ITMI20000665A1 - Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevata attivita' anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro preparazio - Google Patents
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Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride K5 aventi elevata attività anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro preparazione
Tecnica nota
I glicosaminoglicani sono biopolimeri estratti industrialmente da diversi organi animali come la mucosa intestinale, polmone ecc.
In base alla loro struttura, i glicosaminoglicani sono divisi in eparina, eparan solfato, dermatan solfato, condroitin solfato e acido jaluronico. In particolare l'eparina e l'eparan solfato sono composti da unità disaccaridiche ripetitive formate da un acido uronico (L-iduronico o D-glucuronico) e da un aminozucchero (glucosammina).
L’acido uronico può essere solfatato in posizione 2 e la glucosammina può essere per la maggior parte N-acetilata (eparan solfato) o N-solfatata (eparina) e 6-O-solfatata. Inoltre la glucosammina può contenere anche un gruppo solfato in posizione 3.
Eparina ed eparan solfato sono molecole polidisperse con un peso molecolare che varia da 3.000 a 30.000 D.
Oltre alla nota attività anticoagulante e antitrombotica, all'eparina viene riconosciuta anche un'attività antilipemica, a ntiprol iterativa, antivirale, antitumorale e antiangiogenetica. Per soddisfare la maggior richiesta di materia prima per queste nuove aree terapeutiche è necessaria una nuova via produttiva alternativa all’estrazione da tessuti animali. La biosintesi naturale dell’eparina nei mammiferi e le sue proprietà sono state descritte da Lindahl et al., 1986 in Lane D. and Lindahl U. (Eds.) "Heparin-Chemical and Biological Properties; Clinical Applications”, Edward Arnold, London, pp. 159-190 and Lindahl U. Feingold D.S. and Rodén L, (1986) TIBS, 11,221-225.
Fondamentale per l’attività dell’eparina è la sequenza costituita dalla regione pentasaccaridica di legame per l’antitrombina III (ATIIl), chiamata pentasaccaride attivo, che è la struttura necessaria per il legame ad alta affinità dell’eparina per TATUI. Questa sequenza contiene un’unica unità di glucosammina solfatata in posizione 3, che non è presente nelle altre parti della catena eparinica. Oltre all’attività attraverso TATUI, l'eparina esercita l'attività anticoagulante e antitrombotica attivando il cofattore eparinico II (HCII) con una conseguente inibizione selettiva della trombina. E’ noto che la sequenza saccaridica minima richiesta per attivare THCII è una catena contenente almeno 24 monosaccaridi (Tollefsen D.M. Seminare in Thrombosis and Hemostasis 16,66-70 (1990)).
Da lavori precedenti è noto che il polisaccaride capsulare K5 isolato dal ceppo di Escherichia Coli descritto da Vann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. (1981) in Eur. J. Biochem 116, 359-364 mostra la stessa sequenza del precursore dell’eparina e dell’eparan solfato (N-acetil epa rosa no). Questo composto è stato chimicamente modificato come descritto da Lormeau et al. nel brevetto US n. 5,550,116 e da Casu et al (Carb. Res 263-1994-271-284) o chimicamente e enzimaticamente come descritto da Jann et al. (WO 92/17509) e da Casu et al. Carb. Lettere 1, 107-114 (1994). Queste modificazioni portano a prodotti con attività biologiche nei test in vitro sulla coagulazione che non sono però al livello dell’eparina da estrazione da organi animali.
Sommario
Noi abbiamo trovato nuovi glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride K5 da Escherichia coli, aventi peso molecolare da 2.000 a 30.000, contenenti da 25 a 50% in peso delle catene ad alta affinità per ΓΑΤΙΙΙ ed aventi un’elevata attività anticoagulante ed antitrombotica che espressa come rapporto tra le attività HCII/antiXa, è compresa fra 1,5 e 4, con una prevalenza delle attività che implicano l'inibizione della trombina.
