CN109923208B - 生物合成肝素 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及可与猪USP肝素钠生物等效的肝素的合成。所述合成可涉及从肝素前体开始的三种中间体。

Description

生物合成肝素
相关申请
本申请要求2016年09月07日提交的美国临时申请号62/384,341的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及多糖化学的领域，尤其涉及可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素；制备该生物合成肝素的方法；可用于该制备方法的中间体；以及使用所述生物合成肝素的方法。
发明内容
一个实施方案是包含一定量的N-硫酸化(NS)二糖基团的糖胺聚糖，该量可有效产生生物合成肝素。NS基二糖基团的量可以是78-99％或81-97％或83-95％或85-93％。
另一个实施方案是包含一定量的N-硫酸化、2-硫酸化(NS2S)二糖基团的糖胺聚糖，该量可有效产生生物合成肝素。NS2S二糖基团的量可以是44-80％或50-78％或55-77％或60-76％。
另一个实施方案是包含一定量的N-硫酸化、2-硫酸化、6-硫酸化(NS2S6S)二糖基团和N-硫酸化、6-硫酸化(NS6S)二糖基团的糖胺聚糖，其中所述量有效产生生物合成肝素。NS6S基团和NS2S6S二糖基团的各自量可以是6-40％NS6S基团和31-73％NS2S6S基团；6-32％NS6S基团和36-70％NS2S6S基团；6-26％NS6S基团和40-67％NS2S6S基团；或6-22％NS6S基团和43-64％NS2S6S基团。
另一个实施方案是一种用于生产生物合成肝素的方法，包括：a.获得含有31-73％的NS2S6S二糖基团、6-40％的NS6S二糖基团、0-27％的NS2S基团和1-22％的NS基团的糖胺聚糖；以及b.在硫酸盐供体的存在下用酶(3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1))处理所述糖胺聚糖以产生生物合成肝素批次(batch)。
另一个实施方案是一种制备第二糖胺聚糖中间体的方法，所述第二糖胺聚糖中间体包含44-80％的NS2S基团和13-39％的NS基团。所述方法可以包括a.将肝素前体(heparosan)中一定量的N-乙酰葡糖胺残基进行转化以产生包含78-99％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一糖胺聚糖，其中转化的N-乙酰葡糖胺残基的量对应于第一糖胺聚糖中间体中NS基团的量；以及b.在硫酸盐供体的存在下，用两种酶(C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一糖胺聚糖中间体以产生第二糖胺聚糖中间体。
以及另一个实施方案是一种制备第三糖胺聚糖中间体的方法，所述第三糖胺聚糖中间体包含31-73％的NS2S6S二糖基团、6-40％的NS6S二糖基团、0-27％的NS2S基团和1-22％的NS基团。所述方法可包括：在硫酸盐供体的存在下，用酶(6-O-磺基转移酶同种型1和/或3(6OST-1/3))处理包含44-80％的NS2S基团和13-39％的NS基团的第二糖胺聚糖中间体，以将第二糖胺聚糖中间体转化为第三糖胺聚糖中间体。
附图说明
图1示意性地显示了从肝素前体到可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素(BSH)的途径。
图2示意性地说明了中间体和可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素的分析的方法。
图3显示了肝素前体、NS、NS2S、NS6S、NS2S6S中间体、可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素、以及猪USP肝素的1D 1H-NMR谱。
图4显示了可提供与猪USP肝素等效的性质的生物合成肝素中间体结构的示例性组成范围。
详细说明
肝素在溶液和植入装置中广泛用作抗凝血剂。肝素的化学合成通常被认为是不可行的，因此在整个肝素生产史中药物级肝素来源于各种动物组织。但是对动物源的依赖会给质量控制和供应带来问题。
肝素的主要来源是猪肠，但也有牛肺和肠肝素和羊肠肝素。产品质量可能因环境因素和动物亚种而异，为药物监管提供了额外的困难。对导致人类Creutzfeldt-Jakob疾病的朊病毒疾病(例如牛海绵状脑病(BSE，“疯牛病”))、以及羊中瘙痒病朊病毒的深切关注导致牛和羊组织作为肝素的来源的使用减少。
2008年，过硫酸化硫酸软骨素(OSCS)被引入由中国的猪产生的肝素中，导致近100名美国人的死亡以及肝素供应明显减少。这种故意掺假很难被发现，因为屠宰场中肝素的组织供应链缺乏现行药品生产管理规范(cGMP)监督。
最近，从不同动物中获得的肝素的混合被怀疑。牛肺肝素、牛肠肝素、羊肠肝素和猪肠肝素可以通过它们的抗凝血酶五糖结合位点的结构变体的不同分布以及它们的二糖组成的差异而彼此区分。但是，即使使用现有技术的分析方法，也难以在猪肠肝素产品中检测到少量的牛肠肝素或羊肠肝素的存在。
供应也是一个严重的问题。尽管全世界每年屠宰12亿头或更多的猪，生产100吨/年的肝素，但商业供应商可能无法跟上全球需求增长的步伐，特别是在发展中国家。最近的市场份额分析显示大部分粗肝素来自中国，占全球市场的57％左右。动物种群对传染病(例如中国的猪流行病)的敏感性、过度捕杀或环境问题会显著减少可以制备肝素的动物的供应。肝素的现货短缺导致人们认真考虑在美国市场重新引入牛肝素。但是，牛肠肝素不符合USP肝素规范，并且这限制了其商业用途。接受牛肠肝素也增加了混合猪和牛肝素的风险，这很难检测并改变最终产品的性质。
鉴于需要替代和可靠的生物等效肝素来源，研究人员试图从肝素前体合成肝素。化学和酶促步骤的组合产生接近肝素的产物，但是就本发明人所知，化学酶法合成的生物合成肝素尚未达到USP标准。在多个试验实施例的认真研究之后，本发明人已合成了符合USP的所有要求的肝素。本发明人已经阐明了具有获得这种生物等效肝素所必需的特定特征的三种中间体。
定义
出于本申请的目的，以下术语具有以下定义：
如本文所使用的，“一”或“一个”表示一个或多个，除非明确指出仅表示一个。
“约”明确地包括本领域技术人员理解的与所述值等效的典型变化。在使用数值时，“约”包括所述值的±20％或±15％或±10％或±8％或±7％或±6％或±5％或±3％或±2％或±1％。
除非另有说明，否则在提供关于二糖含量的％之处，其通常是指mol/mol百分比。
如本文所使用的，BSH是指生物合成肝素，即通过一种或多种化学过程；酶促过程；化学和酶联合过程；微生物和哺乳动物细胞培养过程制备的肝素。在一些实施方案中，生物合成肝素可包括与猪USP肝素生物等效的肝素，即猪肝素钠，例如“生物等效肝素”。
如本文所使用的，“生物等效肝素”(BEqH)在生物活性水平和分子量分布方面与猪USP肝素钠等效。在一些实施方案中，生物等效肝素可含有与猪USP肝素等效的量的二糖基团NS、NS2S、NS6S和NS6S2S，如下表2中所示。
如本文所使用的，术语“批次”可指特定量的药物或其他材料，例如肝素，其旨在具有在指定的范围内的统一的特征和质量，并且在同一制造周期期间根据单个制造订单生产。
肝素和肝素前体
肝素前体是一组具有重复的二糖单元[→4)β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)(1→4)N-乙酰基-α-D-葡萄糖胺(GlcNAc)(1→]n的异构长度的直链多糖。
肝素是一组具有抗凝血特性的异构的直链阴离子糖胺聚糖。肝素可以被消化成独特的二糖基团(Yang,B.,Chang,Y.,Weyers,A.M.,Sterner,E.,&Linhardt,R.J.(2012)。并且通过液相色谱-紫外光谱(LC-UV)方法进行分析。(P.Mourier et al.AnalyticalChemistry Research 3(2015)46-53)。从LC-UV方法获得的数据与从常规使用的液相色谱-质谱(LC-MS)方法获得的数据高度可比。在用三种肝素裂解酶的混合物消化后，肝素提供以下二糖：
Figure BDA0002043374040000041
其中ΔUA对应于4-脱氧-α-L-苏-己-4-吡喃糖基糖醛酸。GlcN对应于D-葡糖胺，Ac对应于乙酰基以及S对应于磺基。在本说明书中，二糖的含量可以基于上述八种二糖的总含量来计算。
因为肝素和肝素前体和相关衍生物是复杂的分子，它们也可以根据它们的重量平均分子量(Mw)和分子量分布来表征。肝素还可以通过其抗凝血活性来表征。
美国药典第39版(USP39)标准“肝素钠，USP”要求肝素具有特定水平的活性和分子量分布。根据USP，肝素的平均重量为15,000-19,000Da；分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不超过总量的20％；以及分子量为8,000至16,000Da之间的链与分子量为16,000至24,000Da之间的链的比例不小于1.0。
在本发明中，分子量为8,000至16,000Da之间的链与分子量为16,000至24,000Da之间的链的比例不小于1.0，优选地在1.0和2.5、1.0至2.0、1.2至1.8、1.4至1.7、1.5或1.6之间。效力通过使用基于每毫克肝素活性单位的USP参考标准的生物测定来确定。这些规范要求肝素对因子IIa(即抗IIa)的抗凝活性不低于180U/mg，并且对因子Xa与因子IIa的活性比(即抗Xa/抗IIa)在0.9和1.1之间。
目前用于猪肝素钠的USP专著(USP 39)没有与二糖组成有关的要求。但是，有理由认为肝素的性质是由结构决定的。因此，本发明人阐明了猪USP肝素的某些结构特征。表1显示了用三种肝素裂解酶处理后衍生自猪USP肝素的二糖基团的统计范围。共测量了15批次猪USP肝素。计算了样品的算术平均值(平均值)和标准偏差(SD)。基于本发明人的累积的数据获得分析误差的标准偏差。应用表1最左列中的以下等式来计算每种二糖的范围。
表1.猪USP-肝素批次的组成分析和可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素的目标范围的确定。
Figure BDA0002043374040000051
Figure BDA0002043374040000061
假设15个肝素样本具有代表性，3个标准偏差包含99.7％的预期变异。
在一些实施方案中，与猪USP肝素钠生物等效的生物合成肝素中每种二糖的含量在来自USP肝素的估计平均值的3个标准偏差内，如上表1中所示并且在表2中提供。
表2.猪USP-肝素在3个标准偏差变化性内的组成。
mol％ 0S NS 6S 2S NS6S NS2S 2S6S TriS
USP肝素 0-7.8 1.1-5.1 2.0-4.5 0.9-2.4 7.1-14.2 4.6-9.9 0.4-2.2 59.8-78.0
在一些实施方案中，生物合成肝素中每种二糖的含量在来自USP肝素的估计平均值的2.5、2.0、1.5或1.0个标准偏差内。在一些实施方案中，每种主要二糖NS、NS6S、NS2S和TriS的含量在来自USP肝素的相应估计平均值的3.0、2.5、2.0、1.5或1.0个标准偏差内。
Mulloy et al.“USP compendial methods for analysis of heparin:chromatographic determination of molecular weight distributions for heparinsodium”Anal Bioanal Chem(2014)406:4815–4823综述了猪USP肝素钠的大小分布。根据图3，8-16kDa种类最多为55％，16-24kDa种类不低于25％。因此，在本研究中18-16/16-24比率为2.2(即55/25)。
由肝素前体合成肝素
肝素前体是具有重复的二糖单元[→4)β-D-葡糖醛酸(GlcA)(1→4)N-乙酰基-α-D-葡糖胺(GlcNAc)(1→]n的多糖。肝素前体被生物合成为细菌(包括大肠杆菌Escherichiacoli和多杀巴斯德氏菌Pasteurella multicida)中的多糖胶囊。Lindahl U et al.(1998)“Regulated diversity of heparan sulfate”J Biol Chem 273(39):24979-24982。实验室规模的研究表明，从大肠杆菌K5菌株获得的重量平均分子量(Mw)>10,000的肝素前体可以通过化学酶促转化为称为新肝素(neoheparin)的与猪USP肝素钠不具有生物等效性的抗凝血多糖。Lindahl et al.(2005)J Med Chem 48(2):349-352；Zhang et al.(2008)Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007；美国专利号6,162,797；US 2014/0349962。
以下参考文献描述了与猪USP肝素钠不是生物等效的生物合成肝素。没有一个描述了具有本文所描述的性质的中间体的产生，产生的肝素也不是与猪USP肝素生物等效的。据报道，此类肝素的二糖含量不在来自猪USP肝素的估计平均值的1、2或3个标准偏差内，任何中间体也不与生物等效肝素所需的中间体一致。
本发明与现有技术之间的进一步区别尤其包括第三中间体NS2S6S，也称为TriS。某些使用硫酸化的化学方法的现有方法不能制备缺乏3S二糖的中间体NS2S6S。某些化学酶法不能控制足以获得NS2S6S中间体的每个化学酶促步骤中的主要二糖基团含量。
在Bhaskar,U.,et al(2015).Carbohydrate Polymers,122,399-407中，主要的二糖组合物，例如前3OST中间体的NS6S、NS2S、NS2S6S，分别为7.8、15.7和67.9％(w/w)。得到的“肝素”与猪USP肝素不是生物等效的，并且该参考文献中前3OST中间体的二糖组成不同于生物等效肝素所需的第三中间体NS2S6S/TriS。报道的在该参考文献中制备的“肝素”的最高抗IIa活性为151U/mg，小于所需的180U/mg，使其与猪USP肝素不等效。此外，Bhaskar等人制备的产物的分子量是>25,000dal。
在Zhang,Z.,et al(2008)Journal of the American Chemical Society,130(39),12998-13007中，“肝素”，第三中间体NS2S6S的对应物，不含代表0S、2S、6S和2S6S的N-乙酰基。得到的“肝素”与猪USP肝素不是生物等效的，并且该参考文献中前3OST中间体的二糖不能满足生物等效肝素所需的第三中间体NS2S6S的要求。该肝素的活性通过基于凝块的活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定确定为180U/mg。该测定不等效于当前USP中描述的抗IIa活性，因此不清楚这是否符合猪USP肝素的活性规格。此外，在该研究中未进行抗Xa测定，因此未确定该“肝素”的抗Xa/抗IIa比率。总之，在没有N-乙酰基且没有确定的抗IIa和抗Xa活性的情况下，该肝素与猪USP肝素不具有生物等效性。
