicion 4,5 en el extremo no reductor (p.ej. como un resultado de la digestion con una heparinasa o de la esterificacion con bencilo, seguida por una beta-eliminacion). Por ejemplo, aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o sustancialmente la totalidad de los acidos uronicos no reductores existentes en la preparacion o composicion tienen una insaturacion en la posicion 4,5.
En un ejemplo, la preparacion o composicion incluye un nivel mas bajo del -UHnac,6sGHns,3s,6s que la enoxaparina, la dalteparina y/o la UFH. P.ej. la preparacion o composicion incluye aproximadamente de 0 a 4 % en moles, p.ej., de 0 a 3 % en moles, p.ej., de 0 a 2 % en moles del -UHnac,6sGHns,3s,6s.
En un ejemplo, aproximadamente 10-40 % (p.ej., aproximadamente 10-35 %, aproximadamente 10-30 %, aproximadamente 15-35 %, aproximadamente 15-30 %, aproximadamente 20-35 %, aproximadamente 20-30 %) de las cadenas de polisacaridos de la preparacion incluyen el pentasacarido Hnac,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s.
En un ejemplo, la preparacion incluye aproximadamente 10-40 % (p.ej., aproximadamente 10-35 %, aproximadamente 10-30 %, aproximadamente 15-35 %, aproximadamente 15-30 %, aproximadamente 20-35 %, aproximadamente 20-30 %) de las cadenas de polisacaridos que contienen el tetrasacarido -U2sHnac,6sGHns,3s,6s.
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En un ejemplo, la preparacion no tiene sustancialmente (p.ej., tiene menos que 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o nada) de residuos de un acido uronico que ha sido escindido en una de sus funciones de glicol.
En un ejemplo, la preparacion o composicion tiene una distribucion de pesos moleculares tal que 10-50 % (p.ej., 2050 %, 20-45 %, 25-50 %, 25-45 %, 30-50 %, 30-45 % o 35-45 %) de los oligosacaridos de la preparacion tienen un peso molecular < 3.000 Da; 40-65 % (p.ej., 40-60 %, 40-55 % o 40-50 %) de los oligosacaridos tienen un peso molecular comprendido entre 3.000-8.000 Da, y 5-30 % (p.ej., 5-25 %, 5-20 %, 5-15 %, 10-25 % o 10-20 %) de los oligosacaridos tienen un peso molecular > 8.000 Da.
En un ejemplo, la preparacion tiene una polidispersidad de aproximadamente 1,6 a 2,1 (p.ej., de aproximadamente 1,6 a 2,0, de aproximadamente 1,7 a 2,0, de aproximadamente 1,6 a 1,9, de aproximadamente 1,7 a 1,9).
En un ejemplo, la preparacion o composicion tiene una significativa actividad anti-metastasica.
En un ejemplo, la preparacion o composicion se fija espedficamente, o inhibe, a una actividad de una o mas de las sustancias: VEGF, fGf, SDF-1 o P-selectina.
En un ejemplo, la preparacion o la composicion tiene un contenido de calcio de menos que 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %,
1.0 % y/o un contenido de sodio de menos que 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %. En un ejemplo la preparacion o composicion comprende: menos que 1.000 ng/mg, 750 ng/mg, 500 ng/mg, 250 ng/mg de una enzima heparinasa, p.ej. una enzima heparinasa como aqrn se describe, menos que 1,0 %, 0,5 %, 0,3 % p/p de metanol; y menos que
2.0 %, 1,75 %, 1,25 %, 1,0 %, 0,5 %, 0,3 %, 0,15 % de cloruro.
La divulgacion tiene tambien como caractenstica unos metodos para producir una preparacion de polisacaridos. Los metodos incluyen digerir una UFH con una enzima que disocia en el pentasacarido Hnac/s,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s (p.ej. en el enlace situado entre los residuos Hns,3s y I2s) y/o disocia a un disacarido I2sHns,3s o I2sHac. En algunos casos, la enzima es una enzima heparinasa (p.ej. la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron).
Se divulgan tambien unos metodos para producir una preparacion, que incluyen: (1) digerir una UFH con una enzima heparinasa que disocia en el pentasacarido Hnac/s,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s (p.ej. en el enlace situado entre los residuos Hns,3s y I2s) y/o disocia a un I2sHns o I2sHac (p.ej. la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron), (2) vigilar la absorbancia a 232 nm durante la etapa de digestion; y (3) detener (p.ej., sofocar) la reaccion de digestion cuando la absorbancia a 232 nm esta situada entre 1,7 y 2,0. En un ejemplo, la enzima heparinasa esta presente en una cantidad de aproximadamente 1,0 a 5,0 Ul/g de UFH. En un ejemplo, la etapa de digestion no incluye un tratamiento de la reaccion de digestion con un agente reductor tiolico (p.ej., ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, o un compuesto similar).
La divulgacion tiene tambien como caractenstica unos metodos para producir una preparacion de polisacaridos. Los metodos incluyen: (1) digerir una heparina no fraccionada (UFH) con una enzima heparinasa que disocia en el pentasacarido Hnac/s,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s, p.ej., disocia en el enlace situado entre los residuos Hns,3s y I2S y/o disocia a un I2sHns o I2sHac (p.ej., la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron), para proporcionar un polisacarido; y (2) aislar el polisacarido (p.ej., por precipitacion con una sal y con un disolvente organico polar), para producir de esta manera una preparacion de polisacaridos.
En un ejemplo, la etapa de digestion incluye tratar la UFH con la enzima (p.ej., en una cantidad de aproximadamente
1.0 a 5,0 UI/g de UFH); vigilar la absorbancia a 232 nm durante la etapa de digestion; y detener (p.ej., sofocar) la reaccion de digestion cuando la absorbancia at 232 nm alcanza un valor situado entre 1,7 y 2,0. En un ejemplo, la etapa de digestion no incluye un tratamiento de la reaccion de digestion con un agente reductor tiolico (p.ej., ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol o un compuesto similar).
En un ejemplo, la preparacion es evaluada en cuanto a una actividad biologica, p.ej., una actividad antimetastasica; una fijacion a cualquiera de las protemas VEGF, FGF, SDF-1 y P-selectina; o una inhibicion de una actividad de cualquiera de las protemas VEGF, FGF, SDF-1 y P-selectina.
La divulgacion tiene tambien como caractenstica una preparacion de polisacaridos que se ha producido por un metodo que aqrn se describe.
Tambien se divulga una mezcla intermedia o de reaccion procedente de cualquiera de los metodos para producir o analizar una preparacion de polisacaridos que aqrn se describe.
La divulgacion tiene tambien como caractenstica una composicion farmaceutica que incluye una preparacion de polisacaridos que aqrn se describe.
En un ejemplo, la composicion farmaceutica incluye adicionalmente un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
La divulgacion tiene tambien como caractenstica un metodo para tratar a un sujeto, que incluye administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una preparacion de polisacaridos que aqrn se divulga. Los terminos "tratar", "tratamiento" y otros similares, significan administrar la preparacion a un sujeto o a una celula o a un tejido de un sujeto con el fin de obtener un deseado efecto farmacologico, fisiologico o clmico. Un tratamiento con una preparacion de polisacaridos que aqrn se describe puede disminuir, reducir, mitigar, mejorar, retrasar o prevenir una condicion indeseada existente o el comienzo de un smtoma de esta. Una "cantidad terapeuticamente efectiva" se
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refiere a una cantidad que es efectiva, en unas dosificaciones y durante unos penodos de tiempo, que se necesitan para conseguir el deseado efecto farmacologico, fisiologico o clmico en el sujeto.
