EP2121769A1 - Heparines de bas poids moleculaire comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine, leur procede de preparation et leur utilisation - Google Patents

Heparines de bas poids moleculaire comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine, leur procede de preparation et leur utilisation

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Publication number
EP2121769A1
EP2121769A1 EP08761873A EP08761873A EP2121769A1 EP 2121769 A1 EP2121769 A1 EP 2121769A1 EP 08761873 A EP08761873 A EP 08761873A EP 08761873 A EP08761873 A EP 08761873A EP 2121769 A1 EP2121769 A1 EP 2121769A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecular weight
low molecular
biotinylated
biotin
heparins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08761873A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Hubert
Pierre Mourier
Christian Viskov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi Aventis France
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Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis France filed Critical Sanofi Aventis France
Publication of EP2121769A1 publication Critical patent/EP2121769A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
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    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to low molecular weight heparins, more generally mixtures of heparinoid-derived polysaccharides, which have at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, as well as their method of preparation, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy.
  • Heparin is a mixture of sulfated mucopolysaccharides of animal origin, with a molecular weight of around 15,000 Dalton (Da), used in particular for its anticoagulant and antithrombotic properties. Heparin, however, has drawbacks that limit the conditions of its use. In particular, its important anticoagulant activity (especially its high anti-Ha factor activity) can cause haemorrhages (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol 5, sup 3, 1999).
  • Heparins of low molecular weight for example between 3000 and 7000 Da and more particularly between 3500 and 5500 Daltons, especially obtained by basic depolymerization of heparin esters and currently marketed, such as enoxaparin, also exhibit anti-inflammatory activity. -factor lia important. Heparin derivatives are known for these undesirable hemorrhagic side effects.
  • the goal is to restore or maintain the fluidity of the blood while avoiding causing hemorrhage. It is well known that, for any accidental cause, hemorrhage may occur in a patient under treatment. It may also be necessary to intervene surgically in a patient under antithrombotic treatment.
  • anticoagulants can be used in high doses to prevent blood clotting, and it would be useful to be able to neutralize them at the end of the procedure.
  • the need is felt to have agents Neutralizable antithrombotic agents to stop anticoagulant activity at any time.
  • Neutralizable antithrombotic agents such as biotinylated synthetic polysaccharides
  • Their synthesis including in particular the grafting of biotin or the biotin derivative carried out on protected equivalents of the polysaccharides mentioned above and not on these polysaccharides themselves, is not applicable to the compounds of the present invention.
  • the latter largely comprise polysaccharide chains which possess at their reducing end a degraded glycoserine, which can not be functionalized with biotin according to the protocol described by Osmond et al.
  • the operating conditions described in this publication for the biotinylation of porcine heparin do not make it possible to obtain a complete and reproducible manner of biotinylated heparins with expected characteristics, such as a biotinylation rate sufficient to allow effective neutralization.
  • the Applicant therefore aims to provide new low molecular weight heparins neutralizable by avidin or streptavidin and which have biological properties, including anti-factor Xa and anti-factor IIa activities, comparable to heparins. low molecular weight starting.
  • biotinylated low molecular weight heparins characterized in that they have an average molecular weight of between 3000 and 7000 Da and that their Constitutive polysaccharides are covalently bound with biotin or a derivative of biotin at their reducing end.
  • biotin or a biotin derivative at the reducing end of the polysaccharide chains does not alter the pharmacological activity of low molecular weight heparins.
  • novel biotinylated low molecular weight heparins, object of the invention have anti-thrombotic activities comparable to native low molecular weight heparins, that is to say before biotinylation.
  • low molecular weight heparins refers to mixtures of sulphated polysaccharides which have the general structure of the polysaccharides constitutive of heparin, which have an average molecular weight of 3000 to 7000 Da and which are obtained by depolymerization of heparin.
  • low molecular weight heparins or
  • “native low molecular weight heparins” refers to polysaccharide mixtures prior to biotinylation, in contrast to the term “biotinylated low molecular weight heparins”, which refers to compounds according to the invention, comprising a covalent bond with biotin or one of its derivatives.
  • reducing end is understood to mean the end of the polysaccharide chain in which glucosamine or terminal mannosamine (mannosamine resulting from a basic epimerization of glucosamine) has a cyclic hemi-acetal function, corresponding to the formula ( II) below:
  • X represents H or SO 3 Na
  • Y represents COCH 3 or SO 3 Na
  • the wavy line denotes a bond situated either below or above the plane of the pyranosic ring to which it is attached (below: glucosamine, above: mannosamine).
  • low molecular weight heparins that can be used in the present invention, some of them may be such that at least 75% of their polysaccharide chains contain at their reducing end a glucosamine in hemiacetal form; these are functionalisable polysaccharides of the mixture.
  • Some polysaccharide chains present in the mixture can be in the form 1, 6-anhydro, at a content less than or equal to 25%; such polysaccharides are not functionalizable with biotin or the biotin derivative.
  • polysaccharides constitutive of heparin means polysaccharides characterized by the repetition of a disaccharide unit containing a uronic acid residue (D-glucuronic acid or L-iduronic acid) and a D-glucosamine, which can be N-sulfated or N-acetylated.
  • the disaccharide unit may also be O-sulfated at the C6 and / or C3 positions of D-glucosamine and at the C2 position of uronic acid (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p.1).
  • biotinylated low molecular weight heparins according to the invention are advantageously characterized in that their constituent polysaccharides correspond to the general formula (I):
  • i is equal to 0 or 1
  • R1 represents a sequence of formula (a) or (b):
  • j and k which may be identical or different, are integers which can take any value from 1 to 10
  • - Biot represents a biotin group or a biotin derivative
  • PE represents a polysaccharide chain having the general structure of the constituent polysaccharides of heparin
  • X represents H or SO 3 Na
  • Y represents SO 3 Na or COCH 3
  • the wavy line denotes a bond located either below or above the plane of the pyranosic ring to which it is attached, as well as their pharmaceutically acceptable salts.
  • Biot is a radical derived from hexahydro-2-oxo-1H-thieno [3,4-d] imidazole-4-pentanoic acid.
  • the Biot group in the general formula (I) according to the invention corresponds to formula (c):
  • biotin derivatives are commercially available (Tierce catalog "Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) or can be prepared using standard methods known to those skilled in the art. biotin mentioned in the patent application WO 02/24754.
  • the index i may be equal to 0, in which case the binding with the biotin or the biotin derivative is carried out directly on the amine function carried by the saccharide unit at level of the reducing end of the polysaccharide chains.
  • i may be equal to 1 and the bond with the biotin or biotin derivative group may consist, for example, of a sequence of formula (a) above in which j is equal to 5, or a sequence of formula (b ) in which j and k are identical and are equal to 5.
  • R1 may for example represent a sequence of formula -CO- (CH 2 ) 5 -NH or - CO- (CH 2 ) 5 -NH-CO- (CH 2 ) 5 -NH-.
  • the biotinylated low molecular weight heparins according to the present invention are such that at least 60%, advantageously at least 80%, even more advantageously at least 90% of their constituent polysaccharides have at their reducing end a covalent bond with biotin or a biotin derivative.
  • the low molecular weight heparins used in the present invention may be chosen for example from enoxaparin, ardeparin, bemiparin, parnaparin and tinzaparin.
  • the low molecular weight heparins used in the present invention may especially be such that:
  • said low molecular weight heparins exhibit better bioavailability and antithrombotic activity than heparin and have an average molecular weight between approximately 3500 and 5500 Da.