J Med Chem 48(2):349-352(2005)显示了“新肝素”分子，其分子量约为8,000；抗Xa 162；抗IIa 62；抗Xa/抗IIa 2.6，即非生物等效的。考虑到在新肝素和生物等效肝素之间的化学酶过程中3OST后反应的分子量和抗凝活性的差异，新肝素的前3OST中间体不同于生物等效肝素所需的第三中间体NS2S6S。
美国专利号6,162,797提供了通过差向异构化的N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体的分步化学硫酸化获得的肝素衍生物。但是，这种衍生物具有抗Xa 500-600、抗IIa 250-320(尽管在说明书中使用“APTT”代替抗IIa，并且很可能“APTT”应该是抗IIa)，即不是生物等效的。因此，该文献没有教导或建议与生物等效肝素所需的第三中间体NS2S6S等效的中间体。该专利也没有教导下面公开的第一(NS)中间体或第二中间体。
US 2014/0349962 A1显示通过肝素前体的化学酶促官能化获得的肝素衍生物“Mitrin”。“Mitrin”是不含2-O硫酸化艾杜糖醛酸基团并具有比美国肝素更高的抗Xa活性的六糖。因此，该文献没有教导或建议第二中间体(NS2S)或与第三中间体(NS2S6S)等效的中间体。
因此，尽管上述参考文献中描述的“生物合成肝素”与猪USP肝素共有一些性质，但它们与猪USP肝素不是化学上等效或生物等效的。上述参考文献也没有教导或建议缺少哪些因素、改变哪些步骤或如何改变它们，以制备生物合成肝素。本文所描述的生物合成肝素中间体未在体内肝素生成的中间体中发现。特别地，天然肝素中间体结合至蛋白多糖接头，(Sugahara K,Kitagawa H.(2002)Heparin and heparan sulfate biosynthesis.IUBMBLife,54(4):163-75)，因此，不以本发明中给出的规格的自由形式存在。因此，生物合成肝素不是天然产物。
本发明人已经生成了可以与猪USP肝素生物等效的生物合成肝素。本发明人已经阐明了对由肝素前体通过化学酶方法合成肝素是必需的三种中间体，该肝素与猪USP肝素生物等效。这些中间体，根据其主要二糖基团如下标记为NS中间体、NS2S中间体和NS2S6S中间体(或TriS中间体)，其特征在于特定范围的修饰糖种类，例如二糖基团。它们还可以通过分子量性质和分布来表征。这些中间体可能不具有抗凝血酶介导的抗凝血活性。
本公开涉及从肝素前体(例如衍生自细菌胞外多糖肝素前体的肝素前体)合成生物合成肝素，以及阐明可能是获得生物等效肝素所必需的关键中间体的性质。在一些实施方案中，生物合成肝素可满足美国药典(USP)的以下要求：活性、尤其是肝素对因子IIa(即抗IIa)的抗凝血活性不低于或高于180U/mg，以及因子Xa与因子IIa的活性比率(即抗Xa/抗IIa)在0.85-1.15或0.9和1.1或约1.0之间。生物合成肝素也可满足USP对分子量分布的以下要求：重量平均分子量为15,000-19,000Da；分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不超过总量的20％(这里包括0-15％、0-10％和5-10％)；以及分子量为8,000至16,000Da之间的链与分子量为16,000至24,000Da之间的链的比例不小于1.0(这里包括1.0至2.5；1.0至2.0、1.2至1.8、1.4-1.7、1.5、或1.6)。因此，生物合成肝素可与猪USP肝素生物等效。
在一个实施方案中，第一中间体NS可以是包含有效量的N-硫酸化(NS)二糖基团的糖胺聚糖材料。例如，N-硫酸化(NS)二糖基团可组成第一中间体NS的78-99.5％或78-99％或81-97％或83-95％或84-94％或85-93％或84-87％或85-86％或87.5-94％或90-93.5％或90.5-93％或90.3-91.3％或92.2-93.2％或这些范围内的任何值或子范围。在一些相关的实施方案中，第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。在所有情况下，所述NS必须包含一些可测量的NAc基团。
第一中间体的分子量性质可适合于形成可以使用例如下文公开的方法之一满足猪USP肝素钠的分子量规格的生物合成肝素。
在一些实施方案中，第一中间体NS是包含84.7-93.8重量％的N-硫酸化(NS)二糖基团的糖胺聚糖材料。在相关的实施方案中，其余部分是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(Nac)(0S)二糖基团。
在一些实施方案中，第一中间体NS可包括83.4-87.4％或83.9-86.9t％或84.4-86.4％或84.9-85.9％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。这种第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。
在一些实施方案中，第一中间体NS可包括从87.9％至92.9％或从88.4％至92.4％或从88.9％至91.9％或从89.4％至91.4％或从89.9％至90.9％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。这种第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。
在一些实施方案中，第一中间体NS可包括88.8-94.7％或89.3％-94.2％或89.8-93.7％或90.3％-93.2％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。这种第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。
在一些实施方案中，第一中间体NS可包括88.8-92.8％或89.3-92.3％或89.8-91.8％或90.3-91.3％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。这种第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。
在一些实施方案中，第一中间体可包括90.1-94.7％或90.6-94.2％或91.1％-93.7％或91.6％-93.2％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。这种第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。
另一个实施方案可以是糖胺聚糖第二中间体NS2S，其可以是包含有效量的N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团的糖胺聚糖材料。例如，在一些实施方案中，N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团可组成糖胺聚糖第二中间体NS2S的44-80％或45-79％或50-78％或50-77％或55-78％或55-76％或58-77％或59-76％或60-75％或58-62％或59-61％或65-77％或这些范围内的任何值或子范围。
除包含N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团外，糖胺聚糖第二中间体NS2S还可包含NS二糖基团。例如，NS二糖基团可组成糖胺聚糖第二中间体NS2S的12-40％或13-39％或15-34％或15-29％或16-29％或16-26％或17-25％或16-18％或19-66％或这些范围内的任何值或子范围。NS二糖基团的每个所述范围可以与N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团的上述范围中的每一个一起使用。
除了N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团和NS二糖基团之外，糖胺聚糖第二中间体NS2S还可包括一种或多种少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团。在某些实施方案中，除了N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团和N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团之外，糖胺聚糖第二中间体NS2S的仅有成分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化NAc(2S)二糖基团。在一些实施方案中，0S和2S二糖基团的组合量可以是第二中间体NS2S的0.4-25％或4-24％或5-24％或6-20％或6-18％或6-16％或7-23％或7-20％或7-17％或7-15％。
第二中间体的分子量性质可适合于形成可以使用例如下文公开的方法之一满足猪USP肝素钠的分子量规格的生物合成肝素。
在一些实施方案中，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含73.8-75.3重量％的N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团，以及18.5-20.2重量％的NS二糖基团。糖胺聚糖第二中间体NS2S的其余部分可包含少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。
在一些实施方案中，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含57.5-62.5％或58-62％或58.5-61.5％或59-61％或59.5-60.5％或这些范围内的值或子范围的NS2S二糖基团。此外，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含23.2-27.2％或23.7-26.7％或24.2-26.2％或24.7-25.7％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。糖胺聚糖第二中间体NS2S的其余部分可包含少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。0S和2S基团的组合量可占第二中间体的13.3-16.3％或13.8-15.8％或14.3-15.3％。
在一些实施方案中，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含65.8-77.4％或66.3-76.9％或66.8-76.4％或67.3-75.9％或这些范围内的值或子范围的NS2S二糖基团。此外，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含14.8-26％或15.3-25.5％或15.8-25％或16.3-24.5％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。糖胺聚糖第二中间体NS2S的其余部分可包含少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。0S和2S基团的组合量可占第二中间体的5.6-10.8％或6.1-10.3％或6.6-9.8％。
在一些实施方案中，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含65.8-74.4％或66.3-73.9％或66.8-73.4％或67.3-72.9％或这些范围内的值或子范围的NS2S二糖基团。此外，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含17.9-26％或18.4-25.5％或18.9-25％或19.4-24.5％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。糖胺聚糖第二中间体NS2S的其余部分可包含少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。0S和2S基团的组合量可占第二中间体的5.6-10.8％或6.1-10.3％或6.6-9.8％。
在一些实施方案中，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含73.4-77.4％或73.9-76.9％或74.4-76.4％或74.9-75.9％或这些范围内的值或子范围的NS2S二糖基团。此外，糖胺聚糖第二中间体NS2S可包含14.8-18.8％或15.3-18.3％或15.8-17.8％或16.3-17.3％或这些范围内的任何值或子范围的NS二糖基团。糖胺聚糖第二中间体NS2S的其余部分可包含少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。0S和2S基团的组合量可占第二中间体的5.8-9.8％或6.3-9.3％或6.8-8.8％。
第二中间体可适合形成大小和活性要求与猪USP肝素一致的肝素。换言之，第二中间体可以是这样的，即可以使用例如下文公开的方法之一形成大小和活性要求与猪USP肝素钠一致的肝素。例如，第二中间体可具有适于形成大小和活性要求与猪USP肝素钠一致的最终肝素产品的重量平均分子量。第二中间体中N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团的有效量可以是这样的，即可以使用例如下文公开的方法之一形成大小和活性要求与猪USP肝素钠一致的肝素。
另一个实施方案是糖胺聚糖第三中间体NS2S6S，其可以是包含有效量的N-硫酸化、2-O-硫酸化、6-O-硫酸化(NS2S6S或也称为TriS)二糖基团和N-硫酸化、6-O-硫酸化(NS6S)二糖基团的糖胺聚糖材料。例如，NS2S6S二糖基团可组成糖胺聚糖第三中间体NS2S6S的30-74％或31-73％或36-70％或40-67％或40-66％或42-65％或44-64％或42-45％或48-65％或这些范围内的任何值或子范围。NS6S二糖基团可组成糖胺聚糖第三中间体NS2S6S的5-40％或5-32％或5-26％或5-23％或5-7％或8-16％或18-23％或6-69％或6-32％或6-26％或6-21％或这些范围内的任何值或子范围。NS6S二糖基团的每个所述范围可以与NS2S6S二糖基团的上述范围中的每一个一起使用。
优选地，糖胺聚糖第三中间体NS2S6S不含3S二糖基团。
除了NS2S6S和NS6S二糖基团之外，糖胺聚糖第三中间体NS2S6S还可包含N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团和/或NS二糖基团。NS2S二糖基团可组成糖胺聚糖第三中间体NS2S6S的1-28％或1-27％或4-28％或8-28％或10-28％或11-28％或12-27％或11-22％或19-27％或3-23％或5-19％或7-16％或这些范围内的任何值或子范围。NS二糖基团可组成糖胺聚糖第三中间体NS2S6S的0.5-23％或0.5-20％或0.5-19％或0.5-18％或0.5-17％或1-21％或1-19％或1-18％或1-17％或1-15％或这些范围内的任何值或子范围。