Tambien se divulgan unos metodos para tratar a un sujeto que tiene, o esta en riesgo de tener, un trastorno metastasico (p.ej. un cancer, p.ej. un carcinoma u otro cancer solido). En esos sujetos, un tratamiento puede incluir, pero no esta limitado a, un crecimiento tumoral inhibido, una reduccion en la masa tumoral, una reduccion en el tamano o en el numero de unas lesiones metastasicas, un desarrollo inhibido de nuevas lesiones metastasicas, una prolongada supervivencia, una prolongada supervivencia libre de progresion, un penodo de tiempo prolongado hasta la progresion y/o una calidad de vida aumentada. En otro ejemplo, el sujeto puede tener un trastorno o una condicion que se selecciona entre el conjunto que se compone de: un trastorno inflamatorio, un trastorno autoinmunitario, un trastorno fibrotico o fibroproliferativo o un trastorno atopico. Unos ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad pulmonar obstructiva cronica, un asma, una artritis reumatoide, una enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo a una enfermedad de Crohn y una colitis ulcerosa), una esclerosis multiple, una psoriasis, unas lesiones por reperfusion - isquemia, un choque septico, una degeneracion macular relacionada con la edad, una aterosclerosis, una enfermedad de Alzheimer, una enfermedad cardiovascular, una vasculitis, unas diabetes de los tipos I y II, un smdrome metabolico, una retinopatfa diabetica y una reestenosis. Unos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, un asma, una artritis reumatoide, una enfermedad inflamatoria intestinal, una esclerosis multiple, una psoriasis, una diabetes del tipo I, un lupus eritematoso sistemico (SLE acronimo de systemic lupus erythematosus), un smdrome de Sjogren, una tiroiditis de Hashimoto, una enfermedad de Graves, un smdrome de Guillain-Barre, una hepatitis autoinmunitaria y una miastenia grave. Unos ejemplos de enfermedades fibroticas incluyen, pero no se limitan a, una escleroderma, una enfermedad pulmonar obstructiva cronica, una retinopatfa diabetica, una sarcoidosis, una fibrosis pulmonar idiopatica, una cirrosis, una fibrosis qmstica, unos fibroides postoperatorios y una reestenosis. Unos ejemplos de una enfermedad atopica incluyen, pero no se limitan a, una dermatitis atopica, un asma atopico y una rinitis alergica. Las composiciones se administran a un sujeto que tiene, o esta en riesgo de desarrollar, una o mas de las enfermedades, en una cantidad eficaz para tratar el trastorno o la condicion.
En un ejemplo preferido, el sujeto tiene, o esta en riesgo de tener, un cancer o un trastorno metastasico (p.ej., un carcinoma). Por ejemplo, el sujeto tiene un tumor primario y tiene, o esta en riesgo de tener, una metastasis de ese tumor primario.
En un ejemplo, la preparacion de polisacarido se administra por via intravenosa o subcutanea.
En un ejemplo, la preparacion de polisacaridos se administra en combinacion con otra terapia, p.ej. con otro agente terapeutico, p.ej. con un agente citotoxico o citostatico, y en unas combinaciones de los mismos.
En un ejemplo, la preparacion de polisacaridos se administra cronicamente, p.ej. al menos dos veces durante un penodo de tiempo espedfico, p.ej. por lo menos dos veces durante un penodo de tiempo de seis meses. En un ejemplo, una preparacion de polisacaridos se administra dos veces durante un penodo de tiempo de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, un ano o que incluso es mas largo. La preparacion de polisacaridos se puede administrar diariamente (p.ej. una vez, dos veces, o tres o cuatro veces por dfa), un dfa sf y otro no, semanalmente (p.ej. una vez, dos veces o tres veces por semana), una semana sf y otra no, mensualmente o segun cualquier otro esquema de administracion cronica.
Una preparacion de polisacaridos que carece de una actividad anticoagulante sustancial, tal como se usa en el presente contexto, es una que tiene una actividad anti-Xa y anti-IIa en cada caso de menos que 100 UI/mg (p.ej., de menos que 80 UI/mg, 70 UI/mg o 60 UI/mg). En algunos casos, la preparacion de polisacaridos no tiene sustancialmente ninguna actividad anticoagulante, es decir una actividad anti-Xa y anti-IIa en cada caso de menos que 50 UI/mg.
Para cualquiera de las gamas que aqm se describen, p.ej. para una estructura o actividad dada, las gamas pueden ser las gamas que se han divulgado asf como otras gamas. Por ejemplo, una gama construida a partir de un punto final mas bajo de una gama, p.ej. para un bloque de construccion o una actividad que se haya establecido, se puede combinar con el punto final superior de otra gama, p.ej. para el bloque de construccion o la actividad que se haya establecido, para proporcionar una gama.
Una preparacion de polisacaridos "aislada" o "purificada" esta sustancialmente libre de material celular o de otras protemas contaminantes procedentes de la fuente celular o tisular a partir de la que se deriva el polisacarido, o esta sustancialmente libre de compuestos precursores qmmicos o de otros compuestos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente. El concepto de "sustancialmente libre" significa que una preparacion es pura en por lo menos un 50 % (en peso/peso). En un ejemplo preferido, la preparacion tiene menos que aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % y mas preferiblemente 5 % (peso en seco) de unos polisacaridos que no se derivan de una heparina, de unas protemas o de unos compuestos precursores qmmicos u otros compuestos qmmicos, p.ej. procedentes de la produccion. A estos se hace tambien referencia como "contaminantes". Unos ejemplos de contaminantes, que pueden estar presentes en una preparacion de polisacaridos que aqm se describe, incluyen, pero no se limitan a, calcio, sodio, una enzima heparinasa (u otra enzima que tenga una similar especificidad para substratos), metanol, etanol, cloruro, sulfato, sulfato de dermatano y sulfato de condroitina.
Otras caractensticas y ventajas resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y a partir de las reivindicaciones.
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BREVE DESCRIPCION DEL DIBUJO
La Figura 1 es un grafico de barras que muestra el efecto de una preparacion de polisacaridos que aqm se describe en un modelo de metastasis experimental de melanoma murino (B16F10 i.v.). Se determino una carga tumoral pulmonar (peso pulmonar - peso pulmonar normal) para unas ratonas C57BL/6 hembras (con una edad de 9-10 semanas) desafiadas con una inyeccion i.v. de 2x105 celulas de B16F10 y tratadas previamente con una unica dosis (10 mg/kg) de MONC703 (tanda R-6-1), dalteparina/Fragmin® o MoNc 202 (testigo negativo, un polisacarido N-desulfatado) inmediatamente antes de la inyeccion. El adjetivo "normal" designa a unas ratonas no desafiadas y no tratadas.
DESCRIPCION DETALLADA Polisacaridos optimizados
En muchos ajustes o escenarios clmicos, unas preparaciones de LMWH comercialmente disponibles se prefieren frente a unas preparaciones de UFH como agentes anticoagulantes, puesto que las LMWHs tienen una farmacocinetica mas predecible y se pueden administrar por via subcutanea. Sin embargo, a causa del potencial para complicaciones hemorragicas debidas a sus efectos anticoagulantes, las preparaciones de LMWH actualmente disponibles son menos apropiadas para una terapia de trastornos no mediados por coagulacion, y/o para unos trastornos que pueden requerir unas dosis mas altas o unos regfmenes de dosificacion cronicos. La divulgacion tiene como caractenstica unas preparaciones de polisacaridos que estan disenadas para carecer de una actividad anticoagulante sustancial al mismo tiempo que retienen unas propiedades clmicamente ventajosas. Las propiedades de las preparaciones de polisacaridos incluyen p.ej. carecer de una actividad coagulante sustancial, p.ej. no tener sustancialmente ninguna actividad anticoagulante (p.ej. tener una actividad anti-IIa de menos 50 UI/mg, una actividad anti-Xa de menos que 50 UI/mg), y tener una actividad anti-metastasica, anti-angiogenica y/o anti- inflamatoria.
Unos ejemplos de tales preparaciones incluyen unas cadenas que incluyen el siguiente:
-U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n
en que n es un numero entero tal que n es = 1-20; w es = -2OS o -2OH; x es = -NS o -NAc; y es = -3OS o -3OH; z es = -6OS o -6OH; en que U indica un residuo de un acido uronico y H indica un residuo de una hexosamina; y en que los w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo U o H.
Actividad anti-IIa
Se divulgan aqm unas preparaciones de polisacaridos que proporcionan una actividad anti-IIa sustancialmente reducida, aproximadamente de 0 a 50 UI/mg, p.ej., aproximadamente de 0 a 40 UI/mg, aproximadamente de 0 a 30 UI/mg, aproximadamente de 0 a 25 UI/mg, aproximadamente de 0 a 20 UI/mg, aproximadamente de 0 a 10 UI/mg, aproximadamente de 5 a 10 UI/mg, aproximadamente de 5 a 15 UI/mg o aproximadamente de 5 a 20 UI/mg. La actividad anti-IIa se calcula en Unidades Internacionales UI de actividad anti-IIa por milfgramo usando unos metodos estadfsticos para ensayos lineales y paralelos. Los niveles de actividad anti-IIa que se describen aqm se miden usando el siguiente principio.