  • the invention encompasses biotinylated low molecular weight heparins in the form of any of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the subject of the present invention is also a process for the preparation of the biotinylated low molecular weight heparins mentioned above, characterized in that: a) a reductive amination is carried out in the presence of an amine salt and an agent reducing agent and at a temperature of between 20 and 80 ° C., on a heparin of low molecular weight as defined above, b) then acylation with a - (R 1) r Biot activated group, where R 1, i and Biot are as defined in relation to formula (I) above, in the presence of a base in an aqueous medium or in organic medium.
  • the steps of the above preparation method can be controlled by an analytical HPLC monitoring, in particular of the SAX type, for example using the method described in the patent application WO 2004/027087, or possibly by LC-MS, using by for example the method described by Robert J. Linhardt in J. Biol. Chem., 2004, 279 (4), p. 2608-2615.
  • Biotinylated low molecular weight heparins can also be analyzed and characterized by supported monomeric avidin affinity chromatography, marketed by Pierce, according to the assay conditions described by the supplier.
  • the overall yield of the process for preparing low molecular weight heparins biotinylated according to the invention is therefore at least 80%, advantageously at least 90%.
  • the amine salt may be a quaternary amine salt; it is advantageously a salt ammonium halide compound having the formula NH4Z, wherein Z represents a halogen atom, such as a chlorine, fluorine, bromine or iodine atom.
  • the reducing agent may be a borohydride salt, for example a cyanohydride salt.
  • the temperature is advantageously between 50 and 80 ° C.
  • the base may be a carbonate or hydrogencarbonate salt, especially in the form of a sodium or potassium salt, or any other water-soluble or soluble organic base. in an organic medium known to those skilled in the art.
  • step b) of acylation of the above preparation process the term "organic medium” is understood to mean, for example, dichloromethane or dimethylformamide.
  • the process for the preparation of biotinylated low molecular weight heparins advantageously comprises the following steps: a) a reductive amination is carried out on a low molecular weight heparin in the presence of an ammonium halide salt and a borohydride salt, at a temperature of between 50 and 80 ° C., then an acylation is carried out with a - (R 1) i-Biot group as defined previously in the form of an activated ester, in the presence of a base in aqueous medium.
  • Biotinylated derivatives - (R 1) r Biot as defined above can be involved in the acylation reaction directly in the form of activated esters, preformed or generated in situ using standard coupling conditions known to humans. art.
  • activated esters in the form of N-hydroxy-succinimide derivatives or of 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide derivatives.
  • the low molecular weight heparin is subjected to reductive amination to provide the derivative A, having a free amine function at the reducing end, in the presence of an amine salt and a reducing agent such as a borohydride salt.
  • This derivative can then be acylated to provide the biotinylated derivative B, by reaction with an activated derivative of biotin - (R 1) r Biot, as defined above, in the presence of a base.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • QSP "Sufficient Quantity For”
  • LC “Long Chain", corresponding to the 6-amino-hexanoyl linkage
  • LC-LC represents two LC sequences and corresponds to the sequence amido-hexanoyl-6-amino-hexanoyl
  • Sulfo-NHS sodium salt of the 3-sulfosuccinimidyl ester
  • Heparinase 1 enzyme heparin lyase I (EC 4.2.2.7) of Flavobacterium heparinum.
  • FIG. 1 illustrates the reaction by HPLC SAX of the conversion of enoxaparin according to Example 1.
  • FIGS. 2, 3 and 4 illustrate the SAX HPLC analyzes of the biotinylated and non-biotinylated fractions obtained after passing over a supported monomeric avidin column of the products obtained according to Examples 1, 2 and 3, respectively.
  • Enoxaparin is a low molecular weight heparin obtained according to the method described in US Patent RE38,743. It is converted into a biotinylated derivative according to the reaction sequence described in scheme 2: the enoxaparin is converted by a reductive amination reaction to compound 1 having an amino function on its reducing end, and then this derivative is converted into biotinylated compound 2 by reaction with 3-sulfosuccinmidyl 6-biotinamido hexanoate, sodium salt.
  • the reaction medium obtained is diluted with water (QSP 200 ml), filtered through a 0.45 ⁇ m membrane and then desalted on a Sephadex G 10 column.
  • the fraction obtained is injected onto a Q-Sepharose column.
  • the product is eluted with water and then with a gradient of sodium perchlorate.
  • the fraction harvested is desalted on a column of Sephadex G10.
  • the product obtained is again purified by passage over a Q-Sepharose column and desalting on Sephadex G10.
  • the final fraction harvested is lyophilized. 190 mg of a white lyophilisate are obtained. The yield observed is 87%.
  • FIG. 1 illustrates the reaction by HPLC SAX of the conversion of enoxaparin by a reductive amination reaction in derivative 1 having an amino function on its reducing end (see diagram 2).
  • This derivative is then converted into biotinylated derivative 2 by reaction with 3-sulfosuccinmidyl 6-biotinamido hexanoate, sodium salt.
  • the method of analysis employed is described in patent application WO 2004/027087.
  • FIG. 1 shows that the species having a functionalizable glucosamine are converted into derivatives having an amino function on their reducing end with a degree of conversion of greater than 90% to provide the enoxaparin 1-amino.
  • FIG. 1 shows that the species having a functionalizable glucosamine are converted into derivatives having an amino function on their reducing end with a degree of conversion of greater than 90% to provide the enoxaparin 1-amino.
  • FIG. 1 indicates the peaks corresponding to the main compounds present in the oligosaccharide mixtures obtained according to Example 1, the structure of which is represented below (the nomenclature used corresponds to that of the patent application WO 2004 / 027,087).
  • Example 2 illustrates the SAX HPLC analysis of biotinylated and non-biotinylated fractions obtained after passage through the supported monomeric avidin column.
  • Figure 2 shows that species with functionalizable glucosamine were converted to corresponding biotinylated species with a conversational level greater than 90%.
  • the non-affine fraction consists mainly of 1,6-anhydro derivatives which, by their nature, can not be converted into biotinylated derivatives.
  • the structures of some of the majority peaks are provided by way of example to characterize the product obtained (see structures illustrated above).
  • Enoxaparin a low molecular weight heparin obtained according to the method described in US Pat. No. RE38,743, is converted into a biotinylated derivative according to the reaction sequence described in Scheme 3: the enoxaparin is converted by a reductive amination reaction into compound 1 having an amino function on its reducing end, then this derivative is converted to biotinylated compound 3 by reaction with the ester of biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl, sodium salt
  • the product is eluted with water and then with a gradient of sodium perchlorate.
  • the fraction harvested is desalted on a Sephadex G10 column.
  • the fraction harvested is freeze-dried. 190 mg of a white lyophilisate are obtained.
  • the observed yield is about 90%.
  • the product obtained is controlled by HPLC SAX (see FIG. 3, drawing 3/4, "Global” graph) and it is confirmed that the species having an amino function on their reducing end are converted into a biotinylated derivative by reaction with the ester. of biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl, sodium salt, with a conversion of greater than 90%.
  • Example 2 The product obtained according to Example 2 is injected onto a supported monomeric avidin column. The elution is carried out according to the conditions described by the supplier Pierce. Biotinylated (avidin-affine) and non-biotinylated fractions
  • the non-affine fraction consists mainly of 1,6-anhydro derivatives which, by their nature, can not be converted into biotinylated derivatives.
  • FIG. 3 describes the structure of certain main compounds of the oligosaccharide mixture.
  • the referenced structures are shown below.
  • Enoxaparin a low molecular weight heparin obtained according to the process described in US Pat. No. RE38,743, can also be converted into a biotinylated derivative according to the reaction sequence described in scheme 4: the enoxaparin is converted by an amination reaction. reducing agent in compound 1 having a amino function on its reducing end, then this derivative is converted to biotinylated compound 4 by reaction with the ester of 6-biotinamidohexanoyl hexanoate 3-sulfosuccinimidyl, sodium salt.