除了NS2S6S、NS6S、NS2S和NS二糖基团之外，糖胺聚糖第三中间体NS2S6S可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)和2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种。在某些实施方案中，糖胺聚糖第三中间体NS2S6S的仅有组分可以是(a)0S；(b)6S；(c)2S；和/或(d)2S6S。糖胺聚糖第三中间体NS2S6S中(a)0S；(b)6S；(c)2S；(d)2S6S的总量可以是例如28％或更少或27％或更少或23％或19％或16％。在一些实施方案中，糖胺聚糖第三中间体NS2S6S中(a)0S；(b)6S；(c)2S；以及(d)2S6S的组合量可以是0.5-28％或1-27％或2-24％或3-23％或4-20％或5-19％或8-17％或7-16％或这些范围内的任何值或子范围。
在一些实施方案中，第三中间体可包含：57.4-62.0重量％(53.3-59.4mol％)N-硫酸化、2-O-硫酸化、6-O-硫酸化(NS2S6S或也称为TriS)二糖基团；17.7-22.2重量％(10.6-15.1mol％)N-硫酸化、6-O-硫酸化(NS6S)二糖基团；8.4-10.9重量％(12.0-13.8mol％)N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团；和3.1-8.1重量％(5.0-12.2mol％)NS二糖基团。在相关的实施方案中，其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)和2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团，或由其组成。在进一步的实施方案中，第三中间体(NS2S6S)包含不超过10重量％的选自(a)0S；(b)6S；(c)2S；和/或(d)2S6S的总次要二糖序列。优选地，这种第三中间体不含3S二糖基团。
在一些实施方案中，第三中间体可包含41.5-45.5％或42-45％或42.5-44.5％或43-44％的NS2S6S二糖基团、8.5-12.5％或9-12％或9.5-11.5％10-11％的NS6S二糖基团、12-15％或12.5-14.5％或13-14％的NS2S二糖基团以及14.6-18.6％或15.1-18.1％或15.6-17.6％或16.1-17.1％的NS二糖基团。其余部分可包含0S；(b)6S；(c)2S；(d)2S6S中的一个或多个，或由其组成。第三中间体中0S、6S、2S和/或2S6S基团的组合量可占第三中间体的14.4-17.4％或14.9-16.9％或15.4-16.4％。优选地，这种第三中间体不含3S二糖基团。
在一些实施方案中，第三中间体可包含51.3-60.3％或51.8-59.8％或52.3-59.3％或52.8-58.8％的NS2S6S二糖基团、8.6-13.5％或9.1-13％或9.6-12.5％或10.1-12％的NS6S二糖基团、10-15.8％或10.5-15.3％或11-14.8％或11.5-14.3％的NS2S二糖基团以及7.4-15.2％或7.9-14.7％或8.4-14.2％或8.9-13.7％或8.9-9.9％或11.7-13.7％的NS二糖基团。其余部分可包含0S；(b)6S；(c)2S；(d)2S6S中的一个或多个，或由其组成。在一些实施方案中，2S6S基团可能不存在于第三中间体中。第三中间体中0S、6S、2S和/或2S6S基团的组合量可占第三中间体的7.3-11.6％或7.8-11.1％或8.3-10.6％。优选地，这种第三中间体不含3S二糖基团。
在一些实施方案中，第三中间体可包含41.5-65.7％或42-65.2％或42.5％-64.7％或43-64.2％的NS2S6S二糖基团、4.1-23.3％或4.6-22.8％或5.1％-22.3％或5.6-21.8％的NS6S二糖基团、10-28.6％10.5-28.1％或11-27.6％或11.5-27.1％或11.1-17.8％或19-27.6％的NS2S二糖基团以及0.4-15.9％或0.7-15.4％或1-14.9％或1-14.4％或0.4-5.5％或10.2-14.9％的NS二糖基团。其余部分可包含0S；(b)6S；(c)2S；(d)2S6S中的一个或多个，或由其组成。在一些实施方案中，2S6S基团可能不存在于第三中间体中。第三中间体中0S、6S、2S和/或2S6S基团的组合量可占第三中间体的5.3-9.7％或5.8-9.2％％或6.3-8.7％。优选地，这种第三中间体不含3S二糖基团。
第三中间体的分子量性质可适合于形成可以使用例如下文公开的方法之一满足猪USP肝素钠的分子量规格的生物合成肝素。
第三中间体可适合形成大小和活性要求与猪USP肝素一致的肝素。换言之，第三中间体可以是这样的，即可以形成大小和活性要求与猪USP肝素一致的肝素。例如，第三中间体可具有适于形成大小和活性要求与猪USP肝素钠一致的最终肝素产品的重量平均分子量。换言之，第三中间体可以是这样的，即可以形成大小和活性要求与猪USP肝素一致的肝素。第三中间体中NS2S6S和NS6S二糖基团的有效量可以是这样的，即可以形成大小和活性要求与USP肝素一致的肝素。
有可能第一、第二和第三中间体都不具有抗凝血活性。这些中间体中没有一种可以在自然界中找到。本申请人已经能够使用上述公开的三种中间体获得大小和活性要求与猪USP肝素一致的生物等效USP肝素的肝素。
还提供了制备可以与猪USP肝素生物等效的肝素的方法。
一个实施方案可以是一种从第三中间体NS2S6S产生可以与猪USP肝素生物等效的肝素的方法。在某些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得如上所述的糖胺聚糖第三中间体NS2S6S；以及
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate，PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3-O-sulfotransferaseisoform 1，3OST-1)处理所述第三中间体NS2S6S以产生可以与猪USP肝素钠生物等效的肝素。
在一些实施方案中，第三中间体NS2S6S的处理可以在PAPS再循环系统的存在下进行，其中所述PAPS再循环系统可包含对硝基苯基硫酸盐(PNPS)和PAPS。PAPS再循环系统还可包含催化剂，例如芳基磺基转移酶IV(AST-IV)，其可用来使用对硝基苯基硫酸盐(PNPS)作为硫酸盐供体来催化PAP转化为PAPS，其中在反应中具有基于第三中间体NS2S6S通过3OST-1酶进行的摩尔转化的足够的PNPS。在一些实施方案中，所述处理可以在没有PAPS再循环系统的情况下进行，其在反应中具有基于第三中间体NS2S6S通过3OST-1酶进行的摩尔转化的足够的PAPS。在一些实施方案中，所述处理可以在缓冲液2-吗啉乙磺酸(MES)反应缓冲液中在3OST-1酶的存在下进行。可以使用本领域技术人员已知的其他合适的缓冲液和缓冲液浓度，例如磷酸盐缓冲液。可以存在硫酸盐供体，例如PAPS或PAP加PNPS。所述缓冲液的pH可以为7.0-7.4，例如约7.2。所述处理可以在升高的温度下进行，例如30-45℃或33-42℃或35-40℃。优选地，对于处理，使用新鲜的酶，例如3OST-1。所述酶可以被固定或在溶液中。处理后，含有生物合成肝素的处理的产物可被纯化以除去后反应化合物，例如PAP、PAPS、PNPS和/或PNP。在一些实施方案中，所产生的生物合成肝素可以使用色谱法(例如强阴离子交换色谱法，其可含有阴离子交换树脂，例如Q Sepharose树脂)进行纯化。所产生的生物合成肝素可以在盐溶液(可以是例如NaCl溶液)中结合至这种树脂。然后纯化的生物合成肝素可被脱盐并浓缩。
在一些实施方案中，如果在产生的肝素中未获得所需的活性、抗凝血活性和/或抗IIa活性，则可重复处理以产生具有所需活性的肝素。例如，最初产生的肝素的对因子Xa与因子IIa的活性比率(即抗Xa/抗IIa)可以低于0.9，例如0.6-0.9或0.7-0.9、或高于1.1的值，例如1.1-1.5或1.1-1.4或1.1-1.3或1.1-1.2范围内的值，可以重复用3OST-1处理以产生具有对因子Xa与因子IIa的活性比率(即抗Xa/抗IIa)为0.9-1.1或约1.0的肝素。
例如，在一些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得糖胺聚糖，其优选地不含3S二糖基团，而包含：
(i)57.4-62.0重量％N-硫酸化、2-硫酸化、6-硫酸化(TriS)二糖基团；
(ii)17.7-22.2重量％N-硫酸化、6-硫酸化(NS6S)二糖基团；
(iii)8.4-10.9重量％N-硫酸化、2-硫酸化(NS2S)二糖基团；以及
(iv)3.1-8.1重量％N-硫酸化(NS)二糖基团；以及
(v)任选地，含有余量的包含少量二糖基团0S、2S、6S和2S6S的N-乙酰化葡糖胺残基的组合；
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理糖胺聚糖以产生可以与USP肝素生物等效的生物合成肝素。在步骤(b)中，可以将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基以获得可具有不低于或大于180单位/mg的抗IIa活性和0.85-1.15或0.9-1.1或约1.0的抗Xa/抗IIa比率的肝素。
在一些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得糖胺聚糖，其优选地不含3S二糖基团，而包含：
(i)30-74％或31-73％或36-70％或40-67％或40-66％或42-65％或44-64％或42-45％或48-65％的NS2S6S二糖基团，
(ii)5-40％或5-32％或5-26％或5-23％或5-7％或8-16％或18-23％或6-39％或6-32％或6-26％或6-21％的NS6S二糖基团，
(iii)1-28％或1-27％或4-28％或4-27％或8-28％或8-27％或10-28％或11-28％或12-27％或11-22％或19-27％的NS2S二糖基团，
(iv)0.5-23％或0.5-20％或0.5-19％或0.5-18％或0.5-17％或1-21％或1-19％或1-18％或1-17％或1-15％的NS二糖基团，以及
(v)任选地，包含糖胺聚糖的其余部分的一种或多种二糖基团0S、2S、6S和2S6S；
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理糖胺聚糖以产生可以与USP肝素生物等效的生物合成肝素。在步骤(b)中，可以将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基以获得可具有不低于或大于180单位/mg的抗IIa活性和0.85-1.15或0.9-1.1或约1.0的抗Xa/抗IIa比率的肝素。
在一些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得糖胺聚糖，其优选地不含3S二糖基团，而包含：
(i)41.5-45.5％或42-45％或42.5-44.5％或43-44％的NS2S6S二糖基团，
(ii)8.5-12.5％或9-12％或9.5-11.5％10-11％的NS6S二糖基团，
(iii)12-15％或12.5-14.5％或13-14％的NS2S二糖基团，
(iv)14.6-18.6％或15.1-18.1％或15.6-17.6％或16.1-17.1％的NS二糖基团以及
(v)任选地，包含糖胺聚糖的其余部分的一种或多种基团0S、2S、6S和2S6S；
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理糖胺聚糖以产生可以与USP肝素生物等效的生物合成肝素。在步骤(b)中，可以将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基以获得可具有不低于或大于180单位/mg的抗IIa活性和0.85-1.15或0.9-1.1或约1.0的抗Xa/抗IIa比率的肝素。
在一些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得糖胺聚糖，其优选地不含3S二糖基团，而包含：
(i)51.3-60.3％或51.8-59.8％或52.3-59.3％或52.8-58.8％的NS2S6S二糖基团，
(ii)8.6-13.5％或9.1-13％或9.6-12.5％或10.1-12％的NS6S二糖基团，
(iii)10-15.8％或10.5-15.3％或11-14.8％或11.5-14.3％的NS2S二糖基团，
(iv)7.4-15.2％或7.9-14.7％或8.4-14.2％或8.9-13.7％或8.9-9.9％或11.7-13.7％的NS二糖基团以及
(v)任选地，包含糖胺聚糖的其余部分的一种或多种二糖基团0S、2S、6S和2S6S；
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理第三中间体NS2S6S以产生可以与USP肝素生物等效的生物合成肝素。在步骤(b)中，可以将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基以获得可具有不低于或大于180单位/mg的抗IIa活性和0.85-1.15或0.9-1.1或约1.0的抗Xa/抗IIa比率的肝素。
在一些实施方案中，所述方法可包括：
(a)获得糖胺聚糖，其优选地不含3S二糖基团，而包含：
(i)41.5-65.7％或42-65.2％或42.5％-64.7％或43-64.2％的NS2S6S二糖基团，
(ii)4.1-23.3％或4.6-22.8％或5.1％-22.3％或5.6-21.8％的NS6S二糖基团，
(iii)10-28.6％10.5-28.1％或11-27.6％或11.5-27.1％或11.1-17.8％或19-27.6％的NS2S二糖基团，
(iv)0.4-15.9％或0.7-15.4％或1-14.9％或1-14.4％或0.4-5.5％或10.2-14.9％的NS二糖基团以及
(v)任选地，包含糖胺聚糖的其余部分的一种或多种二糖基团0S、2S、6S和2S6S；
(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理糖胺聚糖以产生可以与USP肝素生物等效的生物合成肝素。在步骤(b)中，可以将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基以获得可具有不低于或大于180单位/mg的抗IIa活性和0.85-1.15或0.9-1.1或约1.0的抗Xa/抗IIa比率的肝素。