Polisacarido (PS) + ATIII—» [PS • ATIII]
IIa
PS • ATIII—[PS • ATIII • IIa] + IIa (Exceso)
IIa (Exceso) + Substrato — Peptido + pNA (medido por via espectrofotometrica)
La actividad anti-factor IIa se determina por medio del efecto potenciador de las muestras sobre la antitrombina (ATIII) en la inhibicion de trombina. Un exceso de trombina se puede medir indirectamente por via espectrofotometrica. La actividad anti-factor IIa se puede medir, p.ej. en un dispositivo analizador de Diagnostica Stago o en un sistema de ACL Futura3 Coagulation con unos reactivos procedentes de Chromogenix (Substrato S- 2238, Trombina (53 nkat/vial) y Antitrombina), o en cualquier sistema equivalente. La respuesta del analizador es calibrada usando la 2a Norma Internacional para Heparinas de Bajo Peso Molecular.
Actividad anti-Xa
Preferiblemente, una preparacion que aqm se proporciona tiene una actividad anti-Xa de aproximadamente de 0 a 50 UI/mg, aproximadamente de 0 a 40 UI/mg, aproximadamente de 0 a 30 UI/mg, aproximadamente de 0 a 25 UI/mg, aproximadamente de 10 a 50 UI/mg, aproximadamente de 20 a 50 UI/mg, aproximadamente de 20 a 40 UI/mg o aproximadamente de 30 a 40 UI/mg. La actividad anti-Xa de una preparacion se calcula en Unidades Internacionales de actividad anti-factor Xa por milfgramo usando unos metodos estadfsticos para ensayos lineales y paralelos. Los niveles de actividad anti-IIa que se describen aqm se miden usando el siguiente principio:
PS + ATIII — [PS • ATIII]
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PS • ATIII ^ [PS •ATIII • FXa] + FXa(Exceso)
FXa (Exceso) + Substrato ^ Peptido + pNA (medido por v^a espectrofotometrica)
La actividad anti-factor Xa se determina por medio del efecto potenciador de las muestras sobre la antitrombina (ATIII) en la inhibicion del Factor Xa activado (FXa). Un exceso de factor Xa se puede medir indirectamente por via espectrofotometrica. La actividad anti-factor Xa se puede medir, p.ej., en un dispositivo analizador de Diagnostica Stago con el estuche de ensayo Stachrom® Heparin Kit, en un sistema de ACL Futura3 Coagulation con el estuche Coatest® Heparin Kit procedente de Chromogenix, o en cualquier sistema equivalente. La respuesta del analizador se puede calibrar usando la Norma Internacional de NIBSC para Heparinas de Bajo Peso Molecular.
Peso molecular y longitud de las cadenas
Cuando se determina el peso molecular medio ponderado de una preparacion, un peso molecular medio ponderado aproximadamente de 3.500 a 7.000 Da, aproximadamente de 3.500 a 5.500 Da, de manera preferible de aproximadamente 4.500 a 5.500 Da o de aproximadamente 4.500 a 5.000 Da indica que un numero significativo de cadenas en la preparacion de polisacaridos tiene una suficiente longitud de las cadenas.
El concepto de "peso molecular medio ponderado", tal como se usa en el presente contexto, se refiere al valor medio ponderado, en daltones, de unas cadenas de repeticiones de un disacarido de acido uronico / hexosamina. La presencia de unos bloques de construccion que no son de acido uronico y/o que no son de hexosamina no se incluye en la determinacion del peso molecular medio ponderado. Por lo tanto, el peso molecular de unos bloques de construccion que no son de acido uronico y que no son de hexosamina dentro de una cadena o de unas cadenas en la preparacion no se debera incluir al realizar la determinacion del peso molecular medio ponderado. El peso molecular medio ponderado (Mw) se calcula a partir de la siguiente ecuacion: Mw = Hcmi) / £o. La variable c es la concentracion del polfmero en la rodaja i y la variable mi es el peso molecular del polfmero en la rodaja i. Las sumas se toman a lo largo de un pico cromatografico que contiene muchas rodajas de datos. Una rodaja de datos puede ser representada graficamente como una lmea vertical en una representacion grafica del pico cromatografico en funcion del tiempo. El pico de elucion se puede subdividir, por lo tanto, en muchas rodajas. El calculo del peso molecular medio ponderado es dependiente en promedio de la suma de todas las rodajas de la concentracion y del peso molecular. El peso molecular medio ponderado se puede medir, p.ej. usando el programa logico (software) de Wyatt Astra o cualquier otro programa logico. Los pesos moleculares medios ponderados que aqrn se describen se determinan mediante una cromatograffa en fase lfquida alta con dos columnas en serie, por ejemplo una TSK G3.000 SWXL y una G2000 SWXL, acopladas con un detector del dispersamiento de la luz en angulos multiples (MALS acronimo de multi angle light scattering) y un detector refractometrico en serie. El eluyente usado es un sulfato de sodio 0,2 M, de pH 5,0, y en un caudal de 0,5 ml/min.
La determinacion de si una preparacion de polisacaridos incluye unas cadenas con una longitud suficiente de las cadenas, se puede hacer, por ejemplo, determinando la longitud media de cadena de las cadenas en la preparacion y determinando el peso molecular medio ponderado de las cadenas que estan dentro de la preparacion. Cuando se determina una longitud media de cadena, una longitud media de cadena aproximadamente de 5 a 20, p.ej., aproximadamente de 7 a 18, aproximadamente de 7 a 14, aproximadamente de 7 a 12, aproximadamente de 7 a 10 o aproximadamente de 8 a 10 repeticiones de disacaridos indica que un numero significativo de las cadenas en la preparacion tienen una suficiente longitud de cadena.
El concepto de "longitud media de cadena", como se usa en el presente contexto, se refiere a la longitud media de cadena de unas repeticiones de disacaridos de acido uronico / hexosamina que se presentan dentro de una misma cadena. La presencia de unos bloques de construccion que no son de acido uronico y/o que no son de hexosamina (p.ej., restos de PEG fijados) no se incluye en la determinacion de la longitud media de cadena. La longitud media de cadena se determina dividiendo el peso molecular medio numerico (Mn) por el peso molecular medio numerico para un disacarido (500 Da). Unos metodos para determinar el peso molecular medio numerico se describen mas abajo usando el SEC MALS.
Acidos uronicos escindidos en una de sus fuciones de glicol
Una preparacion de polisacaridos que aqrn se describe puede no incluir sustancialmente la apertura de los anillos de glicosidos que convencionalmente se denominan derivados de reduccion-oxidacion (RO acronimo de “reduction - oxidation). Los derivados de RO tienen uno o mas anillos de glicosidos que ha(n) sido abierto(s), p.ej. en el enlace entre C2 y C3.
Estructura con un extremo no reductor
Una preparacion que aqrn se describe puede tener una mezcla de AU y de acido iduronico (I)/acido glucuronico (G) en el extremo no reductor de las cadenas de la preparacion. Preferiblemente, alrededor de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o la totalidad de las cadenas de polisacaridos de la preparacion tienen un AU. La nomenclatura "-U" se refiere a un acido uronico insaturado (acido iduronico (I), acido glucuronico (G) o acido galacturonico) que tiene un doble enlace que se ha introducido en la posicion 4-5 como un resultado, p.ej. de la accion como liasa de una heparinasa, una HSGAG liasa, u otra enzima que tenga una similar especificidad para un substrato. La cantidad de AU y/o de I/G en el extremo no reductor de las cadenas dentro de la muestra se puede determinar usando, p.ej., una 2D-RMN. En dichos metodos, el numero total de las cadenas que tienen una hexosamina acetilada (Hnac) en el extremo reductor y/o el numero de confirmaciones de que se ha abierto el anillo en el extremo reductor se pueden
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usar para determinar el numero total de las cadenas dentro de la preparacion. El porcentaje total de las cadenas que tienen un AU y/o I/G en el extremo no reductor se puede comparar con el numero total de cadenas en la preparacion. En algunas de las preparaciones que aqm se describen, menos que 90 %, menos que 95 %, menos que 98 %, menos que 99 %, o ninguna de las cadenas en la preparacion, tienen un AU sulfatado en el extremo no reductor.