Detti glicosaminoglicani sono preparati mediante un processo comprendente vari stadi di trattamento chimico ed enzimatico ed è caratterizzato da uno stadio di epimerizzazione dell’acido D-glucuronico ad acido L-iduronico mediante impiego dell'enzima glucuronosil C-5 epimerasi in soluzione o in forma immobilizzata in presenza di cationi bivalenti specifici, detto enzima essendo scelto dal gruppo comprendente glucuronosil C-5 epimerasi ricombinante, glucuronosil C-5 epimerasi da mastocitoma murino e glucuronosil C-5 epimerasi da estrazione da fegato bovino e detti cationi bivalenti essendo scelti dal gruppo comprendente Ba, Ca, Mg e Mn.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce a glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride K5 da Escherichia coli (in seguito denominato anche semplicemente K5), ottenuti mediante un processo che comprende i seguenti stadi:
a) Preparazione del polisaccaride K5 da Escherichia coli
b) N-deacetilazione/N-solfatazione
c) C-5 epimerizzazione
d) Supersolfatazione
e) O-desolfatazione selettiva
f) 6-O-solfatazione selettiva (opzionale)
g) N-solfatazione
I vari stadi del processo vengono descritti in dettaglio come segue, a) Preparazione dei polisaccaride K5 da Escherichia coli
Viene dapprima eseguita una fermentazione in beuta secondo il brevetto MI99A001465 e utilizzando il seguente medium:
Farina di soia degrassata 2 gr/l
K2HP04 9,7 gr/l
KH2PO4 2 gr/l
MgCI2 0,11 gr/l
Sodio citrato 0,5 gr/l
Ammonio solfato 1 gr/l
Glucosio 2 gr/l
Acqua di fonte 1000 mi
pH = 7,3
Il medium viene sterilizzato a 120°C per 20 minuti.
Il glucosio viene preparato separatamente in forma di soluzione che viene sterilizzata a 120°C per 30 minuti e addizionata sterilmente al medium.
La beuta viene inoculata con una sospensione di cellule di E. coli Bi 8337/41 (010:K5:H4) proveniente da uno slant tenuto in Triptic soy agar, e incubata a 37°C per 24 ore sotto agitazione controllata (160 rpm, 6 cm di corsa). La crescita batterica si misura contando le cellule con il microscopio.
In un'operazione successiva, un fermentatore Chemap-Braun da 14 I contenente lo stesso medium di cui sopra, viene inoculato allo 0,1% con la coltura della beuta di cui sopra e si effettua la fermentazione mediante aerazione di 1 wm, (vvm = volume di aria per volume di liquido per minuto) agitazione 400 rpm e temperatura di 37°C per 18 ore. Durante la fermentazione vengono misurati il pH, l’ossigeno, il glucosio residuo, il polisaccaride K5 prodotto e la crescita batterica.
Alla fine della fermentazione la temperatura viene portata a 80°C per 10 minuti. Le cellule vengono separate dal medium tramite centrifugazione a 10.000 rpm e il surnatante viene ultrafiltrato usando un modulo SS 316 (MST) equipaggiato con membrane PES con cut-off nominale di 800 e 10.000 D per ridurre il volume a 1/5. Il polisaccaride K5 viene quindi precipitato mediante addizione di 4 volumi di acetone a 4°C e lasciato a sedimentare per una notte a 4°C, e infine viene recuperato mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 20 minuti o filtrazione.
Si esegue poi la deproteinizzazione del solido ottenuto utilizzando una proteasi tipo II da Aspergillus Orizae in tampone di NaCl 0,1 M e EDTA 0,15 M a pH 8 contenente SDS allo 0,5% (10 mg/l di filtrato) a 37°C per 90 minuti.
La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su modulo SS 316 con membrane a cut-off nominale di 10.000 D con 2 estrazioni con NaCl 1M e lavata con acqua fino a scomparsa dell’assorbanza nell’ultrafiltrato. Il polisaccaride K5 viene quindi precipitato con acetone e si ottiene una resa di 850 mg per litro di fermentatore. La purezza del polisaccaride ottenuto viene misurata tramite la determinazione degli acidi uranici (metodo al carbazolo), NMR al protone e al carbonio 13, UV e contenuto di proteine. La purezza risulta maggiore dell' 80%.
Il polisaccaride ottenuto è composto da due frazioni a diverso peso molecolare medio, rispettivamente 30.000 e 5.000 D come risulta dalla determinazione mediante HPLC con due colonne in serie di Bio-sil SEC 250 (Bio Rad) e Na2S04 come fase mobile a temperatura ambiente e flusso di 0,5 ml/minuti. La misura viene effettuata contro una curva standard ottenuta con frazioni di eparina a peso molecolare noto.