  • the product is eluted with water and then with a gradient of sodium perchlorate.
  • the fraction harvested is desalted on a column of Sephadex G10.
  • the harvested fraction is lyophilized. 210 mg of a white lyophilisate are obtained.
  • the yield observed is about 92%.
  • the product obtained is monitored by HPLC SAX (see FIG. 4, drawing 4/4, "Global" graph) and it is confirmed that the species having an amino function on their reducing end are converted into a biotinylated derivative by reaction with the 6- 3-sulfosuccinimidyl biotinamidohexanoyl hexanoate, sodium salt with a conversion of more than 90%.
  • the product obtained according to Example 3 is injected onto a supported monomeric avidin column.
  • the elution is carried out according to the conditions described by the supplier Pierce.
  • the biotinylated (avidin affine) and non-biotinylated (non-avidin affinity) fractions obtained are then injected onto HPLC SAX (see FIG. 4).
  • the non-affine fraction consists mainly of 1,6-anhydro derivatives which, by their nature, can not be converted into biotinylated derivatives.
  • the structure of the main compounds is confirmed by LC-MS coupling.
  • FIG. 4 describes the structure of certain main compounds of the oligosaccharide mixture.
  • the referenced structures are shown below.
  • LC-MS analysis makes it possible to confirm the structure of the above compounds by the mass spectra corresponding to the products in acid form: ⁇ lslS
  • d1 _ 6 has nhyd ra m / z 1056; ⁇ lslS
  • d 1 , d 1 , 6-an hydro m / z 1633; ⁇ lslS
  • d 1, 6-a ⁇ hydro m / z 2210; ⁇ lslS
  • Tinzaparin a low molecular weight heparin of approximately 6000 Daltons obtained by treatment with heparinase 1
  • the compound can be controlled by HPLC SAX, using the method described previously in Example 1.
  • the product is engaged as in the biotinylation step.
  • the suspension is further diluted with 1 ml of 0.5M solution of sodium hydrogencarbonate and 47 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added again.
  • the reaction mixture is stirred for 20 hours.
  • the suspension is again diluted with 6.5 ml of 0.5 M sodium hydrogen carbonate solution and 47 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added again.
  • the reaction mixture is stirred for 22 hours and is then diluted with water (QSP 100 ml), filtered through a 0.45 ⁇ m membrane and injected onto a Q-Sepharose column.
  • the product is eluted with water and then with a gradient of sodium perchlorate.
  • the fraction harvested is desalted on a column of Sephadex G10.
  • the final fraction harvested is lyophilized. 110 mg of a white lyophilisate are obtained.
  • the observed yield is quantitative.
  • the tinzaparin 1-amino and tinzaparin NH LC Biotinoyl compounds obtained can also be characterized by the SAX HPLC methods previously used in Example 1.
  • This HPLC control shows that the species having a functionalizable glucosamine are converted into derivatives having an amino function on their reducing end with a conversion rate greater than 90% to provide tinzaparin 1-amino. It also shows that the species having an amino function on their reducing end are converted into a biotinylated derivative by reaction with 3-sulfosuccinimidyl 6-biotinamido hexanoate, sodium salt with a conversion level greater than 90% to provide tinzaparin NH LC. biotinoyl.
  • the structures of the main compounds can be confirmed by LC-MS analysis.
  • the product obtained can also be injected onto a supported monomeric avidin column.
  • the elution is carried out according to the conditions described by the supplier Pierce.
  • the biotinylated (avidin affine) and non-biotinylated (non-avidin avidin) fractions obtained can be monitored by HPLC SAX.
  • Bemiparin a low molecular weight heparin of approximately 3500 Daltons obtained by alkaline depolymerization, can also be converted into a biotinylated derivative according to the reaction sequence described in the following scheme 6: the bemiparin is converted by a reductive amination reaction to compound 7 having an amino function on its reducing end, then this derivative is converted to biotinylated compound 8 by reaction with 3-sulfosuccinimidyl 6-biotinamido hexanoate, sodium salt.
  • the compound can be controlled by HPLC SAX, using the method previously discussed in Example 1.
  • the reaction medium obtained is diluted with water (QSP 50 ml) and then desalted on a column of Sephadex G10.
  • the fraction obtained is injected onto a Q-Sepharose column.
  • the product is eluted with water and then with a gradient of sodium perchlorate.
  • the fraction harvested is desalted on a column of Sephadex G10.
  • the product obtained is again purified by passage over a column of Q-Sepharose and desalted on Sephadex G10.
  • the final fraction harvested is lyophilized. 101 mg of a white lyophilisate are obtained. The yield observed is 92%.
  • the obtained hemiparin-1-amino and b-hemiparin NH LC Biotinoyl compounds can also be characterized by the SAX HPLC methods previously used in Example 1.
  • This HPLC control shows that the species having a functionalizable glucosamine are converted into derivatives having an amino function on their reducing end with a conversion rate greater than 90% to provide the bemiparin 1-amino. It also shows that the species having an amino function on their reducing end are converted into a biotinylated derivative by reaction with 3-sulfosuccinimidyl 6-biotinamido hexanoate, sodium salt with a conversion level greater than 90% to provide the bemiparin NH LC. biotinoyl.
  • the structures of the main compounds can be confirmed by LC-MS analysis.
  • the product obtained can also be injected onto a supported monomeric avidin column. The elution is carried out according to the conditions described by the supplier Pierce.
  • the biotinylated (avidin affine) and non-biotinylated (non-avidin avidin) fractions obtained can be monitored by HPLC SAX.
  • the compounds according to the invention have been the subject of biochemical and pharmacological studies.
  • the anti-factor IIa (anti-Flla) activity and the anti-factor Xa (anti-FXa) activity in human plasma or a buffer system are analyzed by chromogenic method: the anti-factor Ha activity is tested by means of of anti-factor Ma heparin Actichrome kit (American Diagnostica) containing the chromogenic substrate S-2238, the ⁇ -thrombin and I 1 human ATIII (antithrombin III).
  • the anti-FXa activity is determined with the automated ACL 7000 coagulation instrument (Instrumentation Laboratory) using the Heparin kit (Instrumentation Laboratory) containing ATIII, factor Xa and chromogenic substrate S-2765. Both analyzes are performed according to the manufacturer's instructions.
  • 10 ⁇ l of sample or international standards of low molecular weight heparins are diluted 1: 16 with antithrombin in human plasma or Tris HCl buffer system. 0.05 M, 0.154 M NaCl, pH 7.4. 10 ⁇ l of this solution are added to a 96-well microtiter plate. The measurement is reproduced in triplicate (on 3 wells). The microtiter plate is maintained at 37 ° C. with stirring at 300 rpm. 40 ⁇ l of thrombin are added to each of the wells and incubated for exactly 2 minutes. 40 ⁇ l of Spectrozyme are added. After 90 seconds, the reaction is stopped by adding 40 ⁇ l of acetic acid. Absorption is measured at 405 nm using a SpectraMax 340 (Molecular devices).
  • the sample or international standards of low molecular weight heparins are diluted in human plasma or buffer system containing 0.05 M Tris HCl, 0.154 M NaCl, pH 7.4. Samples containing the heparinoids in the plasma or buffer are further diluted 1: 20 with working buffer containing I 1 ATIII 1 and placed in duplicate in the sampling rotor. The factor Xa reagent and the chromogenic substrate are poured into the indicated reservoirs of the automated LCD coagulation instrument
  • the measurement of the anti-FXa activity is carried out with the "heparin" protocol integrated in the ACL 7000 software.
  • 50 ⁇ l of the sample (diluted with the working buffer) are mixed with 50 ⁇ l. ⁇ l of factor Xa reagent.
  • 50 ⁇ l of chromogenic substrate with a concentration of 1.1 mM are added and the changes of absorption as a function of time are measured at the wavelength of 405 nM.