另一个实施方案可以是一种制备如上所公开的第一中间体NS的方法。所述方法可包括获得肝素前体，然后将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化为N-磺基葡糖胺残基以产生第一中间体NS。N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可对应于第一中间体NS中N-硫酸化(NS)二糖基团的量。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的N-乙酰基葡糖胺残基转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。在另一个实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过使肝素前体与碱性水溶液(例如氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液)反应，并使用N-磺基转移酶催化剂用磷酸腺苷磷酸硫酸酯(PAPS)进行N-磺化。N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可对应于第一中间体NS中N-硫酸化(NS)二糖基团的量。在另一个实施方案中，肝素前体可以对肝素前体中的N-乙酰基葡糖胺残基与N-脱乙酰基酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以产生第一中间体NS。N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可对应于第一中间体NS中N-硫酸化(NS)二糖基团的量。在每种方法中，优选的是在化学或酶促N-磺化反应后剩余的未取代的氨基的数目应不大于在猪USP肝素钠中发现的未取代的氨基的数目，每条链一个或更少(T.Toida,H.Yoshida,H.Toyoda,I.Koshiishi,T.Imanari,R.E.Hileman,J.R.Fromm,R.J.Linhardt,Biochemical Journal,322,499-506,1997)。所产生的第一中间体的NS基团的数量可以通过控制化学或酶促过程来控制。(Z.Wang,et al.(2011),Journal of Biotechnology,156,188-196；A.Onishi(2015),Detailed physicochemical and biological analyses of heparins fromvarious sources,PhD dissertation,Rensselaer Polytechnic Institute,Troy,NY,USA)。
第一产生的中间体的分子量性质可以使得它们适合于形成可以使用例如下文公开的方法之一满足猪USP肝素钠的分子量规格的生物合成肝素。
用于本公开的方法中的肝素前体可以是，例如，使用细菌(例如大肠杆菌(E.coli)或多杀巴斯德氏菌)产生的肝素前体。例如，肝素前体可由大肠杆菌K5或大肠杆菌Nissle1917生产。在生产第一中间体之前，可以如Z.Wang et al(2011),Journal ofBiotechnology,156,188-196中所公开的那样将肝素前体N-脱乙酰基和解聚。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含84.7-93.8重量％N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括将肝素前体中84.7-93.8重量％的N-乙酰基葡糖胺残基进行转化以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的84.7-93.8重量％N-乙酰基葡糖胺残基转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中84.7-93.8重量％N-乙酰基葡糖胺残基进行转化来产生第一中间体NS。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含78-99.5％或78-99％或81-97％或83-95％或84-94％或85-93％或84-87％或85-86％或87.5-94％或90-93.5％或90.5-93％或90.3-91.3％或92.2-93.2％N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含83.4-87.4％或83.9-86.9％或84.4-86.4％或84.9-85.9％的N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。产生的第一中间体NS可具有足以通过该过程被转化以得到具有适当分子量性质的BSH的重量平均分子量。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含87.9％至92.9％或88.4％至92.4％或88.9％至91.9％或89.4％至91.4％或89.9％至90.9％的N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。产生的第一中间体NS可具有足以通过该过程被转化以得到具有适当分子量性质的BSH的重量平均分子量。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含88.8-94.7％或89.3％-94.2％或89.8-93.7％或90.3％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含88.8-92.8％或89.3-92.3％或89.8-91.8％或90.3-91.3％的N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。
在一些实施方案中，将肝素前体转化为第一中间体可涉及获得或制备肝素前体的溶液。溶液的浓度可以是0.05-12％或0.1-10％或0.1-5％或0.1-3％或0.5-2％的肝素前体。溶剂可以是例如水或水基溶剂。因此，溶液可以是水溶液。溶液可以与碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)反应。反应可在例如30-70℃或40-65℃或50-55℃的升高的温度下进行。然后可以将酸(例如HCl)加入到反应混合物中以将pH调节至约7。可以将产物暴露于N-磺化反应，该N-磺化反应可以例如使用一种或多种N-磺化试剂进行，所述N-磺化试剂可以是例如三氧化硫或硫磺三氧化硫复合物(例如硫胺复合物)。硫胺复合物的非限制性实施例包括硫三烷基胺复合物，例如硫三甲胺复合物、三氧化硫二甲基乙胺复合物，以及三氧化硫甲基二乙胺复合物，以及含三氧化硫-含芳基胺复合物，例如三氧化硫-吡啶复合物。然后可以将N-磺化反应的产物分馏以产生所需的分子量性质。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第一中间体NS的方法，所述第一中间体NS包含90.1-94.7％或90.6-94.2％或91.1％-93.7％或91.6％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团。所述第一中间体NS的其余部分可以是少量未经修饰的N-乙酰化葡糖胺(NAc)(0S)二糖基团。所述方法可包括转化肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中NS基团的量)以产生N-脱乙酰化、N-硫酸化肝素前体。在相关的实施方案中，第一中间体NS可由肝素前体制备，其通过在适当的条件下使肝素前体与化学试剂(氢氧化钠水溶液和磺化试剂，例如三乙胺-三氧化硫复合物)反应以将肝素前体中的一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)转化为N-磺基葡糖胺残基来提供第一中间体NS。替代地，肝素前体可与N-脱乙酰酶、N-磺基转移酶(NDST)反应以将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基(该量对应于第一中间体中的NS基团的量)进行转化来产生第一中间体NS。
另一个实施方案可以是一种制备如上所公开的第二中间体NS2S的方法。所述方法可包括(a)转化肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基以产生第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体NS中N-硫酸化(NS)二糖基团的量)以及然后(b)用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和/或2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生第二中间体NS2S。在一些实施方案中，第二中间体的链长可与第一中间体的链长没有明显差异。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
可以如上所述进行肝素前体向第一中间体的转化。
在一些实施方案中，处理可以在PAPS再循环系统的存在下进行，所述PAPS再循环系统可包含对硝基苯基硫酸盐(PNPS)和PAPS。所述PAPS再循环系统还可包含催化剂，例如芳基磺基转移酶IV(AST-IV)，所述催化剂可用于催化PAP向PAPS的转化，其中在反应中使用PNPS作为硫酸盐供体，其基于通过C5-epi和2OST酶进行的第一中间体的摩尔转化。在一些实施方案中，所述处理可以在没有PAPS再循环系统、但是在具有基于第一中间体NS2S6S的摩尔转化的在反应中足够量的PAPS的情况下进行。在一些实施方案中，所述处理可以例如在缓冲液(例如2-吗啉乙磺酸(MES)反应缓冲液)中进行。如本领域技术人员所知的其他合适的缓冲液和缓冲液浓度可在C5epi和2OST酶的存在下使用。可以存在例如PAPS或PAP加PNPS的硫酸盐供体。所述缓冲液的pH可以为7.0-7.4，例如约7.2。所述处理可以在例如30-45℃或33-42℃或35-40℃的升高的温度下进行。优选地，对于所述处理，使用新鲜的酶，例如C5epi和/或2OST。所述酶可以被固定或在溶液中。在处理后，可以纯化含有第二中间体的处理的产物以除去后反应化合物，例如PAP、PAPS、PNPS和/或PNP。纯化的第二中间体可被收集并浓缩以供进一步使用，例如分析和/或产生第三中间体。
在一些实施方案中，如果在处理后产生的糖胺聚糖中未获得所需的二糖特征，例如NS2S的百分比，则可重复该处理以产生具有例如第二中间体所需的NS2S百分比的二糖特征的糖胺聚糖。
例如，在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含73.8-75.3重量％N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团和18.5-20.2重量％NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中84.7-93.8重量％的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生第一中间体NS；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含44-80％或45-79％或50-78％或50-77％或55-78％或55-76％或58-77％或59-76％或60-75％或58-62％或59-61％或65-77％NS2S二糖基团和12-40％或13-39％或15-34％或15-29％或16-29％或17-25％或16-26％或16-18％或19-26％的NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含78-99.5％或78-99％或81-97％或83-95％或84-94％或85-93％或84-87％或85-86％或87.5-94％或90-93.5％或90.5-93％或90.3-91.3％或92.2-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS，以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含57.5-62.5％或58-62％或58.5-61.5％或59-61％或59.5-60.5％的NS2S二糖基团和23.2-27.2％或23.7-26.7％或24.2-26.2％或24.7-25.7％的NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含83.4-87.4％或83.9-86.9％或84.4-86.4％或84.9-85.9％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含65.8-77.4％或66.3-76.9％或66.8-76.4％或67.3-75.9％的NS2S二糖基团和14.8-26％或15.3-25.5％或15.8-25％或16.3-24.5％的NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含88.8-94.7％或89.3％-94.2％或89.8-93.7％或90.3％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS，以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含65.8-74.4％或66.3-73.9％或66.8-73.4％或67.3-72.9％的NS2S二糖基团和17.9-26％或18.4-25.5％或18.9-25％或19.4-24.5％的NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含88.8-92.8％或89.3-92.3％或89.8-91.8％或90.3-91.3％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS，以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第二中间体NS2S的方法，所述第二中间体NS2S包含73.4-77.4％或73.9-76.9％或74.4-76.4％或74.9-75.9％的NS2S二糖基团和14.8-18.8％或15.3-18.3％或15.8-17.8％或16.3-17.3％的NS二糖基团。所述第二中间体NS2S中的其余部分可包含少量未经修饰的NAc(0S)二糖基团和/或2-O-硫酸化、NAc(2S)二糖基团，或由其组成。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含90.1-94.7％或90.6-94.2％或91.1％-93.7％或91.6％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；以及(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS，以产生第二中间体NS2S。优选地，所述处理涉及C5-epi和2OST酶。