Ad una soluzione acquosa all’1% del polisaccaride K5 purificato viene aggiunto Triton X-100 fino ad ottenere una soluzione al 5%. Si lascia per 2 ore a 55°C sotto agitazione. Si aumenta la temperatura a 75°C e durante il raffreddamento successivo a temperatura ambiente si formano due fasi.
Sulla fase superiore (fase organica) viene ripetuto il trattamento termico con formazione delle due fasi, per altre due volte. La fase acquosa contenente il polisaccaride viene infine concentrata sotto pressione ridotta e precipitata con acetone o etanolo. La fase organica viene scartata. La purezza del campione viene controllata tramite NMR al protone e risulta di 95%.
La resa di questo trattamento risulta del 90%.
b) N-deacetilazione/N-solfatazione
10 g. di polisaccaride K5 purificato vengono solubilizzati in 100-2000 mi di sodio idrossido 2N e lasciati reagire a 40-80eC per il tempo necessario per la completa deacetilazione, che non è mai superiore a 30 ore. La soluzione si porta a temperatura ambiente ed a pH neutro con acido cloridrico 6N.
La soluzione contenente il K5 deacetilato viene mantenuta a 20-65°C e addizionata con 10-40 g di sodio carbonato con singola aggiunta e con 10-40 g di un agente solfatante selezionato tra i reagenti disponibili come l'addotto piridina-solfotriossido, trimetilammina-solfotriossido ecc. . L’aggiunta dell’agente solfatante viene effettuata in tempo variabile fino a 12 ore. Alla fine della reazione, se necessario, la soluzione viene portata a temperatura ambiente, quindi a pH 7,5-8 con una soluzione al 5% di acido cloridrico.
11 prodotto viene purificato dai sali con tecniche note come ad esempio tramite diafiltrazione usando una membrana a spirale da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore). Il processo viene terminato quando la conducibilità del permeato è inferiore a 1000 pS, preferibilmente inferiore a 100 pS. Il prodotto trattenuto viene ridotto di volume fino ad ottenere una concentrazione del polisaccaride del 10% usando lo stesso sistema filtrante in concentrazione. La soluzione concentrata, se necessario, si essicca con metodologie comuni.
Il rapporto N-solfato/N-acetile risulta essere da 10/0 a 7/3 misurato tramite NMR al carbonio 13.
c) C-5 epimerizzazione:
Lo stadio di C-5 epimerizzazione secondo la presente invenzione può essere condotto con enzima glucuronil C-5 epimerasi (denominato anche semplicemente C-5 epimerasi) in soluzione o in forma immobilizzata.
- C-5 epimerizzazione con enzima in soluzione.
Da 1,2 x 10<7 >a 1,2 x 10<11 >cpm (counts per minute) di enzima C-5 epimerasi naturale o ricombinante, calcolati seguendo il metodo descritto da Campbell P. et al Analytical Biochemistry 131, 146-152 (1983), vengono sciolti in 2-2000 mi di tampone Hepes 25 mM ad un pH da 5,5 a 7,4, contenente 0,001-10 g di K5 N-deacetilato N-solfato, ed uno o più degli ioni scelti tra bario, calcio, magnesio, manganese a concentrazione tra 10 e 60 mM. La reazione viene condotta ad una temperatura tra 30 e 40°C, preferibilmente 37“C, per 1-24 ore. Al termine della reazione l'enzima viene inattivato a 100°C per 10 minuti.
Il prodotto viene purificato mediante passaggio su resina DEAE o cartuccia DEAE Sartobind e staccato con NaCI 2M e infine desalato su resina Sephadex G-10 oppure viene purificato mediante precipitazione con 2 volumi di etanolo e passaggio su resina IR 120 H<+ >per ritrasformarlo in sale sodico.
Si ottiene un prodotto con rapporto acido iduronico/acido glucuronico compreso fra 40:60 e 60:40 calcolato con <1>H-NMR come già descritto nel brevetto W096/14425.