Estructuras con un extremo reductor
En algunos casos, menos de un 50 %, p.ej., no mas que aproximadamente un 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de las cadenas en la preparacion tiene una estructura modificada con un extremo reductor.
Polidispersidad
La polidispersidad de unas preparaciones de polisacaridos que aqm se divulgan es de aproximadamente 2,1 o menos, p.ej., aproximadamente de 1,6 a 2,1 (p.ej., aproximadamente de 1,6 a 2,0, aproximadamente de 1,7 a 2,0, aproximadamente de 1,6 a 1,9 o aproximadamente de 1,7 a 1,9).
El termino "polidisperso" o "polidispersidad" se refiere al peso molecular medio ponderado de una composicion (Mw) dividido por el peso molecular medio numerico (Mn). El peso molecular medio numerico (Mn) se calcula a partir de la siguiente ecuacion Mn = Xci/(£ci/mi): La variable ci es la concentracion del polisacarido en la rodaja i y Mi es el peso molecular del polisacarido en la rodaja i. Las sumas se toman en un pico cromatografico que contiene muchas rodajas de datos. Una rodaja de datos puede ser representada graficamente como una lmea vertical en un diagrama de un pico cromatografico en funcion del tiempo. Por lo tanto, el pico de elucion se puede subdividir en muchas rodajas. El peso molecular medio numerico es un calculo dependiente del peso molecular y de la concentracion de cada rodaja de datos. Unos metodos para determinar el peso molecular medio numerico se han descrito anteriormente, y se usaron para determinar asimismo la polidispersidad.
Metodos de producir preparaciones de polisacaridos
Se consideran tambien diversos metodos de producir preparaciones de polisacaridos, p.ej., una preparacion que se describe en el presente contexto. Por ejemplo, tales metodos incluyen un metodo de producir una preparacion de polisacaridos que tiene una longitud media de cadena de aproximadamente 7 hasta 18 disacaridos. El metodo incluye proporcionar una preparacion de heparina precursora que tiene una longitud de cadena mayor que 7 a 18 disacaridos y tratar a la preparacion de heparina precursora (p.ej. mediante una despolimerizacion enzimatica o qmmica, p.ej. mediante una despolimerizacion con el acido nitroso), para obtener una preparacion de polisacaridos que tiene una longitud media de cadena de aproximadamente 7 a 18 disacaridos. Preferiblemente, la precursora tiene una longitud media de cadena de aproximadamente 7 a 14, p.ej. de 8 a 13 disacaridos. Por ejemplo la preparacion de heparina precursora puede ser una heparina no fraccionada.
La preparacion de una heparina precursora puede ser elaborada por un metodo que comprende una despolimerizacion (p.ej. una despolimerizacion enzimatica). En uno de los casos, una enzima apropiada es una que disocia a un UFH en el sitio del pentasacarido (Hnac/s,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s), opcionalmente entre otros sitios. En otro ejemplo, una enzima apropiada es una que disocia a un I2sHns o I2sHac. Por ejemplo, se puede usar la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron. Otras enzimas se pueden identificar escrutando enzimas en cuanto a las anteriores aptitudes, p.ej. tal como se determina mediante una 1D RMN, una 2D RMN, una HSQC-RMN, una espectrometna de masas, p.ej. una MS de electropulverizacion, una MALDI-MS, una LC-MS o una GPC-MS, usando el Arixtra u otro polisacarido apropiado como un testigo para la actividad de la enzima y/o la deteccion por MALDI de los productos de disociacion.
Actividades biologicas
Las preparaciones que aqm se describen tienen una actividad anti-metastasica tal como se ensaya en un modelo de metastasis en un animal, en el que unas celulas del melanoma B16F10, inyectadas en las venas del rabo de unos ratones C57/BL son detenidas en los pulmones y pueden proliferar como focos pulmonares discretos. Este ensayo se describe generalmente en la cita de Gabri y colaboradores, 2006, Clin. Cancer Res., 12:7092-98. Una preparacion puede tener adicionalmente una actividad en otros modelos experimentales de metastasis, incluyendo el ensayo de C170HM2 en el que unas celulas del linaje de cancer colorrectal humano C170HM2 se inyectan dentro de la cavidad peritoneal, cuando el sitio primario de metastasis se encuentra en el tngado. Las preparaciones que aqm se describen en el presente contexto pueden tambien mostrar una actividad anti-metastasica en unos modelos espontaneos de metastasis, tales como el modelo AP5LV, en el que unas celulas del cancer colorrectal humano AP5LV se implantan dentro de la pared peritoneal y exhiben una metastasis espontanea en el pulmon, o el modelo 4T1, en el que unas celulas de carcinoma de mama murino 4T1, que han sido implantadas en la almohadilla grasa mamaria exhiben una metastasis espontanea en el pulmon y en otros organos.
Las preparaciones que aqm se describen pueden fijar y/o modular (p.ej., inhibir) una actividad de fijacion/inhibicion de una o mas de las protemas VEGF, FGF, sDF-1 y P-selectina. En algunos casos, una interaccion de la preparacion con (p.ej., una fijacion a) una protema diana (p.ej., VEGF, FGF, SDF-1 o P-selectina se puede ensayar p.ej. in vitro, usando unos metodos conocidos en la especialidad. Se conocen numerosos/as metodos y tecnicas para detectar la fijacion o modulacion (p.ej., la inhibicion) de una actividad, p.ej., unos ensayos de competencia entre receptores patrones, una transferencia de energfa por fluorescencia (FET acronimo de fluorescence energy
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transfer), una transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET acronimo de fluorescence resonance energy transfer) (veanse por ejemplo, la patente de los EE.UU. n° 5.631.169; la patente de los EE.UU. n° 4.868.103), y una polarizacion de fluorescencia (FP acronimo de fluorescence polarization). En algunos casos, el proceso de evaluar la fijacion de una preparacion de polisacaridos a una protema diana puede incluir una vigilancia en tiempo real de la interaccion de fijacion, p.ej., usando un analisis de interaccion biomolecular (BIA con el acronimo de Biomolecular Interaction Analysis) (veanse p.ej., las citas de Sjolander y Urbaniczky (1991) Anal. Chem., 63:23382345 y de Szabo y colaboradores (1995) Curr. Opin. Struct. Biol., 5:699-705). Una resonancia de plasmones superficiales o un "BlA" detecta unas interacciones bioespedficas en tiempo real, sin tener que marcar a ninguno de los interactuantes (p.ej., el BIAcore).
Unas actividades de VEGF, FGF, y P-selectina en celulas in vitro e in vivo son bien conocidas en la especialidad. La aptitud de una preparacion de polisacaridos para modular (p.ej., inhibir) una actividad de VEGF, FGF, y P-selectina se puede ensayar in vitro o en un ensayo basado en celulas o in vivo en un organismo. Por ejemplo, se puede ensayar la aptitud de una preparacion de polisacaridos para modular (p.ej. inhibir) la actividad de una de las VEGF, FGF, y P-selectina para modular (p.ej. estimular) la proliferacion de celulas endoteliales, p.ej. las celulas epiteliales de la vena umbilical humana. Unos metodos ilustrativos de determinar la modulacion de la actividad de FGF se pueden encontrar en la patente de los EE.UU. n° 5.733.893. Un ensayo basado en celulas se puede realizar usando una unica celula o una coleccion de por lo menos dos o mas celulas. La celula puede ser una celula de levadura (p.ej., Saccharomyces cerevisiae) o una celula de mairnfero, p.ej. una lmea celular.
Composiciones farmaceuticas
Se proporcionan unas composiciones, p.ej. unas composiciones farmaceuticamente aceptables, que incluyen una preparacion que se ha descrito en el presente contexto, formulada conjuntamente con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
Como se usa en el presente contexto, el concepto de "vetnculo farmaceuticamente aceptable" incluye uno cualquiera y la totalidad de los disolventes, medios de dispersion, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, y otros similares que sean fisiologicamente compatibles con una administracion por via parenteral. El vehfculo puede ser apropiado para cualquier administracion por via parenteral, p.ej., una administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraocular, rectal, inhalada o espinal (p.ej., por inyeccion o infusion).