  • MM denotes the average molar mass (in Daltons) and the "corrected" activity makes it possible to correct, to the extent, the mass dilution effect.
  • the corrected activity is calculated as follows:
  • MM compound prepared theoretical average molecular weight of the compound prepared,.
  • MM starting material average molar mass of the starting low molecular weight heparin.
  • biotinylated low molecular weight heparins according to the invention retain anti-factor Xa and anti-factor Ma activities. comparable to native low molecular weight heparins. The conservation of these biological properties makes them therefore usable in therapy.
  • Antithrombin-dependent anti-FXa or anti-Flla activity is measured in the presence of increasing avidin concentration to measure the effect of avidin binding to biotin of the product on this activity.
  • the products to be studied are dissolved in 1 mg / ml in water at 0.9% NaCl.
  • the products are then diluted so as to obtain a concentration of product capable of inhibiting 50% of the factor Xa activity (Factor Xa, chromogenix Milan, Italy), or factor Ha (Factor IIa, blood laboratory, France). in the presence of antithrombin (human antithrombin Milan, Italy).
  • This inhibition is then measured in the presence of a decreasing concentration of avidin (Avidin SIGMA of the egg white, Ref A-9275, to be diluted in NaCl): 300, 30, 3, 0.3, 0.03, 0.003, 0 ⁇ g / ml.
  • factor Xa (or factor IIa) is done by adding a specific chromogenic substrate; S2222 (Chromogenix, Milan, Italy) for factor Xa, substrate S2238 (Chromogenix, Milan, Italy) for factor Ma.
  • the reading of the optical density is at 405 nm.
  • the bead solution is made to 1 mg / ml by diluting with the 20 mM Tris maleate wash buffer, 150 mM NaCl, pH 7.35.
  • the solution is well stirred and 100 .mu.l of the solution containing the beads (1 mg / ml) are placed in an Eppendorf tube. 500 ⁇ l of buffer are added.
  • the tubes are centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes. After removal of the supernatant, the pellet is taken up in 500 .mu.l of buffer. After stirring a second centrifugation is performed and the supernatant is again removed.
  • the product solutions are then placed in the presence of different solutions containing the beads so as to have the ratio product / beads expressed in ⁇ g product / ⁇ g avidin (Avidine SIGMA Ref A-9275, solution at about 3 mg / ml depending on the batch) of 1 , 0.1, 0.01 and 0.001.
  • the mixtures are then stirred and allowed to stand for 1 hour before centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant is then taken up to determine the anti-FXa activity in order to determine the concentration of product remaining in the supernatant.
  • the assay of anti-FXa or anti-Flla activity is carried out following a modified method of that described by Teien A. N and Lie M., Thrombosis Research, 1977, 10, 399-410. The results obtained are described in particular in Table 2.
  • Biotinylated low molecular weight heparins according to the present invention can be used for the preparation of medicaments. They can especially be used as anti-thrombotic drugs.
  • the subject of the invention is medicaments which comprise a biotinylated low molecular weight heparin as defined above.
  • These drugs find their use in therapy, particularly in the treatment and prevention of venous thromboses, accidents arterial thrombotic diseases, particularly in the case of myocardial infarction or unstable angina, peripheral arterial thromboses, such as lower limb arteriopathies, cerebral arterial thromboses and cerebrovascular accidents. They are also useful in the prevention and treatment of smooth muscle cell proliferation, angiogenesis, and as neuroprotective agents of atherosclerosis and arteriosclerosis.
  • the present invention also relates to a method of treatment of the aforementioned pathologies which comprises the administration to a patient of an effective dose of a compound according to the invention, or one of its pharmaceutically acceptable salts.
  • a method of treatment of the aforementioned pathologies which comprises the administration to a patient of an effective dose of a compound according to the invention, or one of its pharmaceutically acceptable salts.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, a biotinylated low molecular weight heparin according to the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as well as at least one excipient. inert, pharmaceutically acceptable.
  • excipients are chosen according to the desired pharmaceutical form and mode of administration, for example the oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, transdermal, transmucosal, local or rectal route.
  • each dosage unit the active ingredient is present in the amounts adapted to the daily doses envisaged in order to obtain the desired prophylactic or therapeutic effect.
  • Each dosage unit may contain from 20 to 150 mg of active ingredient, advantageously from 40 to 100 mg.
  • These doses of anticoagulant compounds can be neutralized by doses of avidin or streptavidin ranging from 0.2 g to 2 g by intravenous injection, bolus or infusion. There may be special cases where higher or lower dosages are appropriate; such dosages are not outside the scope of the invention.
  • the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of said patient.
  • the compounds according to the invention may also be used in combination with one or more other active ingredients useful for the desired therapy, such as antithrombotics, anticoagulants or antiplatelet agents.
  • the subject of the present invention is also a method employing avidin or streptavidin, characterized in that it makes it possible to neutralize the biotinylated low molecular weight heparins according to the invention.
  • avidin or streptavidin can be used for the preparation of drugs for neutralizing biotinylated low molecular weight heparins according to the present invention.

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Abstract

La présente invention concerne des héparines de bas poids moléculaire présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine au niveau de leur extrémité réductrice, leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapeutique, ainsi qu'un procédé mettant en œuvre l'avidine ou la streptavidine et permettant de neutraliser lesdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées.

Description

HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE AVEC LA BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR UTILISATION
5 La présente invention concerne des héparines de bas poids moléculaire, plus généralement des mélanges de polysaccharides dérivés d'héparinoïdes, qui présentent au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leur procédé de préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapeutique. 0
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da), utilisée notamment pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son5 activité anticoagulante importante (notamment son activité anti-facteur Ha élevée) peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999).
Des héparines de bas poids moléculaire, compris par exemple entre 3000 et0 7000 Da et plus particulièrement entre 3500 et 5500 Daltons, notamment obtenues par dépolymérisation basique d'esters d'héparine et actuellement commercialisées, telle que l'enoxaparine, présentent également une activité anti-facteur lia importante. 5 Les dérivés d'héparines sont connus pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables. Or, dans le domaine du traitement de la thrombose avec les produits ci-dessus, le but est de rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient sous0 traitement. On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement antithrombotique. De plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il serait utile de pouvoir les neutraliser à la fin de l'intervention. Le besoin se fait donc ressentir d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour stopper l'activité anticoagulante à tout moment.
Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754 et WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides mentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas applicable aux composés de la présente invention. On souhaite en effet effectuer la biotinylation sur des produits finis, qui sont des mélanges de polysaccharides dérivés d'héparine et sont donc des produits hétérogènes, sur lesquels le greffage de biotine tel que décrit dans les demandes de brevets sus-mentionnées ne permettrait pas d'induire une régio-sélectivité suffisante de la position de greffage et ne permettrait pas la biotinylation de l'ensemble des chaînes polysaccharidiques fonctionnalisables des héparines de bas poids moléculaire.