另一个实施方案可以是一种制备如上所公开的第三中间体NS2S6S的方法。所述方法可包括(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体NS中N-硫酸化(NS)二糖基团的量)；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和/或2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生第二中间体NS2S；以及(c)在硫酸盐供体(例如磷酸腺苷磷酸酯(PAPS))的存在下，用酶(例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3))处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
可如上所公开将肝素前体转化以产生第一中间体并进行第一中间体的处理。
在一些实施方案中，所述处理可以在PAPS再循环系统的存在下进行，所述PAPS再循环系统可包含对硝基苯基硫酸盐(PNPS)和PAPS。所述PAPS再循环系统还可包含催化剂，例如芳基磺基转移酶IV(AST-IV)，所述催化剂可用于使用PNPS作为硫酸盐供体来催化PAP向PAPS的转化，其中在反应中具有基于通过例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3)的酶进行的第二中间体的摩尔转化的足够量的PNPS。在一些实施方案中，所述处理可以在没有PAPS再循环系统，但是在具有基于通过例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3)的酶进行的第二中间体的摩尔转化的在反应中足够量的PAPS的情况下进行。在一些实施方案中，所述处理可以在6OST-1和6OST-3酶的存在下在例如2-吗啉乙磺酸(MES)反应缓冲液的缓冲液中进行。可以存在例如PAPS或PAP加PNPS的硫酸盐供体。所述缓冲液的pH可以为7.0-7.4，例如约7.2。所述处理可以在例如30-45℃或33-42℃或35-40℃的升高的温度下进行。优选地，对于所述处理，使用新鲜的酶，例如6OST-1和/或6-OST-3。所述酶可以被固定或在溶液中。在处理后，可以纯化含有第三中间体的处理的产物以除去后反应化合物，例如PAP、PAPS、PNPS和/或PNP。纯化的第三中间体可被浓缩并收集以供进一步使用，例如分析和/或产生生物合成肝素。
在一些实施方案中，如果在第二中间体NS的处理后产生的糖胺聚糖中未获得所需的二糖特征，例如NS2S6S的百分比，则可重复该处理以产生具有例如第三中间体所需的NS2S6S和NS2S百分比的二糖特征的糖胺聚糖。
例如，在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第三中间体NS2S6S的方法，所述第三中间体NS2S6S包含：57.4-62.0重量％N-硫酸化、2-O-硫酸化、6-O-硫酸化(NS2S6S)二糖基团；17.7-22.2重量％N-硫酸化、6-O-硫酸化(NS6S)二糖基团；8.4-10.9重量％N-硫酸化、2-O-硫酸化(NS2S)二糖基团；以及3.1-8.1重量％NS二糖基团。所述第三中间体NS2S6S的其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种，或由其组成。第三中间体优选地不含3S二糖基团。该方法可包括：(a)将肝素前体中84.7-93.8重量％的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生第一中间体NS；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生第二中间体NS2S；以及(c)在硫酸盐供体(例如磷酸腺苷磷酸酯(PAPS))的存在下，用酶(例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3))处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第三中间体NS2S6S的方法，所述第三中间体NS2S6S包含30-74％或31-73％或36-70％或40-67％或40-66％或42-65％或44-64％或42-45％或48-65％的NS2S6S二糖基团、5-40％或5-32％或5-26％或5-23％或5-7％或8-16％或18-23％或6-39％或6-32％或6-26％或6-21％的NS6S二糖基团、1-28％或1-27％或4-28％或4-27％或8-28％或8-27％或10-28％或11-28％或12-27％或11-22％或19-27％的NS2S二糖基团；以及0.5-23％或0.5-20％或0.5-19％或0.5-18％或0.5-17％或1-21％或1-19％或1-18％或1-17％或1-15％的NS二糖基团。所述第三中间体NS2S6S的其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种，或由其组成。第三中间体优选地不含3S二糖基团。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含78-99.5％或78-99％或81-97％或83-95％或84-94％或85-93％或84-87％或85-86％或87.5-94％或90-93.5％或90.5-93％或90.3-91.3％或92.2-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生包含44-80％或45-79％或50-78％或50-77％或55-78％或55-76％或58-77％或59-76％或60-75％或58-62％或59-61％或65-77％的NS2S二糖基团和12-40％或13-39％或15-34％或15-29％或16-29％或16-26％或17-25％或16-18％或19-26％的NS二糖基团的第二中间体NS2S；以及(c)在硫酸盐供体(例如磷酸腺苷磷酸酯(PAPS))的存在下，用酶(例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3))处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第三中间体NS2S6S的方法，所述第三中间体NS2S6S包含41.5-45.5％或42-45％或42.5-44.5％或43-44％的NS2S6S二糖基团、8.5-12.5％或9-12％或9.5-11.5％10-11％的NS6S二糖基团、12-15％或12.5-14.5％或13-14％的NS2S二糖基团以及14.6-18.6％或15.1-18.1％或15.6-17.6％或16.1-17.1％的NS二糖基团。所述第三中间体NS2S6S的其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种，或由其组成。第三中间体优选地不含3S二糖基团。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含83.4-87.4％或83.9-86.9％或84.4-86.4％或84.9-85.9％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生包含57.5-62.5％或58-62％或58.5-61.5％或59-61％或59.5-60.5％的NS2S二糖基团和23.2-27.2％或23.7-26.7％或24.2-26.2％或24.7-25.7％的NS二糖基团的第二中间体NS2S；(c)在硫酸盐供体(例如磷酸腺苷磷酸酯(PAPS))的存在下，用酶(例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3))处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第三中间体NS2S6S的方法，所述第三中间体NS2S6S包含51.3-60.3％或51.8-59.8％或52.3-59.3％或52.8-58.8％的NS2S6S二糖基团、8.6-13.5％或9.1-13％或9.6-12.5％或10.1-12％的NS6S二糖基团、10-15.8％或10.5-15.3％或11-14.8％或11.5-14.3％的NS2S二糖基团以及7.4-15.2％或7.9-14.7％或8.4-14.2％或8.9-13.7％或8.9-9.9％或11.7-13.7％的NS二糖基团。第三中间体NS2S6S的其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种，或由其组成。第三中间体优选地不含3S二糖基团。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含88.8-94.7％或89.3％-94.2％或89.8-93.7％或90.3％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生包含65.8-74.4％或66.3-73.9％或66.8-73.4％或67.3-72.9％的NS2S二糖基团和17.9-26％或18.4-25.5％或18.9-25％或19.4-24.5％的NS二糖基团的第二中间体NS2S；以及(c)在硫酸盐供体(例如磷酸腺苷磷酸酯(PAPS))的存在下，用酶(例如6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3))处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
在一些实施方案中，所述方法可以是一种制备第三中间体NS2S6S的方法，所述第三中间体NS2S6S包含41.5-65.7％或42-65.2％或42.5％-64.7％或43-64.2％的NS2S6S二糖基团、4.1-23.3％或4.6-22.8％或5.1％-22.3％或5.6-21.8％的NS6S二糖基团、10-28.6％10.5-28.1％或11-27.6％或11.5-27.1％或11.1-17.8％或19-27.6％的NS2S二糖基团以及0.4-15.9％或0.7-15.4％或1-14.9％或1-14.4％或0.4-5.5％或10.2-14.9％的NS二糖基团。所述第三中间体NS2S6S的其余部分可包含0S、2S、6-O-硫酸化、NAc(6S)2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、NAc(2S6S)二糖基团中的一种或多种，或由其组成。第三中间体优选地不含3S二糖基团。该方法可包括：(a)将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基转化以产生包含90.1-94.7％或90.6-94.2％或91.1％-93.7％或91.6％-93.2％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一中间体NS(N-乙酰基葡糖胺残基的转化量可相当于第一中间体中NS基团的量)；(b)在硫酸盐供体(例如3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐(PAPS))的存在下，用酶(例如C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST))处理第一中间体NS以产生包含65.8-77.4％或66.3-76.9％或66.8-76.4％或67.3-75.9％的NS2S二糖基团和14.8-26％或15.3-25.5％或15.8-25％或16.3-24.5％的NS二糖基团的第二中间体NS2S；以及(c)在磷酸腺苷磷酸酯(PAPS)的存在下，用6-O-磺基转移酶1和3(6OST-1,3)处理第二中间体NS2S以产生第三中间体NS2S6S。
另一个实施方案可以是一种制备肝素的方法，所述肝素可与USP肝素生物等效，所述方法包括在硫酸盐供体(例如PAPS)的存在下，用酶(例如3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1))处理如上所公开的第三中间体NS2S6S以将葡糖胺残基的3-羟基转化为3-O-磺基葡糖胺残基，从而产生可以与猪UPS肝素钠生物等效的肝素。
在上述与2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3中的一种或两种的磺基转移酶反应中，酶可能需要硫酸盐供体(通常是PAPS)和再生系统。一种或多种酶，例如2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3中的一种或两种，以及硫酸盐供体(例如PAPS)，可以处于溶液中。可以固定酶。在一些实施方案中，反应在体外进行。在其他实施方案中，一个或多个步骤发生在编码NDST、C5-Epi、2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3之一中的一种或多种的基因的微生物宿主、以及PAPS的来源内。
尽管上述公开的方法可以产生与猪USP肝素生物等效的肝素，但在一些实施方案中，所产生的肝素可能不满足与猪USP肝素的生物等效性的一个或多个要求。
在一些实施方案中，所产生的肝素批次可满足猪USP肝素对分子量和抗凝血活性的要求，但是不满足猪USP肝素对抗IIa活性的要求。例如，所产生的肝素批次可以满足猪USP肝素对分子量和抗凝血活性的要求，同时对因子Xa与因子IIa的活性比率(即抗Xa/抗IIa)低于0.9，例如在0.5-0.9或0.6-0.9或0.7-0.9范围内的值，或高于1.1，例如1.1-1.5或1.1-1.4或1.1-1.3或1.1-1.2范围内的值。这种批次可用外加酶处理(例如用3-O-磺基转移酶同种型1(3OST-1)处理，其可在硫酸盐供体(例如PAPS)的存在下进行)被转化为可与猪USP肝素生物等效的肝素批次。
在一些实施方案中，所产生的肝素批次可满足猪USP肝素对抗凝血活性的要求，但是不满足猪USP肝素对抗IIa活性和分子量的要求。例如，所产生的批次的对因子Xa与因子IIa的活性比率(即抗Xa/抗IIa)可低于0.9，例如0.5-0.9或0.6-0.9或0.7-0.9之间的值，或高于1.1，例如1.1-1.5或1.1-1.4或1.1-1.3或1.1-1.2范围内的值，并且使用外加酶处理(例如用3-O-磺基转移酶异构体1(3OST-1)处理，其可在硫酸盐供体(例如PAPS)的存在下进行)以提供对因子Xa与因子IIa的活性比，所述活性比满足猪USP肝素对抗IIa活性的要求。
尽管所产生的肝素可与猪USP肝素生物等效，但在一些实施方案中，所产生的肝素对于天然产生的肝素(例如牛或猪肝素)可能是物理上不同的，其仍然与猪USP肝素生物等效。例如，本发明的方法可允许产生可以与猪USP肝素生物等效的批次的肝素，使得所产生的批次之间在以下的一种或多种中更一致或更均一：a)化学组成，b)分子量，例如重量平均分子量，以及c)与天然产生的肝素批次(例如来自牛肠的肝素批次)相比的分子量分布。
本发明的方法可以产生至少50mg或至少80mg或至少100mg或至少200mg或至少1g或至少2g的肝素批次。
所产生的批次之间在分子量、二糖组成和生物活性方面可以是一致的。上述规模的所产生的批次均可满足猪USP肝素的要求，例如分子量、二糖组成和生物活性要求。一致的批次的量可以是至少2或至少3或至少5或至少7或至少10或至少12或至少15或至少20。