Las composiciones pueden presentarse en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, unas formas de dosificacion lfquidas, semi-solidas y solidas tales como unas soluciones lfquidas (p.ej. unas soluciones inyectables e infusibles es decir aptas para inyectarse o infundirse), dispersiones o suspensiones, y liposomas. La forma preferida depende del modo pretendido de administracion y aplicacion terapeutica. Unas composiciones preferidas tfpicas estan en la forma de unas soluciones inyectables o infusibles. El modo de administracion preferido es el parenteral (p.ej. intravenoso, subcutaneo, intraocular, intraperitoneal o intramuscular). En un ejemplo preferido, la preparacion se administra por infusion o inyeccion intravenosa. En otro ejemplo preferido, la preparacion se administra por inyeccion intramuscular o subcutanea.
Las frases " administracion parenteral " y "administrada parenteralmente" tal como se usan en el presente contexto, significa unos modos de administracion diferentes de una administracion por via enteral o topica, usualmente por inyeccion, e incluye, sin limitacion ninguna, una inyeccion o infusion por via intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intravftrea, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal,
transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidal, intraespinal, epidural e intraesternal.
Las composiciones terapeuticas debenan tfpicamente ser esteriles y estables en las condiciones de produccion y almacenamiento. La composicion puede ser formulada como una solucion, una microemulsion, una dispersion, un liposoma u otra estructura ordenada o encargada que sea apropiada para presentarse en una alta concentracion. Unas soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, la preparacion de polisacaridos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinacion de los ingredientes que se han enumerado mas arriba, segun se requiera, seguido por una esterilizacion filtrada. Generalmente, unas dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo dentro de un vetnculo esteril que contiene un medio de dispersion de caracter basico y los otros ingredientes requeridos, seleccionados entre los mas arriba enumerados. En el caso de unos polvos esteriles para la preparacion de unas soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son una desecacion en vacfo y una desecacion por congelacion (esto es liofilizacion) que proporcionan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion esteril y filtrada previamente del mismo. La apropiada fluidez de una solucion puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como una lecitina, por el mantenimiento del requerido tamano de partfculas en el caso de una dispersion y por el uso de unos agentes tensioactivos. Una absorcion prolongada de composiciones inyectables se puede llevar a cabo incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, seleccionado por ejemplo entre diversos polfmeros, unas sales monoestearatos y una gelatina.
Para muchas aplicaciones terapeuticas, la ruta /el modo de administracion que se prefiere es una inyeccion o infusion por via intravenosa. Tal como se apreciara por un profesional experto, la ruta y/o el modo de administracion variara(n) dependiendo de los resultados deseados.
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Unas formulaciones para inyeccion pueden ser presentadas en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo en la de ampollas, jeringas, plumas con jeringas, o en unos recipientes para dosis multiples, p.ej. con un agente conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar unas formas tales como las de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehnculos oleosos o acuosos, y pueden contener unos agentes de formulacion, tales como agentes de suspension, estabilizacion y/o dispersamiento.
Para una administracion por inhalacion, la preparacion se puede suministrar de manera conveniente como una forma de presentacion para la pulverizacion de aerosoles a partir de envases presurizados o de un nebulizador, con el uso de un agente propulsor apropiado, p.ej. diclorodifluorometano, triclrorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede ser determinada proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular, para su uso en un aparato inhalador o insuflador, unas capsulas y unos cartuchos de p.ej. gelatina, que contienen una mezcla de polvos del compuesto y una base en polvo apropiada tal como lactosa o un almidon. Por lo demas, se pueden usar unas formulaciones de polvos secos para una terapia por inhalacion. Dichas formulaciones de polvos secos se pueden preparar tal como se describe, p.ej., en el documento de solicitud de patente internacional WO 02/32406.
Ademas de las composiciones que se han descrito con anterioridad, los compuestos se pueden formular tambien como una preparacion de deposito. Tales formulaciones de larga accion se pueden formular con unos apropiados materiales polimericos o hidrofobos (por ejemplo en forma de una emulsion en un aceite aceptable) o de unas resinas para intercambio de iones, o como unos derivados escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender tambien unos apropiados vehnculos o excipientes solidos o en una fase de gel.
Las composiciones se pueden incluir dentro de un recipiente, envase o dispositivo dispensador conjuntamente con instrucciones para la administracion.
La preparacion se puede administrar con unos dispositivos para la implantacion a corto o largo plazo, por ejemplo un dispositivo de stent. La preparacion se puede implantar por via subcutanea, se puede implantar dentro de tejidos u organos (p.ej. en la arteria coronaria, en la arteria carotida, en la arteria renal o en otras arterias perifericas, en venas, en el rinon, en la cornea y el corazon, en el cuerpo vttreo, en el cerebro, etc.) o se puede implantar en unos espacios fisiologicos situados alrededor de tejidos y organos (p.ej. en la capsula renal, el pericardio o el espacio toracico o peritoneal).
La preparacion se puede usar tambien para revestir diversos dispositivos medicos. Por ejemplo, la preparacion se puede usar para revestir a un dispositivo de stent o un circuito extracorporal. Tales formulaciones de las preparaciones pueden incluir usar, p.ej., unas perlas de liberacion controlada, unos geles o unas microesferas de liberacion controlada asf como diversos polfmeros tales como un PLGA, una celulosa, un alginato u otros polisacaridos.
Unos regfmenes de dosificacion son ajustados para proporcionar la optima respuesta deseada (p.ej. una respuesta terapeutica). Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede ser reducida o aumentada proporcionalmente, tal como se indique por las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular unas composiciones parentales en una forma de dosificacion unitaria para obtener una facilidad de administracion y una uniformidad de la dosificacion. La forma de dosificacion unitaria, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a unas unidades ffsicamente discretas que sean idoneas como dosificaciones unitarias para los sujetos que hayan de ser tratados; cada unidad contiene una cantidad previamente determinada del compuesto activo, que se calcula para producir el deseado efecto terapeutico en asociacion con el vehnculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de unidades de dosificacion se dicta por, y es dependiente directamente de, (a) las caractensticas singulares del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que se haya de conseguir, y (b) las limitaciones que son inherentes en la tecnica de formular composiciones tales como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en unos individuos.
Se ha de hacer observar que los valores de la dosificacion pueden variar con el tipo y la gravedad de la condicion que haya de ser aliviada. Se ha de entender ademas que para cualquier sujeto particular, los regfmenes de dosificacion espedficos debenan ser ajustados a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administre o supervise la administracion de las composiciones
Las composiciones farmaceuticas pueden incluir una cantidad terapeuticamente efectiva de una preparacion. Una terapeuticamente efectiva de la preparacion puede variar de acuerdo con unos factores tal como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto y puede incluir mas de una dosis unitaria. Una cantidad terapeuticamente efectiva es tambien una en la que cualesquiera efectos toxicos o perjudiciales de la preparacion esten contrapesados por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una cantidad terapeuticamente efectiva puede inhibir a un parametro medible, p.ej., la actividad del VEGF, la actividad del FGF, la actividad de la P-selectina o el tamano o la tasa de crecimiento de lesiones metastasicas, p.ej., por al menos aproximadamente 20 %, mas preferiblemente por al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 40 %, incluso mas preferiblemente por al menos aproximadamente 50 %, 60 %, y todavfa mas preferiblemente por al menos aproximadamente 70 % u 80 % con relacion a unos sujetos no tratados. La aptitud de un compuesto para inhibir a un parametro medible, p.ej., a una
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metastasis o una angiogenesis, puede ser evaluada en un sistema de modelo en un animal o en un ser humano (p.ej., en una prueba clmica).
Alternativamente, una propiedad de una composicion puede ser evaluada examinando la actividad del compuesto en un ensayo in vitro. Unas dosis ilustrativas para la administracion por via intravenosa de la preparacion de polisacaridos son las aproximadamente de 0,03 mg/kg a 0,45 mg/kg, p.ej., 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,37 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, de manera preferible aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,7 mg/kg, de manera preferible aproximadamente de 0,30 a 0,50 mg/kg, p.ej., 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,42 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg o 0,50 mg/kg.