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207, plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles étant décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité réductrice d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la biotine. Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles ne prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure réelle des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les héparines disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole décrit par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette publication pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec l'avidine, suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation de l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la formation d'une lactone, puis du couplage avec un dérivé 2-(4-aminophényl)-éthylamine de biotine. Les conditions opératoires présentées par Tseng et al. ne présument toutefois pas de l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées au niveau de l'extrémité réductrice : en effet, rien n'indique que l'étape d'oxydation puisse être sélective au niveau de l'extrémité réductrice, ni que l'activité biologique de l'héparine soit conservée après un tel traitement.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines de bas poids moléculaires neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et qui possèdent des propriétés biologiques, notamment des activités anti-facteur Xa et anti-facteur lia, comparables aux héparines de bas poids moléculaires de départ.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines de bas poids moléculaire modifiées, ci-après appelées "héparines de bas poids moléculaire biotinylées", caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire moyen compris entre 3000 et 7000 Da et en ce que leurs polysaccharides constitutifs sont liés de façon covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine à leur extrémité réductrice.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de la biotine au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas l'activité pharmacologique des héparines de bas poids moléculaire. En effet, les nouvelles héparines de bas poids moléculaire biotinylées, objet de l'invention, ont des activités anti-thrombotiques comparables aux héparines de bas poids moléculaire natives, c'est-à-dire avant la biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines de bas poids moléculaire natives : elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine, sous forme tétramérique ou monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales à environ 66 000, 16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth édition, 1996, M. N. 920, pages 151-152 ; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook). Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des indications thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en thérapeutique dans le domaine artériel.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "héparines de bas poids moléculaire" des mélanges de polysaccharides sulfatés qui possèdent la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, qui présentent un poids moléculaire moyen de 3000 à 7000 Da et qui sont obtenus par dépolymérisation d'héparine. Dans ce qui suit, le terme "héparines de bas poids moléculaire" ou
"héparines de bas poids moléculaire natives" désigne les mélanges polysaccharidiques avant biotinylation, par contraste avec le terme "héparines de bas poids moléculaire biotinylées", qui désigne les composés selon l'invention, comprenant une liaison covalente avec la biotine ou l'un de ses dérivés.
On entend par "extrémité réductrice" l'extrémité de la chaîne polysaccharidique dans lequelle la glucosamine ou la mannosamine terminale (la mannosamine résultant d'une épimérisation en milieu basique de la glucosamine) possède une fonction hémi-acétale cyclique, répondant à la formule (II) ci-dessous:
(N) dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na, et
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine, au-dessus : mannosamine).
Parmi les héparines de bas poids moléculaire utilisables dans la présente invention, certaines d'entre elles peuvent être telles qu'au moins 75% de leurs chaînes polysaccharidiques comportent à leur extrémité réductrice une glucosamine sous forme hémi-acétale ; il s'agit des polysaccharides fonctionnalisables du mélange. Certaines chaînes polysaccharidiques présentes dans le mélange peuvent se trouver sous forme 1 ,6-anhydro, à une teneur inférieure ou égale à 25% ; de tels polysaccharides ne sont pas fonctionnalisables par la biotine ou le dérivé de biotine.
On entend par "polysaccharides fonctionnalisables" constitutifs du mélange les polysaccharides comportant à leur extrémité réductrice une glucosamine sous forme hémi-acétale telle que définie dans la formule (II).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu d'acide uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine, qui peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également être O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention sont avantageusement caractérisées en ce que leurs polysaccharides constitutifs répondent à la formule générale (I) :
dans laquelle :
- i est égal à 0 ou 1
- R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, - PE représente une chaîne polysaccharidique ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine,
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente SO3Na ou COCH3, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide hexahydro-2-oxo-1H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule (c) :
Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue Tierce" Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) ou peuvent être préparés en utilisant des méthodes classiques connues de l'Homme de l'art. On peut citer notamment les dérivés de biotine mentionnés dans la demande de brevet WO 02/24754.
Dans les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention, l'indice i peut être égal à 0, auquel cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de biotine s'effectue directement sur la fonction aminé portée par l'unité saccharidique au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques. Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou dérivé de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a) ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b) ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans la formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-. Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention sont telles qu'au moins 60%, avantageusement au moins 80%, de façon encore plus avantageuse au moins 90% de leurs polysaccharides constitutifs possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de biotine.
Les héparines de bas poids moléculaire utilisées dans la présente invention peuvent être choisies par exemple parmi l'enoxaparine, l'ardeparine, la bémiparine, la parnaparine et la tinzaparine.
Comme défini dans les brevets US 5,389,618 et US RE38.743, les héparines de bas poids moléculaire utilisées dans la présente invention peuvent notamment être telles que :
. de 9% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen inférieur à 2000 Da,
. de 5% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen supérieur à 8000 Da,
. de 60 à 86% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen compris entre 2000 et 8000 Da, . le ratio entre la masse moléculaire en masse et la masse moléculaire en nombre est compris entre 1 ,3 et 1 ,6 et
. lesdites héparines de bas poids moléculaire montrent une biodisponibilité et une activité anti-thrombotique meilleure que celle de l'héparine et possèdent un poids moléculaire moyen entre approximativement 3500 et 5500 Da.
L'invention englobe les héparines de bas poids moléculaire biotinylées sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que : a) on effectue une amination réductrice, en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur et à une température comprise entre 20 et 800C, sur une héparine de bas poids moléculaire telle que définie précédemment, b) puis on effectue une acylation avec un groupe -(R1)rBiot activé, où R1 , i et Biot sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, en utilisant par exemple la méthode décrite dans la demande de brevet WO 2004/027087, ou éventuellement par LC-MS, en utilisant par exemple la méthode décrite par Robert J. Linhardt dans J. Biol. Chem., 2004, 279 (4), p. 2608-2615.
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées peuvent être également analysées et caractérisées par chromatographie d'affinité sur avidine monomérique supportée, commercialisée par la société Pierce, selon les conditions d'analyses décrites par le fournisseur.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice a), qu'au moins 90% des polysaccharides constitutifs desdites héparines de bas poids moléculaire portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 (polysaccharides amino- réduits). On vérifie notamment, après l'étape d'acylation b), qu'au moins 90% desdits polysaccharides amino-réduits sont biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention est donc d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 90%.
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme héparines de bas poids moléculaire de départ (héparines de bas poids moléculaire "natives") des héparines de bas poids moléculaire préparées comme précédemment rapporté dans la littérature. On se référera notamment aux brevets US RE38.743 pour l'enoxaparine, US 4,757,057 pour l'ardeparine, EP 0 293 539 pour la bémiparine, US 4,791,195 pour la parnaparine et US 5,106,734 pour la tinzaparine.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le sel d'aminé peut être un sel d'aminé quaternaire; il s'agit avantageusement d'un sel d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un atome d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, l'agent réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de cyanobohydrure.
Dans l'étape a) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la température est avantageusement comprise entre 50 et 800C.
Dans l'étape b) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut être un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art.
Dans l'étape b) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, on entend par milieu organique par exemple le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le procédé de préparation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes : a) on effectue une amination réductrice sur une héparine de bas poids moléculaire en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 800C, b) puis on effectue une acylation avec un un groupe -(R1)i-Biot tel que défini précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1)rBiot tels que définis plus haut peuvent être mis en jeu dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés, préformés ou générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1. Schéma 1
Selon le schéma 1, l'héparine de bas poids moléculaire est soumise à une amination réductrice pour fournir le dérivé A, présentant une fonction aminé libre au niveau de l'extrémité réductrice, en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur tel qu'un sel de borohydrure.
Ce dérivé peut alors être acylé pour fournir le dérivé biotinylé B, par réaction avec un dérivé activé de biotine -(R1)rBiot, tel que défini précédemment, en présence d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-, ou avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)S-NH-, ou encore avec le sel de sodium de l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 n'est pas présent (i = O).
Dans le schéma 1 , il est entendu que les dérivés A et B sont une représentation théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés d'héparines de bas poids moléculaire, de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention et de différents intermédiaires utiles à leur obtention sont détaillés à titre d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées : HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ;
LC-MS : "Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy", désignant le couplage chromatographie liquide - spectroscopie de masse ;
Q.S.P. : "Quantité Suffisante Pour" ; LC : "Long Chain", correspondant à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl ; LC-LC : représente deux enchaînements LC et correspond à l'enchaînement amido-hexanoyl-6-amino-hexanoyl ; Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl ;
Héparinase 1 : enzyme héparine lyase I (EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum.
