JP2010518238A - ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも1つの共有結合を含む低分子量ヘパリン、これらの作製方法およびそれらの使用。 - Google Patents
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Abstract
Description
−Xは、HまたはSO3Naを表し、
−Yは、COCH3またはSO3Naを表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す(下:グルコサミン、上:マンノサミン)。]
に対応する、環状ヘミアセタール官能基を有する多糖類鎖の末端を表す。
−Biotは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−PEは、ヘパリンの構成多糖類の一般式を有する多糖類鎖を表し、
−XはHまたはSO3Naを表し、
−YはSO3NaまたはCOCH3を表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す。]
およびこれらの薬学的に許容される塩、
に対応することを有利に特徴とする。
−これらの構成多糖類の9%から20%は、2000Da未満の平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の5%から20%は、8000Daを超える平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の60%から86%は、2000から8000Daの間の平均分子量を有し、
−質量平均分子量と数平均分子量の間の比は、1.3から1.6の間であり、
−前記低分子量ヘパリンは、ヘパリンより優れた生物学的利用能および抗血栓活性を有し、約3500から5500Daの間の平均分子量を有する、
ものであり得る。
a)アミン塩および還元剤の存在下で、温度20から80℃の間で、上記に定義された低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施すること、
b)その後、活性化基−(R1)i−Biot−(式中、R1、iおよびBiotは上記の式(I)に関して定義された通りである)を用いて、水性媒体または有機媒体中に塩基が存在する状態でアシル化を実施すること、
を特徴とする、上述のビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法である。
a)ハロゲン化アンモニウム塩および水素化ホウ素塩の存在下で、温度50から80℃の間で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
b)その後、上で定義された−(R1)i−Biot基の活性化エステル型を用いて、水性媒体中に塩基が存在する状態で、アシル化を実施するステップ、
を有利に含む。
HPLC:高速液体クロマトグラフィー、
SAX:強陰イオン交換クロマトグラフィー、
LC−MS:液体クロマトグラフィー−質量分析法、
qs:十分量、
LC:長鎖、6−アミノヘキサノイルの連鎖に対応する
LC−LC:2つのLCの連鎖を表し、アミドヘキサノイル−6−アミノヘキサノイルの連鎖に対応する、
スルホ−NHS:3−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩、
ヘパリナーゼ1:フラボバクテリウム・ヘパリナム(Flavobacterium heparinum)由来のヘパリン・リアーゼI酵素(EC4.2.2.7)
エノキサパリンは、特許US RE38743に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである。これは、スキーム2の反応順序に従って、ビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を有する化合物1に変換され、この誘導体は、その後、3−スルホスクシンイミジル6−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物2に変換される。
1gのエノキサパリンを、40mlの5Mの塩化アンモニウム水溶液に溶解する。1gのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、60℃で24時間維持する。溶液を、約20℃の温度に冷却し、水で希釈する(qs 100ml)。得られたろ液を、Sephadex G10カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。824mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は82%である。生成物は、HPLC SAX(図1を参照されたい。)により検査され、さらなる精製をせずにビオチン化ステップに使用される。
200mgの1−アミノエノキサパリンを、5mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液に、約20℃の温度で溶解する。136mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約20℃の温度で1時間攪拌する。得られた懸濁液を、10mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。136mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、得られた混合物を、18時間攪拌する。さらに136mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、反応混合物を1時間攪拌する。さらに70mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、反応混合物を3時間攪拌する。得られた反応媒体を、水(qs 200ml)で希釈し、0.45μmのメンブランでろ過し、その後Sephadex G10カラムで脱塩する。得られた分画を、Q−Sepharoseカラムに注入する。生成物を水およびその後過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Sephadex G10カラムで脱塩する。得られた生成物をQ−Sepharoseカラムを通すことによって、再度精製し、Sephadex G10で脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。190mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は87%である。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:1.3−1.8(12H,m)、2.05(CH3CO,s)、2.25(2CH2COビオチン,m)、2.80(1H,d,12Hz)、3.03(1H,dd,12および5Hz)、3.15−5.65(多糖類プロトン)、5.99(1H,d,4Hz)。
米国再発行特許第38743号明細書に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである、エノキサパリンは、スキーム3に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、その還元末端にアミノ官能基を含む化合物1に変換され、その後、この誘導体は、ビオチノイル−3−スルホスクシンイミジルエステルのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物3に変換される。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:1.4−1.8(6H,m)、2.05(CH3CO,s)、2.3(CH2COビオチン,m)、2.80(1H,dd,12および7Hz)、3.03(1H,m)、3.20−5.65(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