本公开还提供了一种药物组合物，其包含使用上述公开的方法产生的生物等效肝素。所述药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，肝素可以例如被配制在水中或等渗盐水或葡萄糖中。在一些实施方案中，肝素组合物可包括一种或多种防腐剂(例如亚硫酸氢盐)或抗菌剂(例如苯甲醇)。
在一些实施方案中，根据本公开产生的生物等效肝素可以以药学上可接受的盐的形式使用，其可以是例如钠盐或钾盐。药学上可接受的盐的非限制性实施例包括锂、钠、钙、钡、钾、镁和铵。
在一些实施方案中，根据以上本公开产生的生物等效肝素可用作制备低分子量肝素的起始原料。这可以通过例如简单地用根据本公开产生的生物等效肝素替换猪肠肝素然后使用已知的方法之一来合成低分子量肝素来完成。在一个实施方案中，根据本公开产生的生物等效肝素的盐(例如钠盐或钾盐)可被转化为苯并鎓(benzthonium)盐，然后可以将其苄基化并用碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)处理以部分解聚。将得到的低分子量肝素产物转化为盐，例如钠盐或钾盐，并纯化。该过程可以提供低分子量肝素依诺肝素(enoxaparin)。其他过程可用于将根据本公开产生的生物等效肝素转化为其他低分子量肝素，例如达帕他林(daltaparin)或亭扎肝素(tinzaparin)。
本公开还包括一种在对象/受试者(例如人)中稀释血液的方法，所述方法包括使用上述公开的方法之一产生生物等效肝素，并向对象施用有效量的所产生的生物等效肝素。
本公开还包括一种治疗和/或预防对肝素敏感的疾病或病症的方法，所述方法包括使用上述公开的方法之一产生生物等效肝素，并向对象(例如人)施用有效量的所产生的生物等效肝素。这种疾病或病症的非限制性实施例包括深静脉血栓形成、肺栓塞和动脉血栓栓塞。
生物等效肝素也可用于体外治疗，所述体外治疗包括肾衰竭患者的肾透析或在开心手术中进行体外循环的患者的血液氧合。
生物等效肝素的有效量可指足以产生预期效果的量，所述效果例如是稀释血液或治疗对肝素敏感的疾病或病症。
生物等效肝素的剂量可以与用于天然产生的USP肝素(例如猪或牛肝素)的剂量相同。
生物等效肝素可以使用多种施用方式来施用。在一些实施方案中，生物等效肝素可被肠外施用。例如，生物等效肝素可被静脉内、皮下或肌肉内注射。
本公开还提供了一种包含如上所公开的第一中间体NS的组合物。此类组合物可包含至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％或至少99.5％的第一中间体NS。所述组合物可以是这样的，它不含或基本上不含除第一中间体NS之外的任何多糖。术语“基本上不含”可指任何其他多糖不能够以可测量的量被检测。检测的方法可包括核磁共振(NMR)光谱法或用三种肝素裂解酶处理将肝素或肝素中间体分解成可通过透析或尺寸排阻色谱法除去的二糖。其他非肝素或非肝素中间体会对肝素裂解酶处理具有抗性，并且可以使用常规方法(例如NMR光谱法)来回收和检测。
本公开还提供了一种包含如上所公开的第二中间体NS2S的组合物。此类组合物可包含至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％或至少99.5％的第二中间体NS2S。试剂盒或组合物可以是这样的，它不含或基本上不含除第二中间体NS2S之外的任何多糖。
本公开还提供了一种包含如上所公开的第三中间体NS2S6S的组合物。此类试剂盒或组合物可包含至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％或至少99.5％的第三中间体NS2S6S。所述试剂盒或组合物可以是这样的，它不含或基本上不含除第三中间体NS2S6S之外的任何多糖。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒或组合物可以不含或基本上不含肝素。
本文所描述的实施方案通过以下工作实施例进一步说明，但决不限于此。
实施例
实施例1：肝素前体的产生。
大肠杆菌K5(血清变型O10:K5:H4；ATCC#23506)或大肠杆菌Nissle 1917(血清变型O6:K5:H1)用于肝素前体产生(Cress,B.F.,Toparlak,O.D.,Guleria,S.,Lebovich,M.,Stieglitz,J.T.,Englaender,J.A.,Jones,J.A.,Linhardt,R.J.,and Koffas,M.A.G.(2015)CRISPathBrick:Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arraysfor dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E.coli.ACSSynthetic Biology.4,987–1000；Wang,Z.,Ly,M.,Zhang,F.,Zhong,W.,Suen,A.,Hickey,A.M.,Dordick,J.S.,and Linhardt,R.J.(2010)E.coli K5fermentation and thepreparation of heparosan,a bioengineered heparin precursor.Biotechnology andBioengineering.107,964–973；Wang,Z.,Dordick,J.S.,and Linhardt,R.J.(2011)Escherichia coli K5heparosan fermentation and improvement by geneticengineering.Bioengineered bugs.2,63–67)。使用Eppendorf BioFlo 320或Biostat发酵罐分别在5L或45-90L下进行高细胞密度补料分批发酵。细胞在葡萄糖定义的培养基(pH6.8±0.01)中生长，所述培养基含有葡萄糖(通常为20g/L)、磷酸二氢钾(通常为13.5g/L)、磷酸铵(通常为4.0g/L)、七水硫酸镁(通常为1.4g/L)、柠檬酸(通常为1.7g/L)、以及微量金属溶液(通常为10.0ml/L)。在5M HCl(1.5L)中的微量金属溶液由FeSO4·7H2O(15g)、CaCl2(3.0g)、ZnSO4.7H2O(3.3g)、MnSO4.H2O(568mg)、CuSO4.5H2O(1.5g)、(NH4)6Mo7O24.4H2O(0.15g)、以及Na2B4O7.10H2O(0.03g)组成。将含有葡萄糖定义的培养基(pH 6.8±0.01)的种子烧瓶(种子I)用甘油储液(glycerol stock)接种，并在旋转振荡器上以200-250RPM在37℃下培养8-16小时。接下来，以10％接种密度从种子I接种含有葡萄糖定义的培养基(pH6.8±0.01)的种子烧瓶(种子II)，并在旋转振荡器上以200-250RPM在37℃下培养8-16小时。接下来，在含有无菌的葡萄糖定义的培养基(pH6.8±0.01)的发酵罐中以5-10％接种密度接种来自种子II的细胞。细胞在30％溶解氧、37℃下生长，并且用2N HCl/5M NH4OH将pH维持在6.8±0.01。在整个发酵过程中监测溶解氧水平、pH和细胞生长(用光密度OD600nm测量)。以含有葡萄糖(700g/L)、补充有磷酸二氢钾(47g/L)七水硫酸镁(20g/L)、硫胺素(0.4g/L)和微量金属溶液(20ml/L)浓缩的无菌饲料，以指数方式喂养细胞，并且控制喂养速度以维持培养物中的葡萄糖浓度和溶解氧水平。当OD600达到135-200(通常为140)时停止发酵。通过离心在4℃下收获上清液(含有肝素前体)。来自培养物上清液的肝素前体的纯化过程包括用次氯酸钠1.2(％，w/w)漂白以及通常在60％饱和度下的硫酸铵沉淀。将沉淀物溶解在水中并透析以获得肝素前体(Bhaskar,U.Chemoenzymatic Synthesis of Heparinfor a Safer Bioengineered Alternative.PhD dissertation,Rensselaer PolytechnicInstitute,Troy,NY,USA(2014))。
实施例2：中间体#1(NS)的产生。
如先前所报导的，从实施例1获得的肝素前体进行化学N-脱乙酰化和解聚(Z.Wang,J.Li,S.Cheong,U.Bhaskar,A.Onishi,F.Zhang,J.S.Dordick,R.J.Linhardt(2011),Response surface optimization of the heparosan N-deacetylation inproducing bioengineered heparin,Journal of Biotechnology,156,188-196)。1％浓度的肝素前体与1M氢氧化钠在50至55℃下反应18至28小时。然后，用HCl将反应混合物调节至pH 7，然后用过量的三氧化硫三甲胺复合物进行48小时的化学N-磺化。然后，使用乙醇沉淀来分离具有所需分子量性质的第一中间体NS(A.Onishi(2015),Detailedphysicochemical and biological analyses of heparins from various sources,PhDdissertation,Rensselaer Polytechnic Institute,Troy,NY,USA)。所述第一中间体NS的NS二糖基团含量为78.3至99.3mol％。分子量为15,100至18,100Da，分子量大于24,000的肝素多糖链的百分比为7.0至17.4；分子量范围为16,000至24,000Da的链的百分比为1.1至2.3。
实施例3：二糖分析、以及分子量分析、以及活性分析。
二糖总体分析
二糖分析用于测量猪USP肝素或生物工程肝素中间体的二糖组成。通过用肝素酶I、II和III处理，将样品消化成八种成分二糖。然后将产生的二糖分离并通过高压液相色谱-紫外(HPLC-UV)光谱法测量。对于NS(第一中间体)，1H-核磁共振(NMR)光谱也可用于定量两种构成的二糖(即0S和NS)。虽然本发明的二糖组合物被描述为摩尔％，但是本领域众所周知，它们也可以被描述为曲线下的面积(AUC)％、重量％、或本发明范围内的其他已知术语。
应当注意的是在本发明中，二糖AUC％等于二糖mol％，这是假设所有八种二糖在232nm处具有相同的摩尔消光系数，由于若干原因，其被认为是合适的假设。首先，众所周知的是，八种二糖中的每一种在结构中恰好具有一个Δ-4-5不饱和糖醛酸(ΔUA)。其次，最近关于肝素二糖分析的文章表明，二糖量化是基于数据驱动的共识假设，即Δ-4-5不饱和低聚糖在232nm处的摩尔消光系数是恒定的(P.Mourier et al.Quantitativecompositional analysis of heparin using exhaustive heparinase digestion andstrong anion exchange chromatography.Anal.Chem.Res.3,46-53(2015))。第三，在五种不同的肝素衍生的低聚糖中，在232nm处存在摩尔消光系数的一致性(5063+/-10％、5331+/-0.6％、5066+/-3.7％、5657+/-1.4％以及5275+/-％,M-1cm-1)(K.G.Rice andR.J.Linhardt.Study of structurally defined oligosaccharide substrates ofheparin and heparan monosulfate lyases.Carbohydr.Res.190,219-233(1989))。最后，在目前的猪USP肝素中实际使用了几乎相同的假设；猪USP肝素的分析方法假设所有这8种二糖在非常接近的234nm波长下具有相同的摩尔消光系数(USP40Chemical Tests,<207>Test for 1,6-Anhydro Derivative for Enoxaparin Sodium,pp 261-266.(UnitedStates Pharmacopoeial Convention,Rockville,MD,USA,2017))。在1H-NMR中，相对AU％相当于mol％。
通过1H-NMR分析中间体
1D 1H-NMR在以下条件下进行：温度298K、循环延迟时间至少2秒、获取时间至少0.75秒、扫描的次数至少16次、溶剂是D2O。纯化的肝素前体、每种中间体、生物合成肝素和USP猪肝素的1D 1H-NMR谱如图3所示。从前体肝素前体到最终产物的四步化学酶修饰，得到的生物合成肝素与USP猪肝素具有高度相似的化学结构。
关于通过1H-NMR对第一中间体进行的二糖分析，使用葡糖胺残基的H-1质子的峰面积进行定量。N-乙酰葡糖胺(0S二糖)的H-1质子出现在约5.31ppm，而N-磺基葡糖胺(NS二糖)的H-1质子出现在约5.55ppm。二糖组合物被表示为mol％；AUC％相当于mol％。
通过HPLC-UV分析二糖
简而言之，通过肝素酶消化分析样品，然后分离产生的二糖并通过强阴离子交换(SAX)-HPLC-UV进行测量。
典型的分析条件如下；应该注意的是，不影响二糖组成的非必要的微小修饰，例如肝素酶消化反应的线性缩小/放大、SAX柱的温度变化高达50℃，可适用。
将分析样品(100μg)与浓缩消化缓冲液(终浓度为50mM NH4OAc，2mM CaCl2)、来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的肝素酶I、II和III(每种肝素酶>100mIU，由我们的实验室如在(Zhang,F.,et al.Structural characterization of heparins fromdifferent commercial sources.Anal.Bioanal.Chem.401,2793-2803(2011).,Zhang Z,X.J.,Liu H,Liu J,Linhardt RJ.Quantification of Heparan Sulfate DisaccharidesUsing Ion-Pairing Reversed-Phase Microflow High-Performance LiquidChromatography with Electrospray Ionization Trap MassSpectrometry.Anal.Chem.81,4349-4355(2009)中所述的制备)、以及水混合，使得总体积为200μL。将混合物在35℃下培养2小时。培养后，通过使用(a)3kDa分子量截止旋转柱(具有Ultracel-3膜的Amicon Ultra-0.5Centrifugal Filter Unit，EMD Millipore,Billerica,MA,USA)的超滤，或(b)在95℃培养至少5分钟，然后离心，以将产生的二糖与肝素酶分离。通过使用第二中间体NS2S、第三中间体NS2S6S和USP肝素的直接比较研究，显示(a)和(b)之间的差异为至多2.6w/w％。