- C-5 eplmerizzazione con enzima immobilizzato
L’enzima C-5 epimerasi, naturale o ricombinante, può essere immobilizzato su vari supporti inerti che possono essere resine o membrane o palline di vetro derivatizzate con gruppi funzionali reattivi utilizzando le più comuni tecniche di legame per gli enzimi ad esempio con bromuro di cianogeno, con glutaraldeide, con carbodiimmide oppure facendo reagire l’enzima con una resina a scambio ionico o facendolo adsorbire su una membrana. Secondo la presente invenzione, le reazioni di attacco dell'enzima ai supporto inerte vengono effettuate in presenza del substrato K5 N-deacetilato N-solfato per evitare che il legame avvenga attraverso il sito attivo dell’enzima con conseguente perdita di attività.
La misurazione dell’attività dell’enzima immobilizzato, viene effettuata facendo ricircolare attraverso una colonna contenente l’enzima immobilizzato la quantità di K5 N-deacetilato N-solfato teoricamente convertibile dai cpm di enzima immobilizzato, disciolto in tampone Mepes 25 mM, KCI 0,1 M, Triton X100 0,01% ed EDTA 0,15 M a pH 7,4 a 37°C per una notte con flusso di 0,5 ml/minuto. Dopo la purificazione mediante sistema cromatografico DEAE e desalazione su Sephadex G-10 il prodotto viene liofilizzato e analizzato per il contenuto di acido iduronico tramite tecnica NMR al protone.
Il rapporto acido iduronico/acido glucuronico deve essere intorno a 30:70.
20-1000 mi di una soluzione di Hepes 25mM e pH tra 6 e 7,4 contenente uno o più ioni scelti fra bario, calcio, magnesio, manganese in concentrazione compresa tra 10 e 60 mM e 0,001-10 g di K5 N-deacetilato N-solfato, termostata alla temperatura fra 30 e 40<e>C, vengono trattati a ricircolo ad un flusso di 30-160 ml/ora per un tempo compreso fra 1 e 24 ore in una colonna contenente da 1,2 x 10<7 >a 3 x 10<11 >cpm equivalenti dell'enzima immobilizzato sul supporto inerte termostatato a temperatura compresa fra 30 e 40°C. Alla fine della reazione il campione viene purificato con le stesse procedure indicate nella epimerizzazione in soluzione.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto fra acido iduronico e acido glucuronico compreso tra 40:60 e 60:40.
d) Supersolfatazione
La soluzione contenente il prodotto epimerizzato dello stadio c) a concentrazione del 10% viene raffreddata a 10°C e quindi passata attraverso resina a scambio cationico IR-120 H<+ >o equivalente (35-100 mi). Sia la colonna che il contenitore dell’eluato sono mantenuti a 10°C. Dopo il passaggio della soluzione la resina viene lavata con acqua deionizzata fino a che il pH del permeato è maggiore di 6 (circa 3 volumi di acqua deionizzata). La soluzione acida viene portata a neutralità con una ammina terziaria o quaternaria come ad esempio il tetrabutilammonio idrossido (soluzione acquosa al 15%) ottenendo il relativo sale di ammonio. La soluzione viene concentrata a volume minimo e liofilizzata. Il prodotto ottenuto viene sospeso in 20-500 mi di DMF o DMSO e addizionato con 15-300 g di un agente solfatante come l’addotto piridina -SO3 in forma solida oppure in soluzione di DMF 0 DMSO. La soluzione viene mantenuta a 20-70<e>C, preferibilmente tra 40-60 °C per 2-24 ore.
Alla fine della reazione la soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente e addizionata con acetone saturato con sodio cloruro fino a completa precipitazione.
Il precipitato viene separato dal solvente tramite filtrazione, solubilizzato con la minima quantità di acqua deionizzata (ad esempio 100ml) e addizionato con sodio cloruro fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione viene portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2 N e addizionata con acetone fino a completa precipitazione. Il precipitato viene separato dal solvente tramite filtrazione. Il solido ottenuto viene solubilizzato con 100 mi di acqua deionizzata e purificato dai sali residui tramite ultrafiltrazione come descritto nello stadio b).
Un'aliquota viene liofilizzata per l’analisi strutturale del prodotto supersolfatato tramite <13>C-NMR.