La figure 1 illustre le suivi réactionnel par HPLC SAX de la transformation de l'enoxaparine selon l'exemple 1.
Les figures 2, 3 et 4 illustrent les analyses par HPLC SAX des fractions biotinylées et non biotinylées obtenues après passage sur une colonne d'avidine monomérique supportée des produit obtenus selon les exemples 1 , 2 et 3, respectivement.
Exemple 1 : Enoxaparine NH LC Biotinoyl
L'enoxaparine est une héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38.743. Elle est convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 2 : l'enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 2 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium.
Schéma 2
Composé 2
1.1: Enoxaparine 1- amino
1 g d'enoxaparine est mis en solution dans 40 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 1 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 600C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température proche de 200C, diluée à l'eau (Q. S. P. 100 ml). Le filtrat obtenu est dessalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 824 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 82%. Le produit est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 1) et engagé tel que dans l'étape de biotinylation.
1.2: Enoxaparine NH LC Biotinoyl
A une température voisine de 200C, 200 mg d'enoxaparine 1 -amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 200C pendant 1 heure. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 18 heures. 136 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure. 70 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 3 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q. S. P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 μm, puis dessalé sur une colonne de Séphadex G 10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est dessalée sur une colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par passage sur une colonne de Q-Sépharose et dessalage sur Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 190 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 87%.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm) : entre 1 ,3 et 1 ,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (2CH2CO biotine, m), 2,80 (1H, d, 12Hz), 3,03 (1 H, dd, 12 et 5Hz), entre 3,15 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,99 (1H, d, 4Hz).
Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX : la figure 1 (dessin 1/4) illustre le suivi réactionnel par HPLC SAX de la transformation de l'enoxaparine par une réaction d'amination réductrice en dérivé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice (cf. schéma 2). Ce dérivé est ensuite converti en dérivé biotinylé 2 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinmidyl, sel de sodium. La méthode d'analyse employée est décrite dans la demande de brevet WO 2004/027087. La figure 1 montre que les espèces présentant une glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir l'enoxaparine 1 -amino. La figure 1 montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir l'enoxaparine NH LC biotinoyl. A titre d'exemple, la figure 1 indique les pics correspondant aux principaux composés présents dans les mélanges oligosaccharidiques obtenus selon l'exemple 1 , dont la structure est représentée ci-après (la nomenclature utilisée correspond à celle de la demande de brevet WO 2004/027087).
L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure de ces composés par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme acide : ΔlslS|d m/z = 1154 ; Δlslsιdlsid m/z = 1731 ; ΔlslS|dlsldlstd m/z = 2308 ; ΔlslS|di,6-anhydro rn/z = 1056 ; ΔlslS|dISidi,6-anhydro rn/z = 1633 ; ΔlslS|dIS|dIS|di,6-anhydro m/z = 2210 ; Δlslsid NH2 m/z = 1 155 ; ΔlslS|dlsid NH2 m/z = 1732 ; ΔlslS|dIS|dIS|d NH2 m/z = 2309 ; Δlsls,d NH LC Biot m/z = 1494 ; Δlslsldlsld NH LC Biot m/z = 2071 ; ΔlslS|dIS|dls,d NH LC Biot m/z = 2648.
Δlslsld Δlsls,dlsld
Δlslsldlsldls,d
Δlsls,dIS|dlsld1 βanhydro
ΔlslsldlsldNH2
ΔlslS|dlsldlsldNH LC Biot Par ailleurs, le produit obtenu selon l'exemple 1 peut être injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) ainsi obtenues sont ensuite injectées sur HPLC SAX (voir figure 2, dessin 2/4) : la figure 2 illustre l'analyse HPLC SAX des fractions biotinylées et non biotinylées obtenues après passage sur la colonne d'avidine monomérique supportée. La figure 2 montre que les espèces présentant une glucosamine fonctionnalisable ont été converties en espèces biotinylées correspondantes avec un taux de conversation supérieur à 90%. La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1,6-anhydro qui, de par leur nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés. Les structures de certains des pics majoritaires sont fournies à titre d'exemple pour caractériser le produit obtenu (cf. structures illustrées précédemment).
Exemple 2 : Enoxaparine NH Biotinoyl
L'enoxaparine, héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38.743, est convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 3 : l'enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 3 par réaction avec l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium
Schéma 3
Enoxaparine sodique Composé 1
Composé 3
A une température voisine de 200C, 200 mg d'enoxaparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de Sulfo-NHS-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 200C pendant 1 heure 30. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 107 mg de Sulfo-NHS- Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 3 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q. S. P. 150 ml), filtré sur membrane 0,45 μm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est dessalée sur une colonne de Séphadex G10 La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 190 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est d'environ 90%.
Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 3, dessin 3/4, graphe « Global ») et l'on confirme que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec l'ester de biotinoyl-3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium, avec un taux de conversion supérieur à 90%.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm) : entre 1 ,4 et 1 ,8 (6H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,3 (CH2CO biotine, m), 2,80 (1H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le produit obtenu selon l'exemple 2 est injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées
(non affines à l'avidine) obtenues sont ensuite injectées sur HPLC SAX (voir figure
3, dessin 3/4). La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1 ,6- anhydro qui, de par leur nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés.
A titre d'exemples, la figure 3 décrit la structure de certains composés principaux du mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont représentées ci-après.
L'analyse LC-Ms permet de confirmer la structure de ces composés par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide : ΔlslS|d1 6- anhydrO m/z = 1056 ; ΔlslS|dIS|d1,6-anhydro m/z = 1633 ; ΔlslS|dIS|dIS|d1,6-anhydro m/z = 2210 ; Δlslsid NH Biot m/z = 1381 ; ΔlslS|dlsld NH Biot m/z = 1958 ; Δlsls,dlsιdlsιd NH Biot m/z = 2535.
ΔlslS|dlsldIS|d1ι6anhydro
ΔlslsldNH Biot
ΔlslsldlsldNH Biot
Δlslsldls,dIS|dNH Biot
Exemple 3 : Enoxaparine NH-LC-LC Biotinoyl
L'enoxaparine, héparine de bas poids moléculaire obtenue selon le procédé décrit dans le brevet US RE38.743, peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 4 : l'enoxaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 1 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 4 par réaction avec l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium.
Schéma 4
Enoxapariπe sodique Composé 1
SulFoNHS-LC-LC-Biotin NaHCO3
Composé 4
A une température voisine de 200C, 200 mg d'enoxaparine 1 -amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 200C pendant 2 heures. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 164 mg de Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 5 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q. S. P. 150 ml), filtré sur membrane 0,45 μm, puis est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est dessalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 210 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est d'environ 92%. Le produit obtenu est contrôlé par HPLC SAX (voir figure 4, dessin 4/4, graphe « Global ») et l'on confirme que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfo-succinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90%.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm) : entre 1 ,3 et 1 ,8 (16H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (6H, m), 2,80 (1 H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le produit obtenu selon l'exemple 3 est injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues sont ensuite injectées sur HPLC SAX (voir figure 4). La fraction non affine est constituée principalement des dérivés 1 ,6- anhydro qui, de par leur nature, ne peuvent pas être convertis en dérivés biotinylés.
La structure des composés principaux est confirmée par un couplage LC-MS.
A titre d'exemple, la figure 4 décrit la structure de certains composés principaux du mélange oligosaccharidiques. Les structures référencées sont représentées ci-après.