将20μL所产生的二糖注射到SAX色谱柱(Spherisorb-SAX色谱柱，4.0×250mm，5μm，Waters，France)上。柱温为40℃。流动相A是1.8mM NaH2PO4，用磷酸调节至pH 3.0，流动相B是1.8mM NaH2PO4，用1M NaClO4调节至pH 3.0。流动相B的线性梯度(0分钟，3％B；20分钟，35％B；50分钟，100％B；60分钟，3％B，80分钟，3％B)以0.45mL/min的流速施加。UV检测在232nm下进行，因为每种二糖的不饱和糖醛酸(ΔUA)在该波长下具有UV吸光度。二糖标准品购自Iduron(Manchester,UK)以鉴定在232nm处属于每种二糖的峰。为了确保分析的准确性和精确性，还在每次分析中消化和分析商业肝素钠活性药物成分(Celsus,Cincinnati,OH,USA)。为了确保HPLC峰面积的线性，在每次分析中分析了一系列稀释的二糖标准品。
二糖组成以w/w％和/或mol％表示。通过一系列商业标准基于标准曲线计算w/w％值。mol％值通过下式计算：
二糖i mol％＝(100×Ai)/(ΣxAx),
其中Ai是二糖i在232nm处的峰面积。Ax是峰面积；总和与出现在本说明书“定义”部分中的所有八种二糖有关。同样，在本发明中，假设所有8种二糖在232nm处具有相同的摩尔消光系数，则二糖的AUC％等于二糖的mol％。
通过HPLC-MS分析二糖
如文献(Bhaskar,U.Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a SaferBioengineered Alternative.PhD dissertation,Rensselaer Polytechnic Institute,Troy,NY(2014))中所述地进行分析。
详细地，将25μL水中的10μg分析样品与来自肝素黄杆菌的肝素酶I、II和III(每种肝素酶>10mIU)在5μL浓缩缓冲液(25mM Tris、500mM NaCl、300mM咪唑、pH7.4)中混合。将混合物在35℃下培养10小时。培养后，通过离心过滤用10kDa分子量截止离心柱(YM-10micro-concentrator,EMD Millipore,Billerica,MA,USA)回收产生的二糖。将流出物溶解在水中至浓度为50-100ng/2μL，用于液相色谱(LC)-质谱(MS)分析。
LC-MS分析在Agilent 1200LC/MSD仪器(Agilent Technologies,Inc.Wilmington,DE,USA)上进行，该仪器配备有6300离子阱和二元泵，其后是UV检测器。使用的柱是Poroshell 120C18柱(2.1×100mm，2.7μm，Agilent，USA)。洗脱液A为水/乙腈(85:15)v/v，以及洗脱液B为水/乙腈(35:65)v/v。两种洗脱液均含有12mM三丁胺和38mM乙酸铵，用乙酸将pH调节至6.5。使用溶液A的梯度5分钟，然后使用5至15分钟的线性梯度(0-40％溶液B)，流速为150μL/min。
分子量和浓度测定
通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量，根据USP 37肝素专著方法，并进行非必要的微小修饰。保护柱(TSK SWXL 6-mm x 4-cm，7-μm直径)与两个分析柱串联使用：TSKG4000SWXL 7.8-mm x 30cm，8-μm与TSK G3000SWXL 7.8-mm x 30-cm，5-μm(TosohCorporation,Minato-Ku,Tokyo,Japan)串联。这些柱连接至HPLC系统，该HPLC系统由Shimadzu LC-20AD泵、Shimadzu CBM-20A控制器、Shimadzu SIL-20AHT自动进样器、Shimadzu CTO-20AC柱温箱和Shimadzu RID-20A折射率检测器(Shimadzu,Kyoto,Japan)组成。柱和RID检测器保持在30℃。流动相为0.1M乙酸铵和0.02wt％叠氮化钠，以及流速为0.6mL/min。样品注射体积为20μL。用LC溶液版本5.73软件(Shimadzu,Kyoto,Japan)记录GPC色谱图，并用其“GPC Postrun”功能进行分析。对于分子量测定，USP肝素钠分子量校准RS(参考标准)用作校准物以及USP肝素钠鉴定RS(USP,MD,US)用于确认系统适用性。此外，注射被制备为几种浓度的USP肝素钠鉴定RS来获得标准曲线以使用曲线下面积(AUC)来计算反应样品的浓度。所有数据均通过了USP专著中所述的系统适用性要求。为了计算，使用三阶多项式方程。分子量参数的定义如下。
使用以下等式计算重量平均分子量(MW)
Figure BDA0002043374040000391
其中Ni是分子量Mi的分子的数量。M24000是分子量大于24,000Da的肝素链的百分比。M8000-16000/M16000-24000是分子量在8,000-16,000Da范围内的肝素的百分比与分子量在16,000-24,000Da范围内的肝素的百分比之比。
体外抗凝血活性测量
使用BIOPHEN肝素抗Xa(两阶段)和抗IIa(两阶段)试剂盒(Aniara,West Chester,Ohio)测定肝素的抗Xa和抗IIa活性。将人ATIII 40mU在80μL R1缓冲液(Tris 0.05M、NaCl0.175M、EDTA 0.0075M、pH 8.40，含有0.1wt％的聚乙二醇，以及0.02wt％叠氮化钠作为防腐剂)用于抗Xa测定。将与不同质量的肝素(范围为0、5、10、15和20ng)混合的在80μL R2缓冲液(Tris 0.05M、NaCl 0.175M、EDTA 0.0075M、pH 8.40，含有0.2wt％的牛血清白蛋白，以及0.02wt％叠氮化钠作为防腐剂)中的人ATIII 10mU在37℃下培养2分钟。然后，加入在37℃下预培养的纯化的牛因子Xa(在40μL R1缓冲液中320ng)或纯化的人凝血酶(在40μL R2缓冲液中960mU)并培养2分钟，然后加入对Xa因子特异的显色底物(CS-01(65),1.2mM,40μL)或对凝血酶特异的显色底物(CS-01(38),1.25mM,40μL)。将反应混合物在37℃下培养2分钟用于抗Xa测定，并且培养1分钟用于抗IIa测定，然后用柠檬酸(20mg/mL，80μL)终止。在405nm处测量吸光度。使用不同浓度的肝素(0-1U/mL)的标准曲线计算抗Xa和抗IIa活性。
实施例4：酶(C5-差向异构酶、2OST、6OST-1、6OST-3、3OST-1、AST-IV)的产生。
将MBP标记的酶(C5epi、2OST、6OST-1和6OST-3)的细胞团(cell pellet)(10g湿重)分散在含有蛋白酶抑制剂(Sigma,USA)和8000kU/L DNAse I(Sigma,USA)的50mL纯化缓冲液(25mM Tris-HCl(BioRad,USA)、500mM NaCl(Sigma,USA)、pH7.5)中。使得到的细胞悬浮液在15000psi下通过微流化器(Microfluidics LM20,USA)进行细胞裂解。通过在4℃下以13000g离心30分钟除去细胞碎片。根据制造商的说明书，使用10mL直链淀粉树脂(NEB,USA)纯化可溶性酶。
将His6标记的酶(3OST-1和AST-IV)的细胞团(10g湿重)分散在含有蛋白酶抑制剂和8000kU/L DNAse I的50mL纯化缓冲液(25mM Tris-HCl、500mM NaCl、30mM咪唑、pH 7.5)中。如前所述进行细胞裂解，并根据制造商的方案使用10mL Ni-NTA琼脂糖凝胶(GEHealthcare,Sweden)纯化可溶性酶。通过SDS-PAGE凝胶(BioRad,USA)分析对纯化的酶进行分析。
实施例5：固定化酶催化剂的制备和活性表征。
His6标记的酶(3OST-1和AST-IV)用含有500mM NaCl和500mM咪唑的25mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液从Ni-NTA琼脂糖珠上洗脱，并且MBP标记的酶(C5epi、2OST、6OST-1和6OST-3)用含有500mM NaCl和40mM麦芽糖的25mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液从直链淀粉树脂上洗脱。使用10kDa离心过滤器(Millipore，USA)，用偶联缓冲液(磷酸钠缓冲液(AlfaAesar，USA)，100mM；NaCl，150mM；pH7.5)替换洗脱酶的缓冲液。对于酶的共价固定，将30-40mg的商业珠子，例如CNBr Sepharose(GE Healthcare,Sweden)、Azlactone basedUltralink Biosupport(ThermoFisher,USA)和NHS-琼脂糖(Thermo Fisher,USA)，在室温下使用1-2mg酶单独培养1小时，并轻轻翻转(根据制造商的说明)。在共价固定后，用偶联缓冲液洗涤各个珠子，并使用猝灭缓冲液(100mM Tris-HCl和1M NaCl，pH 8.0)淬灭珠子上剩余的官能团(根据制造商的说明书)。通过测量上清液、洗涤液和猝灭溶液中最初添加的酶和未结合的酶来计算酶在各个珠子上的偶联效率。通过ImageLab软件(BioRad，USA)和BCA(Thermo Fisher，USA)测定使用SDS-Page凝胶分析来计算酶的量。牛血清白蛋白(BSA)(ThermoFisher，USA)用作偶联效率计算的标准。
实施例6：中间体#2(NS2S)的产生。
该硫酸化步骤可以在有或没有包含PNPS、PAPS和固定化AST-IV的PAPS再循环系统的情况下进行。用固定化的2OST和C5-epi处理第一中间体NS。在MES反应缓冲液(50mM，pH7.2)中详细的酶促反应条件如下：1mg/mL NS、0.25mg/mL C5epi、0.5mg/mL 2OST、10mM对硝基苯基硫酸盐(PNPS)和1mM PAP(仅在应用再循环系统时)、反应温度为37℃以及反应时间为24小时。对于非再循环反应，除了不存在PAP、PNPS和AST-IV，1.2mM过量的PAPS浓度取决于目标NS2S转化率之外，使用与上述相同的条件。如实施例4和5中所描述地在反应前制备并固定新鲜酶。纯化时，使用5kDa MWCO膜超滤来除去后反应化合物，例如PAP和PAPS(如果应用再循环，则加上PNP和PNPS)。将保留物浓缩并收集用于二糖分析。如果NS2S％未达到目标，则可以重复该步骤。
实施例7：中间体#3(NS2S6S和NS6S)的产生。
用于产生中间体#3的反应步骤遵循用于中间体#2的方法，不同之处在于NS2S代替NS并且固定化的6OST-1和6OST-3(均为0.5mg/mL)代替C5-epi和2OST。如果NS2S6S(TriS)％未达到目标，则可以重复该反应。
实施例8：生物合成肝素的产生。
通过与实施例5中所描述的相同的方式，制备固定化重组酶3OST-1。反应在与用于第二和第三中间体的相同条件下进行，不同之处在于用固定化的3OST-1代替酶。使用具有QSepharose树脂的强阴离子交换(SAX)色谱法纯化最终的生物合成肝素。简而言之，在40mMNaCl溶液中将生物合成肝素与树脂结合，然后进行400mM NaCl溶液洗涤。使用4M NaCl溶液洗脱纯化的生物合成肝素，然后脱盐并浓缩。收集纯化的生物合成肝素用于进一步的二糖组成分析、分子量分析和体外抗凝血活性测定，如实施例3中所示。如果抗凝血活性未达到USP规格，则可重复该步骤。
实施例9：合成活性和分子量性质符合猪USP肝素的两种生物合成肝素(BSH)和不符合猪USP肝素的活性和分子量规格的两种生物合成肝素(BSH)的精确方法。
生物合成肝素批次h的产生
在实施例6中描述的条件下，用2OST和C5-epi处理总共40mg NS(85.4％NS含量)。在MES反应缓冲液(50mM，pH 7.2)中的反应条件如下：1mg/mL NS、0.25mg/mL C5epi、0.5mg/mL 2OST和1.45mM PAPS。将反应在滚轴(roller)上于37℃下培养24小时。从溶液中取出酶珠，并用3倍柱体积(CV)的50mM MES缓冲液(pH7.2)洗涤以回收多糖。将反应溶液和3CV洗涤缓冲液合并，并加载到5kDa MWCO膜旋转柱上，用于浓缩和除去后反应化合物。如实施例3中所述，收集保留物并取样用于二糖分析。所得的NS2S中间体的二糖组成如表3所示。
表3.生物合成肝素批次h的二糖组成历史和抗凝血活性的总结。
Figure BDA0002043374040000431
在第二个酶促步骤中，用固定化的6OST-1和6OST-3处理3mg具有60％NS2S含量的所得NS2S中间体以产生NS2S6S中间体。固定化方法如实施例5中所述。硫酸化反应条件与实施例7中所述的相同。反应完成后，如上所述回收、纯化和分析多糖用于NS2S产生。第1次6OST处理后该NS2S6S中间体的二糖组成如表3所示。为了使TriS％增加至40％以上。使用相同的方法再次重复6OST处理。在第二次处理后得到的NS2S6S中间体获得43.5％的NS2S6S二糖和10.5％的NS6S二糖。
用固定化的3OST-1进一步处理第二次6OST处理(85.4-60.0-43.5)后的该NS2S6S中间体以产生生物合成肝素批次h。如实施例5中所描述的进行3OST-1固定化。生物合成肝素批次h的硫酸化反应条件和纯化方法与实施例8中所描述的相同，然后如实施例3中所述进行分子量、二糖测定和体外活性测定。在第1次3OST-1处理后，生物合成肝素批次h仅达到160U/mg的抗IIa活性，其低于猪USP肝素180U/mg规格(表3)。因此，用3OST-1再次处理中间体，然后使用如上所描述的相同纯化和分析。第2次3OST-1处理后的生物合成肝素批次h的抗IIa为396U/mg、抗Xa为365U/mg、抗Xa/抗IIa为0.92、重量平均分子量为17,500Da、Mw高于24,000的馏分的百分比为16.8、Mw为8,000至16,000的馏分与Mw为16,000至24,000的馏分之间各自的比例为1.3。生物合成肝素批次h的抗凝血活性和分子量性质均在猪USP肝素规格内。
生物合成肝素批次w的产生
在实施例6中描述的条件下，用2OST和C5epi处理总共25mg NS(92.7％NS含量)。简而言之，反应条件如下：在50mM MES缓冲液(pH 7.2)中，1mg/mL(2.23mM)NS、0.25mg/mL C5-epi、0.5mg/mL 2OST、0.5mg/mL AST-IV、10mM PNPS和1.61mM PAPS。将反应在滚轴上于37℃下培养24小时。从溶液中取出酶珠，并使用50mM MES缓冲液(pH 7.2)用3倍柱体积(CV)洗涤以回收所有多糖。将反应溶液和3CV洗涤缓冲液合并，并载入5kDa MWCO膜旋转柱中，用于浓缩和除去后反应化合物。如实施例3中所述，收集保留物并取样用于二糖分析。所得的NS2S中间体的二糖组成如表4所示。在第一次2OST/C5-epi处理后该底物仅达到68.2％的NS2S％。因此，使用相同的方法重复2OST-1/C5反应两次以将NS2S％增加至75％(表4)。
用固定化的6OST-1和6OST-3进一步处理总共3mg有75.4％NS2S二糖基团的所得的NS2S中间体以产生NS2S6S中间体。固定方法如实施例5中所述。硫化反应条件与有PAPS再循环系统的实施例7中所述的相同。反应完成后，如上所述回收、纯化和分析多糖用于NS2S产生步骤。该NS2S6S中间体在6OST-1&3处理后的二糖组成如表4所示，并且含有54.5％的NS2S6S(TriS)二糖和14.3％的NS6S二糖。