Tambien se divulgan unos estuches que comprenden una de las preparaciones de polisacaridos que aqrn se describen. El estuche puede incluir uno o mas de otros elementos que incluyen: unas instrucciones de uso; otros reactivos, p.ej., un agente terapeutico; unos dispositivos u otros materiales para preparar a la preparacion de polisacaridos para su administracion, unos vetuculos farmaceuticamente aceptables; y unos dispositivos u otros materiales para la administracion a un sujeto. Las instrucciones pueden incluir unas instrucciones para una aplicacion terapeutica, incluyendo las dosificaciones y/o los modos de administracion que se sugieran, p.ej., en un paciente que tenga un trastorno, p.ej., un trastorno que aqrn se describe. El estuche puede contener ademas por lo menos un reactivo adicional, tal como un agente de diagnostico o terapeutico, p.ej., un agente de diagnostico o terapeutico como aqrn se describe, formulado segun sea apropiado, en una o mas preparaciones farmaceuticas separadas.
Usos
Las preparaciones de polisacaridos se pueden usar para tratar a un sujeto. Tal como se usa en el presente contexto, un sujeto es un mairnfero, p.ej. un mairnfero experimental no humano, un mairnfero veterinario o un ser humano. Los mairnferos no humanos incluyen un primate, una vaca, un caballo, un cerdo, un cordero, una cabra, un perro, un gato o un roedor.
Las preparaciones se pueden usar, por ejemplo, para tratar o prevenir un trastorno metastasico (p.ej., un cancer, p.ej., un carcinoma u otro cancer solido). Tal como se usa en el presente contexto, se entiende que el termino "cancer" ha de incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o de procesos oncogenicos, tejidos metastasicos o celulas, tejidos u organos que se han transformado malignamente, de manera independiente del tipo histopatologico o del estadio de invasividad. Los metodos y las composiciones que aqrn se divulgan son particularmente utiles para tratar, o reducir el tamano, los numeros o la tasa de crecimiento de las lesiones metastasicas que esten asociadas con un cancer.
Unos ejemplos de canceres incluyen, pero no se limitan a, tumores solidos, tumores de tejidos blandos, tumores hematopoyeticos y lesiones metastasicas. Unos ejemplos de tumores solidos incluyen unas malignidades, p.ej., sarcomas, adenocarcinomas y carcinomas, de los diversos sistemas de organos, tales como los que afectan a un pulmon, a una mama, a un linfoide, a un organo gastrointestinal (p.ej., al colon), a los organos genitales y al tracto genitourinario (p.ej., celulas renales, uroteliales o de la vejiga), a la faringe, al sistema nervioso central CNS (p.ej., celulas neurales o gliales), a la piel (p.ej., un melanoma) y al pancreas, asf como a unos adenocarcinomas que incluyen malignidades tales como la mayor parte de los canceres de colon, de un cancer rectal, de un carcinoma de celulas renales, de un cancer de tngado, de un carcinoma de celulas no pequenas del pulmon, de un cancer del intestino delgado y de un cancer del esofago. Los metodos y las composiciones que aqrn se divulgan son particularmente utiles para tratar, p.ej., reducir o retrasar, unas lesiones metastasicas que estan asociadas con los canceres mas arriba mencionados. En algunos casos, el paciente habra de ser sometido a una o mas operaciones de retirada quirurgica de un tejido, una quimioterapia u otra terapia contra el cancer y el objetivo principal o unico sera el de lesiones metastasicas, p.ej., unas metastasis en la medula osea o unos nodulos linfaticos.
Los metodos que aqrn se divulgan, p.ej., los metodos de tratamiento, pueden incluir ademas la etapa de vigilar al sujeto, p.ej., acerca de un cambio (p.ej., un aumento o una disminucion) en uno o mas de los siguientes parametros: el tamano de un tumor; los niveles de un marcador de cancer, para un paciente con un cancer; el tamano o la tasa de aparicion de nuevas lesiones, p.ej., en un examen; la aparicion de nuevos smtomas relacionados con una enfermedad, el tamano de una masa de tejido blando, p.ej., una disminucion o estabilizacion; la calidad de vida, p.ej., la magnitud del dolor asociado con un enfermedad, p.ej., un dolor de huesos; o cualquier otro parametro relacionado con un resultado clmico. El sujeto puede ser vigilado en uno o mas de los siguientes penodos: antes del comienzo del tratamiento; durante el tratamiento; o despues de que se hayan administrado uno o mas elementos del tratamiento. Una vigilancia se puede usar para evaluar la necesidad de un tratamiento ulterior con la misma preparacion o para un tratamiento adicional con unos agentes adicionales. Generalmente, una disminucion en uno o mas de los parametros que mas arriba se han descrito es indicativa de la condicion mejorada del sujeto.
Las preparaciones que aqrn se describen se pueden administrar a un sujeto en dosis unicas o multiples para tratar o prevenir un trastorno metastasico o canceroso, p.ej., un trastorno canceroso que aqrn se describe.
Las preparaciones que aqrn se describen se pueden usar tambien para tratar trastornos inflamatorios, autoinmunitarios, fibroticos, fibroproliferativos, atopicos o angiogenicos. Unos ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad pulmonar obstructiva cronica, un asma, una artritis reumatoide, una
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enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo una enfermedad de Crohn y una colitis ulcerosa), una esclerosis multiple, una psoriasis, unas lesiones por isquemia y reperfusion, un choque septico, una degeneracion macular relacionada con la edad, una aterosclerosis, una enfermedad de Alzheimer, una enfermedad cardiovascular, una vasculitis, unas diabetes de los tipos I y II, un smdrome metabolico, una retinopatfa diabetica o una reestenosis. Unos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, un asma, una artritis reumatoide, una enfermedad inflamatoria intestinal, una esclerosis multiple, una psoriasis, una diabetes del tipo I, un lupus sistemico eritematoso (SLE), el smdrome de Sjogren, una tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, el smdrome de Guillain-Barre, una hepatitis autoinmunitaria, una miastenia grave. Unos ejemplos de enfermedades fibroticas incluyen, pero no se limitan a, una escleroderma, una enfermedad pulmonar obstructiva cronica, una nefropatfa diabetica, una sarcoidosis, una fibrosis pulmonar idiopatica, una cirrosis, una fibrosis qmstica, unos fibroides postoperatorios o una reestenosis. Ejemplos de una enfermedad atopica incluyen pero no se limitan a una dermatitis atopica, un asma atopico y una rinitis alergica.
Unos ejemplos de trastornos fibroproliferativos incluyen una escleroderma sistemica y local, unos queloides y unas cicatrices hipertroficas, una aterosclerosis, una reestenosis, un fibrosarcoma y una artritis reumatoide. Unos ejemplos de una cicatrizacion asociada con un trauma incluyen una cicatrizacion debida a una operacion quirurgica, o una fibrosis inducida por medios quimioterapeuticos, una fibrosis inducida por una radiacion, una cicatrizacion asociada con una lesion o unas quemaduras.
En un caso, las preparaciones de polisacaridos se usan para inhibir una angiogenesis, p.ej. para tratar unos trastornos angiogenicos. Una angiogenesis, tal como se usa en el presente contexto, es una formacion inapropiada de nuevos vasos sangumeos. Unos trastornos angiogenicos incluyen, pero no se limitan a, unos tumores, unos trastornos neovasculares de los ojos, una endometriosis, una degeneracion macular, una osteoporosis, una psoriasis, una artritis, un cancer y unos trastornos cardiovasculares.
Las preparaciones que se describen en el presente caso se pueden usar para tratar o prevenir unos trastornos infecciosos tales como p.ej., una malaria.