米国再発行特許第38743号明細書に記載された方法に従って得られた低分子量ヘパリンである、エノキサパリンは、スキーム4に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換される。つまり、エノキサパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物1に変換され、その後、この誘導体は、エステルの3−スルホスクシンイミジル6−ビオチンアミドヘキサノイルヘキサノエートのナトリウム塩との反応により、ビオチン化化合物4に変換される。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:1.3−1.8(16H,m)、2.05(CH3CO,s)、2.25(6H,m)、2.80(1H,dd,12および7Hz)、3.03(1H,m)、3.20−5.65(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
Δlslsld NH LC LC Biot m/z=1607;Δlslsldlsld NH LC LC Biot m/z=2184;Δlslsldlsldlsld NH LC LC Biot m/z=2761。
ヘパリナーゼ1を用いた処理により得られる、約6000ダルトンの低分子量ヘパリンである、チンザパリンもまた、スキーム5に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換され得る。つまり、チンザパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物5に変換され、その後、この誘導体は、3−スルホスクシンイミジル6−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物6に変換される。
250mgのチンザパリンを、10mlの5Mの塩化アンモニウム水溶液に溶解する。250mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、70℃で20時間維持する。溶液を約20℃の温度に冷却し、水で希釈する(qs 20ml)。得られたろ液を、Sephadex G10カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。215mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は86%である。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:2.05(CH3CO,s)、3.10および3.40(各1H,m,CH2NH2)、3.20−5.65(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
100mgの1−アミノチンザパリンを、2.5mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液に、約20℃の温度で溶解する。47mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約20℃の温度で1時間45分攪拌する。得られた懸濁液を、5mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。47mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、得られた混合物を、6時間攪拌する。さらに47mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、反応混合物を20時間攪拌する。懸濁液を、1mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液で再度希釈し、さらに47mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加える。反応混合物を20時間攪拌する。懸濁液を6.5mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液で再度希釈し、さらに47mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加える。反応混合物を22時間攪拌し、その後、水(qs 100ml)で希釈し、0.45μmのメンブランでろ過し、Q−Sepharoseカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Sephadex G10カラムで脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。110mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は定量的である。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:1.3−1.8(12H,m)、2.05(CH3CO,s)、2.25(4H,m)、2.80(1H,dd,12および7Hz)、3.03(1H,m)、3.20−5.65(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
アルカリ解重合を介して得られる、約3500ダルトンの低分子量ヘパリンである、ベミパリンもまた、以下のスキーム6に記載された反応順序に従ってビオチン化誘導体に変換され得る。つまり、ベミパリンは、還元的アミノ化反応を介して、還元末端にアミノ官能基を含む化合物7に変換され、その後、この誘導体は、3−スルホスクシンイミジル6−ビオチンアミドヘキサノエートのナトリウム塩との反応を介して、ビオチン化化合物8に変換される。
250mgのベミパリンを、10mlの5M塩化アンモニウム水溶液に溶解する。250mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、得られた溶液に加える。混合物を、70℃で20時間維持する。溶液を約20℃の温度に冷却し、水で希釈する(qs 20ml)。得られた溶液を、Sephadex G10カラムで脱塩し、その後凍結乾燥する。227mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は91%である。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:2.05(CH3CO,s)、3.10および3.40(各1H,m,CH2NH2)、3.20−5.80(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
100mgの1−アミノベミパリンを、5mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液に、約20℃の温度で溶解する。80mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを、得られた溶液に加える。溶液を、約20℃の温度で2時間攪拌する。得られた懸濁液を、10mlの0.5M炭酸水素ナトリウム溶液で希釈する。80mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、得られた混合物を、2時間攪拌する。さらに40mgのスルホ−NHS−LC−ビオチンを加え、反応混合物を20時間攪拌する。得られた反応媒体を水(qs 50ml)で希釈し、その後、Sephadex G10カラムで脱塩する。得られた分画を、Q−Sepharoseカラムに注入する。生成物を水および次いで過塩素酸ナトリウムで勾配をかけて溶出する。回収された分画を、Sephadex G10カラムで脱塩する。得られた生成物を、Q−Sepharoseカラムを通して再度精製し、Sephadex G10カラムで脱塩する。回収された最終分画を凍結乾燥する。101mgの白い凍結乾燥物が得られる。実際の収率は92%である。
D2O(25℃,δ(ppm))中でのオリゴ糖混合物の1H NMRスペクトル:1.3−1.8(12H,m)、2.05(CH3CO,s)、2.25(4H,m)、2.80(1H,dd,12および7Hz)、3.03(1H,m)、3.20−5.65(多糖類プロトン)、5.98(1H,d,4Hz)。