L'analyse LC-MS permet de confirmer la structure des composés ci-dessus par les spectres de masse correspondants aux produits sous forme d'acide : ΔlslS|d1 6_ anhydra m/z = 1056 ; ΔlslS|dls,d1,6-anhydro m/z = 1633 ; ΔlslS|dIS|dIS|di,6-aπhydro m/z = 2210 ; ΔlslS|d NH LC LC Biot m/z = 1607 ; Δlsls,dls,d NH LC LC Biot m/z = 2184 ; Δlsls,dls,dlsld NH LC LC Biot m/z = 2761.
ΔlslsldlsldNH LC LC Biot
ΔlslsldlsldlsldNH LC LC Biot
Exemple 4 : Tinzaparine NH LC Biotinoyl
La tinzaparine, héparine de bas poids moléculaire d'environ 6000 Daltons obtenue par traitement avec l'héparinase 1 , peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrite dans le schéma 5 : la tinzaparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 5 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 6 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium.
Schéma 5
Composé 5
Composé 6
4.1 : Tinzaparine 1- amino
250 mg de tinzaparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 700C pendant 20 heures. La solution est ramenée à une température proche de 200C, diluée à l'eau (Q. S. P. 20 ml). Le filtrat obtenu est dessalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 215 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 86%. Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm) : 2,05
(CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée précédemment dans l'exemple 1. Le produit est engagé tel que dans l'étape de biotinylation. 4.2 : Tinzaparine NH LC Biotinoyl
A une température voisine de 20°C, 100 mg de tinzaparine 1-amino sont mis en solution dans 2,5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 2O0C pendant 1 heure 45 minutes. La suspension obtenue est diluée par 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 6 heures. 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. La suspension est encore diluée par 1 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo- NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. La suspension est de nouveau diluée par 6,5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium et 47 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau. Le mélange réactionnel est agité pendant 22 heures puis est dilué à l'eau (Q. S. P. 100 ml), filtré sur membrane 0,45 μm, est injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est dessalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 110 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est quantitatif.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (250C, δ en ppm) : entre 1 ,3 et 1 ,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1 H, dd, 12 et 7Hz),
3.03 (1H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Les composés tinzaparine 1-amino et tinzaparine NH LC Biotinoyl obtenus peuvent également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment utilisées dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant une glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir la tinzaparine 1 -amino. Il montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3- sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir la tinzaparine NH LC Biotinoyl. De la même façon que dans l'exemple 1 , les structures des composés principaux peuvent être confirmées par analyse LC-MS.
Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX.
Exemple 5 : Bémiparine NH LC Biotinoyl
La bémiparine, héparine de bas poids moléculaire d'environ 3500 Daltons obtenue par dépolymérisation alcaline, peut également être convertie en dérivé biotinylé selon la séquence réactionnelle décrit dans le schéma suivant 6 : la bémiparine est transformée par une réaction d'amination réductrice en composé 7 présentant une fonction amino sur son extrémité réductrice, puis ce dérivé est converti en composé biotinylé 8 par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfo- succinimidyl, sel de sodium.
Schéma 6
Y = SO3Na, COCH3
Composé 8
5.1 : Bémiparine 1-amino :
250 mg de bémiparine sont mis en solution dans 10 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 250 mg de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution obtenue. Le mélange est porté à 70°C pendant 20 heures. La solution est ramenée à une température proche de 200C, diluée à l'eau (Q. S. P. 20 ml). La solution obtenue est dessalée sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé.
On obtient 227 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 91%.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm) : 2,05
(CH3CO, s), 3,10 et 3,40 (1H chacun, m, CH2NH2), entre 3,20 et 5,80 (protons polysaccharides), 5,98 (1 H, d, 4Hz).
Le composé peut être contrôlé par HPLC SAX, en utilisant la méthode exposée précédemment dans l'exemple 1.
Le produit obtenu est engagé tel que dans l'étape de biotinylation. 5.2: Bémiparine NH LC Biotinoyl :
A une température voisine de 2O0C, 100 mg de bémiparine 1-amino sont mis en solution dans 5 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 2O0C pendant 2 heures. La suspension obtenue est diluée par 10 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 80 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange obtenu est agité pendant 2 heures. 40 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 50 ml) puis dessalé sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. La fraction récoltée est dessalée sur une colonne de Séphadex G10. Le produit obtenu est de nouveau purifié par passage sur une colonne de Q-Sépharose et dessalé sur Séphadex G10. La fraction finale récoltée est lyophilisée. On obtient 101 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 92%.
Spectre RMN 1H du mélange d'oligosaccharides dans D2O (250C, δ en ppm) : entre 1 ,3 et 1 ,8 (12H, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (4H, m), 2,80 (1 H, dd, 12 et 7Hz), 3,03 (1 H, m), entre 3,20 et 5,65 (protons polysaccharides), 5,98 (1H, d, 4Hz).
Les composés bémiparine 1-amino et bémiparine NH LC Biotinoyl obtenus peuvent également être caractérisés par les méthodes HPLC SAX précédemment utilisées dans l'exemple 1. Ce contrôle HPLC montre que les espèces présentant une glucosamine fonctionnalisable sont transformées en dérivé présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir la bémiparine 1 -amino. Il montre également que les espèces présentant une fonction amino sur leur extrémité réductrice sont transformées en dérivé biotinylé par réaction avec le 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl, sel de sodium avec un taux de conversion supérieur à 90% pour fournir la bémiparine NH LC biotinoyl.
De la même façon que dans l'exemple 1, les structures des composés principaux peuvent être confirmées par analyse LC-MS. Le produit obtenu peut également être injecté sur une colonne d'avidine monomérique supportée. L'élution est réalisée selon les conditions décrites par le fournisseur Pierce. Les fractions biotinylées (affines à l'avidine) et non biotinylées (non affines à l'avidine) obtenues peuvent être contrôlées par HPLC SAX.
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et pharmacologiques.
1. Mesure de l'activité anti-facteur lia et de l'activité anti-facteur Xa
L'activité anti-facteur lia (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-FXa) dans le plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode chromogènique : l'activité anti-facteur Ha est testée au moyen du kit d'anti-facteur Ma d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat chromogène S-2238, l'α-thrombine et I1ATIII humain (antithrombine III). L'activité anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-2765. Les deux analyses sont réalisées selon les instructions du fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines de bas poids moléculaire biotinylées dans le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n° 85/600),
- 2ème standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n° 01/608, utilisé depuis juin 2006) - l'enoxaparine (Clexane®, sanofi-aventis, France) a été employé comme référence interne.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 μl d'échantillon ou de standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1 :16 avec l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 μl de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits). La plaque microtitre est maintenue à 37°C en agitant à 300 t/min. 40 μl de thrombine sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 μl de Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout de 40 μl d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont encore dilués au 1 :20 avec un tampon de travail contenant I1ATIII1 et placés en double dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation ACL
7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine" intégrée dans le logiciel de l'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 μl de l'échantillon (dilué avec le tampon de travail) sont mélangés à 50 μl du réactif facteur Xa. Après un temps d'incubation de 60 secondes à 37°C, 50 μl de substrat chromogène de concentration 1 ,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en fonction du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau 1.
Tableau 1
Dans ce tableau, MM désigne la masse molaire moyenne (en Daltons) et l'activité « corrigée » permet de corriger, dans la mesure, l'effet de dilution massique. L'activité corrigée est calculée comme suit :
Activité corrigée = (Activité mesurée x MM composé préparé) / MM produit de départ, avec :
. MM composé préparé : masse molaire moyenne théorique du composé préparé, . MM produit de départ : masse molaire moyenne de l'héparine de bas poids moléculaire de départ.
Ces résultats montrent que les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention conservent des activités anti-facteur Xa et anti-facteur Ma comparables à celles des héparines de bas poids moléculaire natives. La conservation de ces propriétés biologiques les rend donc utilisables en thérapeutique.