Se entiende que algunos trastornos caeran dentro de mas de una categona de enfermedad que aqrn se describe. Terapia en combinacion
Los metodos y las composiciones que se divulgan en el presente caso se pueden usar en combinacion con otras modalidades terapeuticas. El concepto de administrado "en combinacion", tal como se usa en el presente contexto, significa que se prestan al sujeto dos (o mas) tratamientos diferentes en el curso de la afeccion del sujeto con el trastorno tal como los efectos de los tratamientos sobre el solapamiento en el paciente en un momento en el tiempo. En algunos casos, la prestacion de un tratamiento esta realizandose todavfa cuando comienza la prestacion del segundo, de modo tal que hay un solapamiento en terminos de la administracion. A esto se hace referencia algunas veces como "prestacion simultanea " o "concurrente". En otros casos, la prestacion de un tratamiento termina antes de que comience la prestacion del otro tratamiento. En algunos ejemplos de un caso cualquiera, el tratamiento es mas efectivo debido a una administracion combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es mas efectivo, p.ej., se observa un efecto equivalente con menos cantidad del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los smtomas en una mayor extension, que lo que se observana si el segundo tratamiento fuese administrado en la ausencia del primer tratamiento, o la situacion analoga se observa con el primer tratamiento. En algunos casos, la prestacion es tal que la reduccion en un smtoma, u otro parametro relacionado con el trastorno es mayor que lo que se observana con un tratamiento suministrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, enteramente aditivo o mayor que el aditivo. La prestacion puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado sea todavfa detectable cuando se suministra el segundo.
En un ejemplo, los metodos incluyen administrar al sujeto una preparacion que aqrn se describe, en combinacion con una o mas terapias adicionales, p.ej., una intervencion quirurgica, una terapia por radiacion, o una administracion de otra preparacion terapeutica. En un ejemplo, la terapia adicional puede incluir una quimioterapia, p.ej., con un agente citotoxico. En un ejemplo, la terapia adicional puede incluir una terapia dirigida hacia un objetivo, p.ej., un agente inhibidor de la tirosina cinasa, un agente inhibidor de proteasomas, o un agente inhibidor de proteasas. En un ejemplo, la terapia adicional puede incluir un compuesto anti-inflamatorio, anti-angiogenico, anti- fibrotico o anti-proliferativo, p.ej., un esteroide, un agente inmunomodulador biologico, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un aptamero, un siRNA es decir un ARN de interferencia corto, una molecula antisentido, una protema de fusion, una citocina, un receptor de citocina, un esteroide, un agente dilatador bronquial, una estatina, un agente anti-inflamatorio (p.ej., el metotrexato), un NSAID (es decir un farmaco antiinflamatorio no esteroide). En otro ejemplo, la terapia adicional podna incluir tratamientos terapeuticos de diferentes clases. La preparacion de polisacaridos y la terapia adicional se pueden administrar de manera simultanea o secuencial.
Unos agentes citotoxicos ilustrativos, que se pueden administrar en combinacion con la preparacion de polisacaridos, incluyen agentes anti-microtubulos, agentes inhibidores de topoisomerasa, antimetabolitos, agentes inhibidores mitoticos, agentes alquilantes, agentes intercalantes, agentes capaces de interferir con una secuencia de transduccion de senales, agentes que favorecen a una apoptosis y una radiacion. En un ejemplo, el agente citotoxico, que se puede administrar junto con una preparacion aqrn descrita, es el taxol, la citocalasina B, la gramicidina D, el bromuro de etidio, la emetina, la mitomicina, el etoposido, el tenoposido, la vincristina, la vinblastina, la colquicina, la doxorrubicina, la daunorrubicina, la dihidroxi antracina diona, la mitoxantrona, la
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mitramicina, la actinomicina D, la 1-deshidrotestosterona, unos glucocorticoides, la procama, la tetracama, la lidocama, el propranolol, la puromicina y unos maitansinoides.
La terapia en combinacion puede incluir tambien una composicion que aqm se divulga, formulada concomitantemente y/o administrada concomitantemente con uno o mas agentes terapeuticos adicionales, p.ej., uno o mas agentes anti-cancerosos, agentes citotoxicos o citostaticos, un tratamiento hormonal, unas vacunas y/o otras inmunoterapias.
El invento se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que deberan de ser considerados como limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Produccion de una preparacion de polisacaridos
Este ejemplo describe la produccion de una preparacion de polisacaridos que aqm se describe
Vision de conjunto del metodo:
Una heparina no fraccionada (5 g) se disolvio en 50 ml de un tampon (50 mM de acetato de sodio y 10 mM de acetato de calcio, de pH 7,0) y se equilibro a 30 °C. Subsiguientemente, una suspension de la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron (2,25 Ul/g) se anadio a esta solucion de reaccion, y la reaccion se dejo en agitacion durante por lo menos 16 horas mientras que la temperatura se mantema entre 20 y 30 °C. El grado de despolimerizacion de esta reaccion se vigilo midiendo la absorbancia a 232 nm (UV232), y la reaccion se sofoco cuando la UV232 alcanzo un valor de la absorbancia que estaba comprendido entre 1,7 y 2,0. Subsiguientemente, se anadieron 5 g de cloruro de sodio a la solucion de reaccion, seguido por la adicion de metanol (150 ml) con una agitacion constante. El precipitado se dejo envejecer a 6 °C durante 2-24 horas. Este precipitado se filtro luego y se seco para proporcionar la deseada preparacion de polisacaridos en un rendimiento de 75-80 %. Se encontro que la preparacion de polisacaridos obtenida posefa las siguientes caractensticas:
PM: 4.300-4.900
Distribucion de PM: (i) < 3.000 Daltones: 36-45 %
(ii) 3.000-8.000 Daltones: 42-50 %
(iii) > 8.000 Daltones : 6-15 %
Actividad anti-Xa: 25-40 Ul/mg
Actividad anti-lla: 5-15 Ul/mg
Ejemplo 2: Propiedades anti-metastasicas de unas preparaciones de polisacaridos
Este ejemplo muestra que las preparaciones de polisacaridos tienen una actividad anticancerosa y anti-metastasica en multiples modelos de metastasis.
Modelo A: Modelo de una metastasis experimental de melanoma murino (B16F10 iv)
Una preparacion de polisacaridos que se ha producido tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 (a la que aqm se hace referencia como "MONC703") mostro una actividad anti-metastasis en un modelo de metastasis experimental de melanoma murino.
Unas ratonas C57BL/6 hembras (con una edad de 9-10 semanas) se trataron una vez con una unica dosis (10 mg/kg) de MONC703, de dalteparina / Fragmin® (una LMWH de la que se ha informado que tiene una actividad anti- metastasica), o de MONC 202 (testigo negativo, LMWH N-desulfatada) inmediatamente antes de una inyeccion i.v. de 2x105 celulas de B16F10. Las ratonas se sacrificaron en el dfa 21 y la carga tumoral se calculo como el peso de pulmon - peso de pulmon normal. Tal como se muestra en la Figura 1, la MONC703 inhibfa significativamente la colonizacion del pulmon con una B16F10 en relacion con un testigo (no tratado) agrupado.
Modelo B: Metastasis de cancer de colon en el h^gado
La MONC703 mostro una actividad anti-metastasis en un modelo de metastasis hepatica ortotopica
La metastasis hepatica se inicio por una inyeccion por via intraperitoneal de celulas de un tumor colorrectal humano C17OHM2 dentro de unos ratones atfmicos desnudos (es decir, desprovistos de inmunidad) (nu/nu) MF1 machos. Se uso la mezcla de 5FU y leucovorina como un testigo positivo.
Las celulas de C17OHM2 se mantuvieron in vitro en un medio de cultivo RPMl (de Sigma) que contema 10 % (v/v) de un suero de bovino fetal inactivado por calor y 2 mM de L-glutamina a 37 °C en CO2 al 5 % y en condiciones
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humedas. Las celulas procedentes de unas monocapas sub-confluyentes se cosecharon con EDTA al 0,025 %, se lavaron en un medio de cultivo y se volvieron a suspender en una solucion salina esteril tamponada con fosfato, a un pH de 7,4 (PBS) para su administracion in vivo. 1,5 * 106 celulas en un volumen de 1 ml se inyectaron por via intraperitoneal en 65 ratones, y los ratones se asignaron a unos grupos de tratamiento como se detallan seguidamente.
Grupo 1: n = 10 Grupo 2: n = 10 Grupo 3: n = 10 Grupo 4: n = 10 Grupo 5: n = 10 Grupo 6: n = 10 Grupo 7: n = 5
testigo con vehfculo
25 mg/kg de 5FU/leucovorina i.v. tratados en ciclo en los dfas 1, 3, 5, 7 5 mg/kg del compuesto 1 (dalteparina) por via s.c. una vez por dfa 5 mg/kg del compuesto 3 (M703) s.c. una vez por dfa 15 mg/kg del compuesto 3 s.c. una vez por dfa 30 mg/kg del compuesto 3 s.c. una vez por dfa no tratado.