Il prodotto ottenuto risulta avere un contenuto di solfati per disaccaride di 2, 0-3, 5 calcolato secondo Casu et al. Carbohyd. Res. Voi. 39 pp 168-176 (1975). La posizione 6 deil’amminozucchero è solfatata all’80÷95% e la posizione 2 è completamente non solfatata. Gli altri gruppi solfato sono presenti nella posizione 3 deH’amminozucchero e 2 e 3 dell’acido uranico.
e) O-desolfatazione selettiva
La soluzione contenente il prodotto ottenuto dallo stadio d) viene passata attraverso resina a scambio cationico IR-120 H<+ >o equivalente (35-100 mi). Dopo il passaggio della soluzione la resina viene lavata con acqua deionizzata fino a che il pH del permeato è maggiore di 6 (circa 3 volumi di acqua deionizzata). La soluzione acida viene portata a neutralità mediante aggiunta di piridina. La soluzione viene concentrata a volume minimo e liofilizzata. Il prodotto ottenuto viene trattato con 20-2000 mi di una soluzione di DMSO/metanolo (9/1 V/V) e la soluzione ottenuta viene mantenuta a 45-90°C per 1-8 ore. Al termine la soluzione viene addizionata con 10-200 mi di acqua deionizzata e poi viene trattata con acetone saturo di sodio cloruro in quantità tale da completare la precipitazione.
Con la O-desolfatazione selettiva vengono eliminati dapprima i gruppi solfato dalla posizione 6 deH’amminozucchero, poi quelli delle posizioni 3 e 2 dell'acido uranico ed infine quello della posizione 3 dell'amminozucchero.
Il solido ottenuto viene purificato mediante diafiltrazione come descritto nello stadio b).
Un'aliquota viene liofilizzata per l’analisi strutturale tramite <13>C-NMR. Qualora l'analisi NMR riveli un contenuto di solfati in posizione 6 deH'amminozucchero superiore al 60%, calcolato come descritto da Casu et al Arzneimittel-forschiung Drag research 33-1, 135-142 (1983) si procede direttamente allo stadio g). Altrimenti si prosegue con lo stadio seguente.
f) 6-O-solfatazione selettiva (opzionale)
La soluzione contenente il prodotto dello stadio e) viene trattata come descritto nello stadio d) per l’ottenimento del sale di ammonio terziario o quaternario, operando però a 20-25°C.
Il sale di ammonio viene sospeso in 20-500 mi di DMF. La sospensione viene raffreddata a 0°C e trattata con una quantità di un agente solfatante come l'addotto piridina-S03 calcolata in funzione della percentuale di solfato in posizione 6 deH’amminozucchero da ripristinare considerando un minimo di 6-O-solfato del 60% calcolato come descritto sopra. Tale quantità di agente solfatante è compresa tra i due e i dieci equivalenti rispetto alle funzioni idrossile da solfatare. L’agente solfatante viene addizionato tramite singola aggiunta oppure con aggiunte successive in un tempo totale massimo di 20 minuti.
L’agente solfatante può essere in polvere ovvero disciolto in piccola quantità di DMF.
La soluzione si mantiene a 0-5°C per 0,5-3 ore. La soluzione viene quindi trattata con acetone saturo di sodio cloruro in quantità tali da completare la precipitazione.
Il solido ottenuto viene purificato tramite diafiltrazione come descritto nello stadio b).
Un’aliquota viene liofilizzata per l’analisi strutturale tramite <13>C-NMR. Qualora il contenuto di 6-O-solfato sia inferiore al 60% misurato con tecnica NMR, lo stadio f) viene ripetuto,
g) N-solfatazione
La soluzione proveniente dallo stadio f) o, eventualmente, dallo stadio e) viene trattata come descritto nello stadio b) per l'N-solfatazione.
I glicosaminoglicani ottenuti mediante il processo dell’invenzione vengono caratterizzati tramite NMR al protone e al carbonio 13 e mediante test biologici come l'antiXa, ΓΑΡΤΤ, l’HCII, Anti Ila e affinità per AH II.
Il prodotto ottenuto può essere sottoposto a frazionamento tramite tecnica cromatografica su colonna oppure ultrafiltrazione ottenendo frazioni a basso peso molecolare da 2000 a 8000 D e ad alto peso· molecolare da 25.000 a 30.000 D oppure il prodotto può essere sottoposto a depolimerizzazione controllata tramite tecniche note come ad esempio la deaminazione con acido nitroso come descritto in WO8203627.