用固定化的3OST-1进一步处理该NS2S6S中间体以产生生物合成肝素批次w。3OST-1固定化如实施例5中所述。生物合成肝素批次w的硫酸化反应条件和纯化方法与有PAPS再循环的实施例8相同，然后如实施例3中所述进行分子量、二糖测定和体外活性测定。3OST-1处理后的生物合成肝素批次w达到抗IIa活性为343U/mg、抗Xa为393U/mg、抗Xa/抗IIa为1.10、重量平均分子量为15,500Da、分子量高于24,000的馏分的百分比为6.6、Mw为8,000至16,000的馏分与Mw为16,000至24,000的馏分之间的比例为1.7。生物合成肝素批次w的抗凝血活性和Mw均在猪USP肝素规格内。
表4.生物合成肝素批次w的二糖组成历史和抗凝血活性的总结。
Figure BDA0002043374040000441
Figure BDA0002043374040000451
在生物合成肝素批次的一些情况下，分别对第二和第三中间体的单一酶处理符合猪USP肝素规格。
不符合猪USP肝素活性和分子量规格的生物合成肝素批次1的产生
在实施例6中所述的条件下，用2OST-1和C5-epi处理总共140mg NS(92.7％NS含量)。简而言之，反应条件如下：在50mM MES缓冲液(pH 7.2)中，1mg/mL(2.23mM)NS、0.25mg/mL C5epi、0.5mg/mL 2OST、以及2mM PAPS。将反应在滚轴上于37℃下培养24小时。从溶液中取出酶珠，并使用50mM MES缓冲液(pH 7.2)用3倍柱体积(CV)洗涤以回收所有底物。将反应溶液和3CV洗涤缓冲液合并，并载入5kDa MWCO膜旋转柱中，用于浓缩和除去后反应化合物。如实施例3中所述，收集保留物并取样用于二糖分析。根据二糖分析，第二中间体NS2S达到72.4％的NS2S二糖(表5)。
用固定化的6OST-1和6OST-3进一步处理总共10mg得到的具有72.4％NS2S二糖含量的NS2S中间体以产生NS2S6S中间体。固定化方法如实施例5中所述。硫酸化反应条件与实施例7中所述相同。反应完成后，在NS2S硫酸化步骤中如上所述回收、纯化和分析多糖。在6OST-1&3处理后该NS2S6S中间体的二糖组成如表5所示并且由41.0％的NS2S6S(TriS)二糖和3.7％的NS6S二糖组成。
用固定化的3OST-1进一步处理该NS2S6S中间体。3OST-1固定化如实施例5中所述。硫酸化反应条件和纯化方法与实施例8中相同，然后如实施例3中所述进行重量平均分子量、二糖组成和体外活性测定。该批次3OST-1处理后仅达到112U/mg的抗IIa活性、93U/mg的抗Xa和0.80的抗Xa/抗IIa。为了增加抗IIa活性以满足USP规格，使用与实施例8中所述的相同的方法再次用固定化的3OST-1处理该非等效批次1。然而，抗IIa活性仍然保持低(114U/mg)，未达到按照猪USP肝素规格所需的180U/mg。
表5.生物合成肝素批次1的二糖组成历史和抗凝血活性的总结。
Figure BDA0002043374040000461
不符合猪USP肝素活性和分子量规格的生物合成肝素批次2的产生
在实施例6中所述的条件下，用2OST和C5-epi处理总共40mg NS(92.7％NS含量)。简而言之，反应条件如下：在50mM MES缓冲液(pH 7.2)中，1mg/mL(2.23mM)NS、0.25mg/mLC5epi、0.5mg/mL 2OST和2mM PAPS。将反应在滚轴上于37℃下培养24小时。从溶液中取出酶珠，并使用50mM MES缓冲液(pH 7.2)用3倍柱体积(CV)洗涤以回收所有多糖。将反应溶液和3CV洗涤缓冲液合并，并载入5kDa MWCO膜旋转柱中，用于浓缩和除去后反应化合物。如实施例3中所述，收集保留物并取样用于二糖分析。根据二糖分析，第二中间体NS2S达到81.4％的NS2S二糖(表6)。
用固定化的6OST-1和6OST-3进一步处理总共3mg得到的具有81.4％NS2S二糖含量的NS2S中间体以产生NS2S6S中间体。固定化方法如实施例5中所述。硫酸化反应条件与实施例7中所述的相同。反应完成后，在NS2S硫酸化步骤中如上所述回收、纯化和分析多糖。在6OST-1&3处理后该NS2S6S中间体的二糖组成如表6中所示，由61.0％的NS2S6S(TriS)二糖和2.5％的NS6S二糖组成。
用固定化的3OST-1进一步处理该NS2S6S中间体。3OST-1固定化如实施例5中所述。硫酸化反应条件和纯化方法与实施例8中相同，然后是实施例3中所述进行重量平均分子量、二糖含量和体外活性测定。该批次在3OST-1处理后仅达到49U/mg的抗IIa活性，远远低于USP规格的180U/mg。该非等效批次2证明与猪USP肝素不等效。
表6.生物合成肝素批次2的二糖组成历史和抗凝血活性的总结。
Figure BDA0002043374040000471
通过三种中间体生成生物合成肝素
概观
下面描述的是多个批次的生物合成肝素，其满足USP对生物活性以及当测量时的分子量的要求。生物合成肝素还显示出与猪USP肝素等效的二糖含量。这些实验与高效液相色谱和核磁共振光谱串联进行以定量确定硫酸化的程度和性质。
生物合成肝素的生成，要求在该过程的每个步骤中产生的中间体由特定的二糖含量组成。以下描述的具体信息是：(a)第一中间体NS的NS二糖基团含量(以总二糖组成的％表示的所有含量)；(b)第二中间体NS2S的NS2S和NS二糖基团含量；以及(c)生物等效肝素的合成中第三中间体NS2S6S/TriS的NS2S6S、NS6S、NS2S和NS二糖基团含量。第一中间体NS具有合适的重量平均分子量(Mw)和分子量分布来提供适当分子量的第二和第三中间体以提供USP规格内的生物合成肝素。
符合猪USP肝素规格的批次的概述
a、b、c和d的批次在美国临时申请62/384,341中公开。本节表中的二糖数据为mol％。所示的mol％值可以表示为w/w％，如美国临时申请62/384,341中所示。
Figure BDA0002043374040000472
Figure BDA0002043374040000481
Figure BDA0002043374040000491
Figure BDA0002043374040000501
Figure BDA0002043374040000511
Figure BDA0002043374040000521
Figure BDA0002043374040000531
Figure BDA0002043374040000541
Figure BDA0002043374040000551
概要信息
表7.第一中间体NS中NS％的概要
Figure BDA0002043374040000552
Figure BDA0002043374040000561
表8.第二中间体NS2S中NS、NS2S％的概要
Figure BDA0002043374040000562
Figure BDA0002043374040000571
表9.第三中间体NS2S6S中NS、NS2S、NS6S、TriS％的概要
Figure BDA0002043374040000572
Figure BDA0002043374040000581
表10.生物合成肝素的反应规模和体积的概要
Figure BDA0002043374040000582
总之，使用具有上述特定的NS基团含量、Mw和分子量分布的第一中间体NS以成功获得特定的第二和第三中间体，并最终提供可满足USP肝素标准的BSH可能是重要的。
表11.BSH批次a、b、c和d以w/w％表示的二糖数据。这些批次在美国临时申请62/384,341中公开，并且也是BEqH。
Figure BDA0002043374040000591
Figure BDA0002043374040000601
普通技术人员将理解二糖数据可以以mol％(如本文所使用的)或重量％(如临时申请中所使用的)表示。
出现在美国临时申请62/384,341中并且不符合猪USP肝素活性和分子量规格的生物合成肝素批次
临时申请包括两批不符合猪USP肝素活性和分子量规格的批次。下表12和13总结了数据。二糖值以w/w％和mol％表示。
表12.
Figure BDA0002043374040000602
#由1H-NMR测量，*由LC-MS测量
Figure BDA0002043374040000603
Figure BDA0002043374040000611
#由1H-NMR测量
表13.分子量的概要
Figure BDA0002043374040000612
***
尽管前面提到了特别优选的实施方案，但应该理解的是本发明不局限于此。对于本领域普通技术人员来说，可以对所公开的实施方案进行各种修改，并且这些修改旨在落入本发明的范围内。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利均通过引用整体并入本文。

Claims (31)

1.一种糖胺聚糖，其包含78-99％的N-硫酸化(NS)二糖基团，并且其重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
2.根据权利要求1所述的糖胺聚糖，其包含81-97％的N-硫酸化(NS)二糖基团。
3.根据权利要求1所述的糖胺聚糖，其包含83-95％的N-硫酸化(NS)二糖基团。
4.根据权利要求1所述的糖胺聚糖，其包含85-93％的N-硫酸化(NS)二糖基团。
5.一种糖胺聚糖，其包含44-80％的N-硫酸化、2-硫酸化(NS2S)二糖基团和13-39％的NS基团，并且其重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
6.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含50-78％的NS2S基团。
7.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含55-77％的NS2S基团。
8.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含60-76％的NS2S基团。
9.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含14-35％的NS基团。
10.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含15-30％的NS基团。
11.根据权利要求5所述的糖胺聚糖，其包含16-26％的NS基团。
12.一种糖胺聚糖，其包含36-70％的N-硫酸化、2-硫酸化、6-硫酸化(NS2S6S)二糖基团，6-32％的NS6S二糖基团，0-27％的NS2S基团和1-22％的NS基团，并且其重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
13.根据权利要求12所述的糖胺聚糖，其包含40-67％的NS2S6S二糖基团和6-26％的NS6S二糖基团。
14.根据权利要求12所述的糖胺聚糖，其包含43-64％的NS2S6S二糖基团和6-22％的NS6S二糖基团。
15.根据权利要求12所述的糖胺聚糖，其包含12-27％的NS2S基团和1-17％的NS基团。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的糖胺聚糖，其不含3S二糖基团。
17.一种产生生物合成肝素的方法，其包括：
a.获得糖胺聚糖，其包含36-70％的NS2S6S二糖基团、6-32％的NS6S二糖基团、0-27％的NS2S基团和1-22％的NS基团；
b.在硫酸盐供体的存在下，用酶处理所述糖胺聚糖，所述酶是3-O-磺基转移酶同种型1
(3OST-1)，
以产生生物合成肝素批次，
其中所述糖胺聚糖的重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤(b)中将足够的葡糖胺残基转化为3-O-磺基葡糖胺残基，使得所产生的批次的抗Xa和抗IIa活性为不低于180单位/mg，并且抗Xa/抗IIa比率为0.85-1.15。
19.根据权利要求18所述的方法，其中抗Xa/抗IIa比率为0.9-1.1。
20.一种制备第二糖胺聚糖中间体的方法，所述第二糖胺聚糖中间体包含44-80％的NS2S基团和13-39％的NS基团；所述方法包括：
a.将肝素前体中一定量的N-乙酰基葡糖胺残基进行转化以产生包含78-99％的N-硫酸化(NS)二糖基团的第一糖胺聚糖中间体，其中被转化的N-乙酰基葡糖胺残基的量对应于所述第一糖胺聚糖中间体中NS基团的量；以及
b.在硫酸盐供体的存在下，用酶处理所述第一糖胺聚糖中间体，所述酶是C5-差向异构酶(C5-epi)和2-O-磺基转移酶(2OST)，
以产生所述第二糖胺聚糖中间体，
其中所述糖胺聚糖的重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述转化包括使肝素前体与碱和磺化试剂反应。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述转化包括使肝素前体与N-脱乙酰基酶、N-磺基转移酶(NDST)反应。
23.一种制备第三糖胺聚糖中间体的方法，所述第三糖胺聚糖中间体包含36-70％的NS2S6S二糖基团、6-32％的NS6S二糖基团、0-27％的NS2S基团和1-22％的NS基团：
所述方法包括
在硫酸盐供体的存在下，用酶处理含有44-80％的NS2S基团和13-39％的NS基团的第二糖胺聚糖中间体，以将所述第二糖胺聚糖中间体转化为所述第三糖胺聚糖中间体，所述酶是6-O-磺基转移酶同种型1和/或3，
其中所述糖胺聚糖的重量平均分子量适于形成15,000-19,000Da的最终肝素产物，该最终肝素产物的分子量大于24,000Da的肝素链的百分比不大于总数的20％，并且分子量为8,000至16,000Da的链与分子量为16,000至24,000Da的链的百分比的比例不小于1.0。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述硫酸盐供体包括PAPS。
25.根据权利要求24所述的方法，其中PAPS处于溶液中。
26.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述硫酸盐供体包括PAP和PNPS。
27.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述处理在包含PAPS、PNPS和催化剂的再循环系统的存在下进行。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述催化剂是芳基磺基转移酶IV(AST-IV)。
29.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述酶处于溶液中。
30.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述酶是固定化的。
31.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述处理在含有编码NDST、C5-Epi、2OST、3OST-1、6OST-1或6OST-3中的一种或两种的基因的工程微生物菌株以及PAPS中进行。
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