El tratamiento se inicio en el dfa 1 a continuacion de una inyeccion de celulas y se continuo hasta el dfa 35 o hasta que la condicion clmica del animal requiriese la terminacion. Un raton en el grupo 6 se hizo terminar en el dfa 20 debido a un rabo negro, a un magullamiento y a un aspecto muy palido. Los grupos 5 y 6 pasaron sin una dosis en el dfa 5. No se observaron efectos desfavorables de los compuestos de ensayo en unos ratones que eran portadores de los tumores.
El estudio se termino en el dfa 35 y los tumores presentes en el hngado fueron extirpados y pesados. Los pesos medios de los tumores hepaticos y el area de seccion transversal se recopilan en la Tabla 2.
Tabla 2. Resumen del peso medio de tumores y analisis estadistico
Grupo
Tratamiento Peso medio de tumores Area media de tumores
(g)
(% de vehfculo) ANOVA de una via (mm2) (% de vehnculo) ANOVA de una via
1
Vehfculo 0,097 100,00 - 34,18 100,00 -
2
5FU/Leu 0,037 11,94* p = 0,006* 13,12 15,7 p = 0,011
3
5 mg/kg de Dalteparina 0,018 18,56 p = 0,017 8,09 23/67 p = 0,031
4
5 mg/kg de M703 0,134 138.14 NS 45,63 133,5 NS
5
15 mg/kg de M703 0,151 155.67 NS 40,79 119,34 NS
6
30 mg/kg de M703 0,019 19.59 p = 0,026 8,86 25,92 p = 0,049
7
Testigo no tratado 0,31 - p = 0,035 83,58 244,53 p = 0,084
* El analisis estadistico y el % del testigo para el grupo 2 se calcularon en comparacion con el grupo 7, no con el grupo 1.
NS = no significativo
30 mg/kg de M703 redujeron de una manera significativa el tamano del tumor en aproximadamente un 80 % (p = 0,017) cuando se comparo con el grupo testigo con vehfculo. La dalteparina redujo el peso del tumor hepatico en aproximadamente un 81 % (p = 0,017) cuando se comparo con el grupo testigo con vehnculo. Similarmente, el area de la seccion transversal de los tumores mostro tambien una reduccion significativa con 30 mg/kg de M703 (p = 0,049) y con dalteparina (p = 0,027).
El testigo positivo con 5FU/leucovorina (grupo 2) disminuyo de una manera significativa el peso del tumor en el hngado, en aproximadamente un 88 % (p = 0,006, o alternativamente una disminucion de 84 % en el area de la seccion transversal medida del tumor p = 0,011) cuando se comparo con el grupo testigo no tratado (grupo 7). Sin embargo, cuando se comparo con el grupo testigo con vehfculo (grupo 1), la disminucion en el tamano del tumor era de 62 % y no era significativa. Se observo que el tamano del tumor hepatico en el grupo testigo con vehfculo fue un 69 % mas pequeno que el medido en el grupo no tratado (la diferencia en el peso del tumor era significativa). Esto fue debido posiblemente a la manipulacion de los ratones sobre una base diaria desde un estadio temprano con el
fin de administrar las dosis en los grupos de tratamiento, lo que puede haber reducido la adherencia del tumor dentro del hngado.
Los pesos de los ratones se vigilaron a lo largo de toda la duracion del estudio. Los pesos de los ratones para cada grupo permanecieron dentro de un margen aceptable para todos los grupos a lo largo del estudio.
5 Este ejemplo demuestra las propiedades anti-metastasicas de la preparacion de polisacaridos que aqrn se describe.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una preparacion de polisacaridos que tiene una actividad anti- Xa y una actividad anti-IIa cada una de ellas de menos que 50 UI/mg, en que la preparacion no tiene residuos de un acido uronico escindidos en glicol y en que la preparacion se compone de unos polisacaridos de Formula I:
    -U2S-Hx,y,z-[Uw-Hx,y,z]n
    en que n es un numero entero tal que n = 1-20; w = -2OS o -2OH; x = -NS o -NAc;
    y = -3OS o -3OH; z = -6OS o -6OH; y
    en que U indica un residuo de un acido uronico y H indica un residuo de una hexosamina;
    y en que los w, x, y, y z son iguales o diferentes en cada residuo de U o H, y
    en que la preparacion es obtenible por un metodo que comprende digerir una heparina no fraccionada (UFH) con la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron.
  2. 2. La preparacion de polisacaridos de la reivindicacion 1, en que n es = 1-15.
  3. 3. La preparacion de polisacaridos de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que tiene unas cadenas de polisacaridos que contienen mas de un 40 % de residuos del disacarido U2sHns,6s
  4. 4. La preparacion de polisacaridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene un grado de desulfatacion de menos que un 40 % .
  5. 5. La preparacion de polisacaridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en que:
    (a) menos de un 2 % de las cadenas de polisacaridos de la preparacion comprende el tetrasacarido
    UHnac,6sGHns,3s,6s y/o
    (b) un 20-30 % de las cadenas de polisacaridos de la preparacion comprende el pentasacarido
    HnAc,6sGHnS,3S,6sI2sHnS,6S; y/o
    (c) un 20-30 % de las cadenas de polisacaridos de la preparacion comprende el tetrasacarido U2sHnac,6sGHns,3s,6s
  6. 6. La preparacion de polisacaridos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en que un 10-50 % de los oligosacaridos de la preparacion tiene un peso molecular < 3.000 Da; un 40-65 % de los oligosacaridos tiene un peso molecular comprendido entre 3.000-8.000 Da, y un 5-30 % de los oligosacaridos tiene un peso molecular > 8.000 Da.
  7. 7. La preparacion de polisacaridos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en que la preparacion tiene una polidispersidad de 1,6 a 2,1.
  8. 8. La preparacion de polisacaridos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en que la preparacion tiene una actividad anti-Xa de desde 10 hasta menos que 50 UI/mg.
  9. 9. La preparacion de polisacaridos de la reivindicacion 8, en que la preparacion tiene una actividad anti-Xa de desde 20 hasta menos que 50 UI/mg.
  10. 10. Una composicion farmaceutica que comprende una preparacion de polisacaridos de acuerdo con una cualquiera de las precedentes reivindicaciones.
  11. 11. Una preparacion de polisacaridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el uso en el tratamiento de una enfermedad metastasica; una enfermedad mediada por VEGF, FGF, SDF-1 y/o selectina; una enfermedad inflamatoria; una enfermedad autoinmunitaria; una fibrosis o una enfermedad que implica una angiogenesis en un sujeto.
  12. 12. La preparacion para el uso de la reivindicacion 11, en que la enfermedad metastasica es un carcinoma.
  13. 13. La preparacion para el uso de la reivindicacion 11, en que la preparacion ha de ser administrada en combinacion con un agente citotoxico.
  14. 14. Un metodo de producir una preparacion de polisacaridos tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, comprendiendo el metodo:
    (1) digerir una heparina no fraccionada (UFH) con la Heparinasa I de Bacteroides thetaiotaomicron para proporcionar una heparina despolimerizada; y
    (2) aislar la heparina despolimerizada para producir de esta manera la preparacion de polisacaridos;
    10
    en que la etapa de digerir comprende opcionalmente:
    (i) vigilar la absorbancia a 232 nm durante la etapa de digerir; y
    (ii) detener la reaccion de digestion cuando la absorbancia a 232 nm alcanza un valor comprendido entre 1,7 y 2,0; y
    la etapa de aislar incluye opcionalmente precipitar la heparina despolimerizada con una sal y con un disolvente organico polar.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, en que el metodo comprende adicionalmente preparar una composicion farmaceutica que comprende la preparacion de polisacaridos.
  16. 16. El uso de una preparacion de polisacaridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la produccion de un medicamente destinado al tratamiento de una enfermedad metastasica; una enfermedad mediada por VEGF, FGF, SDF-1 y/o selectina; una enfermedad inflamatoria; una enfermedad autoinmunitaria; una fibrosis; o una enfermedad que implica una angiogenesis en un sujeto.
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