Le caratteristiche tipiche riguardanti l'attività biologica di glicosaminoglicani ottenuti mediante il processo dell’invenzione (IN-2018 UF ed IN-2018 LMW) sono riportate nella tabella 1, in confronto con Eparina UF (4<th >int. Standard) ed Eparina LMW (1<st >int. Standard).
Tabella 1
RIFERIMENTI
1. Thomas D.P. et al Thrombosis and Haemostasis 45, 214-(1981 ) contro il IV standard intemazionale di eparina
2. Andersson et al. Thrombosis Res. 9, 575 (1976) contro il IV standard internazionale di eparina.
3. Il test viene eseguito miscelando 20 μΙ di una soluzione di HCIi (Stago) 0,05 PEU/ml sciolto in acqua con 80 μΙ di una soluzione del campione in esame a diverse concentrazioni e 50 μΙ di trombina (0,18 U/ml- Boehringer) in tampone tris 0,02 M, pH 7,4, contenente NaCI 0,15 M e PEG-6000 0,1%. La soluzione viene incubata per 60 sec. a 37°C, quindi vengono aggiunti 50 μΙ di substrato cromogenico Spectrozyme (American Diagnostic) 1 mM. La reazione viene registrata in continuo per 180 sec. con letture ogni secondo a 405 nm utilizzando un coagulometro automatico ACL-7000 (IL).
4. Il test viene eseguito miscelando 30 μΙ di una soluzione di ATIII (Chromogenix) 0,5 U/ml sciolta in tampone tris 0,1 M, pH 7,4, con 30 μΐ di una soluzione del campione in esame a diverse concentrazioni e 60 μΙ di trombina (5,3 nKat/ml- Chromogenix) in tampone tris 0,1 M pH 7,4. La soluzione viene incubata per 70 sec. a 37°C, quindi vengono aggiunti 60 μΙ di substrato cromogenico S-2238 (Chromogenix) 0,5 mM in acqua. La reazione viene registrata in continuo per 90 sec. con letture ogni secondo a 405 nm utilizzando un coagulometro automatico ACL-7000 (IL).
5. Harenberg and De Vries J. Chromatography 261 , 287-292 (1983) 6. Hook M. et al FEBS lettere 66, 90-93 (1976)
Dalla tabella si evidenzia che il prodotto ottenuto con il presente processo mostra attività comparabile con l'eparina estrattiva nel test riferito al fattore Xa (1) e ridotta l’attività anticoagulante globale (2) mentre risultano marcatamente maggiori i valori dei test che si riferiscono all’inibizione della trombina (3,4). Queste caratteristiche configurano nel prodotto ottenuto maggiori proprietà antitrombotiche e minori effetti collaterali come l’effetto bleeding rispetto all’eparina estrattiva.
Grazie alle loro caratteristiche, i glicosaminoglicani secondo la presente invenzione possono essere impiegati, da soli o in forma di combinazioni con eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili, per il trattamento anticoagulante ed a ntitrom borico.
Pertanto la presente invenzione comprende anche le composizioni contenenti una quantità efficace di detti glicosaminoglicani in combinazione con eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili.
Infine la presente invenzione si riferisce anche ad un metodo terapeutico comprendente la somministrazione di una quantità efficace di detti glicosaminoglicani per il trattamento anticoagulante e antitrombotico.
A scopo illustrativo dell’invenzione vengono riportati i seguenti esempi.
ESEMPIO 1
L’esempio 1 viene condotto secondo i seguenti stadi:
a) 10 g. di polisaccaride K5 ottenuto tramite fermentazione come descritto nel brevetto MI99A001465 avente purezza dell' 80% (Fig. 2) vengono disciolti in acqua deionizzata al fine di ottenere una soluzione all’1%. Si aggiunge Triton X-100 fino ad ottenere una soluzione al 5% e la soluzione è mantenuta per 2 ore a 55°C sotto agitazione.
La soluzione viene riscaldata a 75°C e mantenuta a questa temperatura fino a formazione di un sistema torbido omogeneo e poi la soluzione viene rapidamente raffreddata a temperatura ambiente.