2. Mesure de l'activité anti-FXa après neutralisation par l'avidine
Neutralisation de l'effet de produits biotinylés par l'avidine en solution
L'activité anti-FXa ou anti-Flla antithrombine dépendante des produits est mesurée en présence de concentration croissante d'avidine afin de mesurer l'effet de la liaison de l'avidine à la biotine du produit sur cette activité.
Les produits à étudier sont mis en solution à 1mg/ml dans eau à 0,9% NaCI. On dilue ensuite les produits de façon à obtenir une concentration de produit capable d'inhiber 50 % de l'activité du facteur Xa (Factor Xa, chromogenix Milan, Italie), ou du facteur Ha (Factor lia, laboratoire du sang, Strasbourg) en présence d'antithrombine (Antithrombine humaine Milan, Italie). On mesure ensuite cette inhibition en présence de concentration décroissante d'avidine (Avidine SIGMA du blanc d'ceuf, Ref A-9275, à diluer dans NaCI) :300, 30, 3, 0.3, 0.03, 0.003, 0 μg/ml. Le dosage de l'activité résiduelle du facteur Xa (ou facteur lia) se fait en ajoutant un substrat chromogène spécifique ; S2222 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le facteur Xa, le substrat S2238 (Chromogenix, Milan, Italie) pour le facteur Ma. La lecture de la densité optique se fait à 405 nm.
Mise en évidence de la liaison des produits biotinylés à l'avidine liée à des billes en tampon Afin d'évaluer la capacité des produits à lier l'avidine, les produits sont mis en présence d'avidine liée à des billes. Après centrifugation du mélange l'activité anti- FXa ou anti-Flla est déterminée dans le surnageant. Cette activité permet de déterminer la concentration restante dans le milieu et ainsi de déterminer la partie de produit piégée dans le culot après centrifugation du mélange. Les produits à étudier sont mis en solution à 1 mg/ml dans une solution NaCI 0,9%. Les produits sont dilués de façon à pouvoir inhiber 80 % de l'activité anti- FXa ou anti-Flla présent dans le test. La solution de billes est amenée à 1 mg/mL en la diluant avec le tampon de lavage tris Maléate 20 mM, NaCI 150 mM, pH 7,35. La solution est bien agitée et 100 μl de la solution contenant les billes (1 mg/ml) sont placés dans un tube Eppendorf. On ajoute 500 μl de tampon. Les tubes sont centrifugés à 12000 t/mn pendant 5mn. Après élimination du surnageant le culot est repris dans 500 μm de tampon. Après agitation une deuxième centrifugation est pratiquée et le surnageant est à nouveau éliminé. Les solutions de produit sont alors mises en présence de différentes solutions contenant les billes de façon à avoir les ratio produit/billes exprimés en μg produit/μg avidine (Avidine SIGMA Ref A-9275, solution à environ3mg/ml selon le lot) de 1, 0.1 , 0.01 et 0.001. Les mélanges sont ensuite agités et laissé au repos pendant 1 heure avant une centrifugation à 12000 t/mn pendant 5 minutes. Le surnageant est alors repris pour doser l'activité anti-FXa afin de déterminer la concentration de produit restant dans le surnageant. Le dosage de l'activité anti- FXa ou anti-Flla se fait en suivant une méthode modifiée de celle décrite par Teien A. N et Lie M., Thrombosis Research, 1977, 10, 399-410. Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau 2.
Tableau 2
II apparaît ainsi que les héparines de bas poids moléculaire ont bien été fonctionnalisées par la biotine, avec un taux de biotinylation supérieur à 80% et sont bien aptes à être neutralisées par l'avidine.
Les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments. Elles peuvent notamment être utilisées comme médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet des médicaments qui comprennent une héparine de bas poids moléculaire biotinylée telle que définie ci-avant. Ces médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en particulier dans le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales et des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de traitement des pathologies sus-mentionnées qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un composé selon l'invention, ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'utilisation des héparines de bas poids moléculaire biotinylées telles que définies précédemment pour le traitement et la prévention des pathologies sus-mentionnées fait donc partie de l'invention, ainsi que l'utilisation desdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir ces pathologies.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine de bas poids moléculaire biotinylée selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi qu'au moins un excipient inerte, pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, par exemple la voie orale, sublinguale, sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées aux doses journalières envisagées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 20 à 150 mg de principe actif, avantageusement de 40 à 100 mg. Ces doses de composés anticoagulants peuvent être neutralisées par des doses d'avidine ou de streptavidine allant de 0,2 g à 2 g en injection intraveineuse, bolus ou perfusion. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée, tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en œuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'invention. Ainsi, l'avidine ou la streptavidine peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Héparines de bas poids moléculaire, caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire moyen compris entre 3000 et 7000 Da et en ce que leurs polysaccharides constitutifs sont liés de façon covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine à leur extrémité réductrice.
2. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 1 , caractérisées en ce que leurs polysaccharides constitutifs répondent à la formule générale (I) :
dans laquelle : - i est égal à 0 ou 1 , - R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10,
- Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine,
- PE représente une chaîne polysaccharidique ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine,
- X représente H ou SO3Na, - Y représente SO3Na ou COCH3,
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 2, caractérisées en ce que i est égal à 0, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
4. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 2, caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (a) dans laquelle j est égal à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
5. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 2, caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (b) dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
6. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisées en ce que Biot représente le groupe biotine de formule (c) :
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
7. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'au moins 60% de leurs polysaccharides constitutifs possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec la biotine ou le dérivé de biotine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
8. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'au moins 80% de leurs polysaccharides constitutifs possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec la biotine ou le dérivé de biotine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
9. Héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisées en ce qu'au moins 90% de leurs polysaccharides constitutifs possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec la biotine ou le dérivé de biotine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
10. Héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisées en ce que lesdites héparines de bas poids moléculaire sont choisies parmi l'enoxaparine, l'ardeparine, la bémiparine, la parnaparine et la tinzaparine, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
11. Héparines de bas poids moléculaires biotinylées selon l'une quelconques des revendications 1 à 9, caractérisées en ce que lesdites héparines de bas poids moléculaire sont telles que : . de 9% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen inférieur à 2000 Da,
. de 5% à 20% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen supérieur à 8000 Da,
. de 60 à 86% de leurs polysaccharides constitutifs ont un poids moléculaire moyen compris entre 2000 et 8000 Da,
. le ratio entre la masse moléculaire en masse et la masse moléculaire en nombre s'étend entre 1,3 et 1,6 et
. lesdites héparines de bas poids moléculaire montrent une biodisponibilité et une activité anti-thrombotique meilleure que celle de l'héparine et possèdent un poids moléculaire moyen entre approximativement 3500 et 5500 Da, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
12. Procédé pour la préparation des héparines de bas poids moléculaires biotinylées telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on effectue une amination réductrice sur une héparine de bas poids moléculaire, en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 800C, b) puis on effectue une acylation avec un groupe -(R1)rBiot activé, où R1 , i et Biot sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 2 à 6, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on effectue une amination réductrice s sur une héparine de bas poids moléculaire, en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 800C, b) puis on effectue une acylation avec un groupe -(R1)rBiot sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
14. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une héparine de bas poids moléculaire biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées.
15. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que principe actif, une héparine de bas poids moléculaire biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines de bas poids moléculaire biotinylées, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
16. Utilisation d'une héparine de bas poids moléculaire biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 en tant que médicament antithrombotique.
17. Utilisation selon la revendication 16 pour le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales, des accidents vasculaires cérébraux, pour le traitement et la prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteur de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
18. Procédé mettant en œuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
19. Utilisation d'avidine ou de streptavidine pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines de bas poids moléculaire biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
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