ヒト血漿またはバッファー系における、抗第IIa因子(抗FIIa)活性および抗第Xa因子(抗FXa)活性を、発色法を介して分析する。つまり、抗第IIa因子活性を、発色基質S−2238、α−トロンビンおよびヒトATIII(抗トロンビンIII)を含む、Actichrome heparin anti−factor IIa kit (American diagnostica)を用いて検査する。抗FXa活性は、自動凝固装置ACL7000(Instrumentation Laboratory)を用いて、ATIII、第Xa因子および発色基質S−2765を含む、Heparin kit(Instrumentation Laboratory)を使用して測定する。2種の分析は、製造業者の指示書に従って、実施する。
−低分子量ヘパリンのための第1標準品(National Institute for Biological Standards and Control、London、UK、1987年承認、コード番号85/600)
−低分子量ヘパリンのための第2標準品 (National Institute for Biological Standards and Control、London、UK、1987年承認、コード番号01/608、2006年6月から使用)
−エノキサパリン(Clexane(登録商標)、sanofi−aventis、France)を、内部標準として使用。
補正活性=(測定活性×調製された化合物のMM)/出発物質のMM、
式中、
調製された化合物のMM:調製された化合物の理論的平均モル質量、
出発物質のMM:出発低分子量ヘパリンの平均モル質量。
溶液中における、ビオチン化生成物の効果のアビジンによる中和
生成物依存性の抗FXaまたはFIIaの抗トロンビン活性を、この活性に、生成物のビオチンにアビジンが結合することが及ぼす影響を測定するために、漸増濃度のアビジンの存在下で測定する。
生成物のアビジン結合能を評価するために、生成物を、ビーズに結合されたアビジンと接触して配置する。混合物を遠心分離にかけた後で、抗FXa活性または抗FIIa活性を、上清中で測定する。この活性は、媒体に残存する濃度を決定でき、したがって、混合物を遠心分離にかけた後のペレットに捕捉された生成物の割合を決定できる。
Claims (19)
- 3000から7000Daの間の平均分子量を有し、構成多糖類がこれらの還元末端においてビオチンまたはビオチン誘導体と共有結合していることを特徴とする、低分子量ヘパリン。
- 構成多糖類が、一般式(I):
−iは0または1に等しく、
−R1は、式(a)または(b):
−Biotは、ビオチン基またはビオチン誘導体を表し、
−PEは、ヘパリンの構成多糖類の一般構造を有する多糖類鎖を表し、
−XはHまたはSO3Naを表し、
−YはSO3NaまたはCOCH3を表し、
−波線は、これが結合しているピラノース環平面の下または上のいずれかに位置する結合を表す。]、
に対応することを特徴とする、請求項1に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - iが0に等しいことを特徴とする、請求項2に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - iが1に等しく、ならびにR1が、式(a)(式中、jは5に等しい。)の連鎖を表すことを特徴とする、請求項2に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - iが1に等しく、R1が、式(b)(式中、jおよびkは同一であり、5に等しい。)の連鎖を表すことを特徴とする、請求項2に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 構成多糖類の少なくとも60%が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 構成多糖類の少なくとも80%が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項7に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 構成多糖類の少なくとも90%が、これらの還元末端にビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を有することを特徴とする、請求項7または請求項8に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 前記低分子量ヘパリンが、エノキサパリン、アルデパリン、ベミパリン、パルナパリンおよびチンザパリンから選択されることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
ならびにさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 前記低分子量ヘパリンが、
−これらの構成多糖類の9%から20%は、2000Da未満の平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の5%から20%は、8000Daを超える平均分子量を有し、
−これらの構成多糖類の60%から86%は、2000から8000Daの間の平均分子量を有し、
−質量平均分子量と数平均分子量の間の比は、1.3から1.6の間であり、
−前記低分子量ヘパリンは、ヘパリンより優れた生物学的利用能および抗血栓活性を有し、約3500から5500Daの間の平均分子量を有する、
ものであることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリン
およびさらにこれらの薬学的に許容される塩。 - 請求項1から11のいずれか一項に定義されたビオチン化低分子量ヘパリンの調製方法であって、以下のステップ:
a)アミン塩および還元剤の存在下で、温度20から80℃の間で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
b)その後、活性化基−(R1)i−Biot−(式中、R1、iおよびBiotは請求項2から6のいずれか一項に定義された通りである)を用いて、水性媒体または有機媒体中に塩基が存在する状態でアシル化を実施するステップ、
を含むことを特徴とする、方法。 - 以下のステップ:
a)ハロゲン化アンモニウム塩および水素化ホウ素塩の存在下で、50から80℃の間の温度で、低分子量ヘパリンに還元的アミノ化を実施するステップ、
b)その後、−(R1)i−Biot基の活性化エステル型を用いて、水性媒体中に塩基が存在する状態で、アシル化を実施するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。 - 請求項1から11のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンまたは前記ビオチン化低分子量ヘパリンの薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする薬剤。
- 有効成分として、請求項1から11のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンまたは前記ビオチン化低分子量ヘパリンの薬学的に許容される塩およびさらに少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの、抗血栓剤としての使用。
- 静脈血栓症、動脈血栓障害(特に心筋梗塞または不安定狭心症の場合)、下肢の動脈疾患などの末梢動脈血栓症、大脳動脈血栓症または脳卒中の治療および予防のため、平滑筋細胞増殖、血管新生の予防および治療のため、ならびにアテローム性動脈硬化および動脈硬化症のための神経保護剤としての、請求項16に記載の使用。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの中和を可能にすることを特徴とする、アビジンまたはストレプトアビジンを使用する方法。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のビオチン化低分子量ヘパリンの中和用薬剤の調製のための、アビジンまたはストレプトアビジンの使用。
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