Nel raffreddamento si formano due fasi.
Sulla fase superiore (fase organica) viene ripetuto detto trattamento termico per altre due volte. La fase acquosa contenente il polisaccaride K5 viene infine concentrata ad 1/10 del volume sotto pressione ridotta e precipitata con acetone o etanolo.
La fase organica viene scartata.
& Il prodotto recuperato è costituito da polisaccaride K5 di purezza 90%, controllata tramite NMR al protone (Fig. 3) rispetto allo spettro dello standard interno (Fig. 1).
b) Il prodotto ottenuto dallo stadio a) viene solubilizzato con 1000 mi di sodio idrossido 2N e lasciato a 60°C per 18 ore. La soluzione si porta a temperatura ambiente e poi a ptì neutro con acido cloridrico 6N. Si ottiene così il polisaccaride K5 N-deacetilato.
La soluzione contenente il K5 N-deacetilato viene mantenuta a 40°C e addizionata con 10 g di sodio carbonato con singola aggiunta e 10 g. di addotto piridina-solfotriossido in 10 minuti. Alla fine della reazione, la soluzione viene portata a temperatura ambiente, quindi a pH 7,5-8 con una soluzione al 5% di acido cloridrico.
Il prodotto ottenuto, costituito dal polisaccaride K5 N-deacetilato N-solfato, viene purificato dai sali tramite diafìltrazione usando una membrana a spirale da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore). il processo di purificazione viene terminato quando la conducibilità del permeato è inferiore a 100 pS.
Il prodotto trattenuto dalla membrana viene portato a concentrazione del 10% del polisaccaride usando lo stesso sistema di diafìltrazione e quindi viene liofilizzato.
Il rapporto N-solfato/N-acetile nel prodotto ottenuto risulta essere di 9, 5/0, 5, misurato tramite NMR al carbonio 13 (Fig. 4).
c) 1- Preparazione dell’enzima C-5 epimerasi immobilizzato
A 5 mg di C-5 epimerasi ricombinante ottenuta secondo il brevetto W098/48006 corrispondente a 1,2 x 10<11 >cpm (counts per minute) disciolti in 200 mi di tampone Hepes 0,25 M, pH 7,4, contenente KCI 0,1 M, Triton X-100 0,1% e EDTA 15 mM, vengono addizionati 100 mg di K5 N-deacetilato N-solfato ottenuto come descritto nello stadio b). La soluzione viene diafìltrata in una membrana da 30.000 D a 4°C fino a scomparsa del K5 N-deacetilato N-solfato nel diafiltrato. Alla soluzione trattenuta dalla membrana viene quindi cambiato il tampone mediante diafiltrazione sostituendolo con NaHC03200 mM a pH 7 e, dopo concentrazione a 50 mi, si aggiungono 50 mi di resina attivata CNBr Sepharose 4b e si lascia reagire per una notte a 4°C. Alla fine della reazione la quantità di enzima residuo nel sumatante viene misurata con il metodo Quantigold (Diversified Biotec) dopo centrifugazione. L’enzima nel sumatante risulta assente, dimostrando che con il metodo descritto l'enzima viene immobilizzato al 100%. Per occupare i siti della resina rimasti disponibili la resina viene lavata con tampone TRIS-HCl 100 mM a pH 8.
Per la misurazione dell’attività deH’enzima immobilizzato, una quantità di enzima immobilizzato teoricamente corrispondente a 1 ,2 x 10<7 >cpm, viene caricato in una colonna. Nella colonna così preparata si tratta 1 mg di K5 N-deacetilato N-solfato ottenuto come descritto nello step b) disciolto in tampone Hepes 25 mM, KCi 0,1 M, EDTA 0,015M, Triton X-100 0,01%, a pH 7,4, facendolo ricircolare attraverso detta colonna a 37°C per una notte con flusso di 0,5 ml/minuto.
Dopo la purificazione tramite sistema cromatografico DEAE e desalazione su Sephadex G10 il campione viene liofilizzato e analizzato per il contenuto di acido iduronico tramite tecnica NMR al protone come già descritto nel brevetto W096/14425.
Il rapporto acido iduronico/acido glucuronico è 30/70. (Fig. 5).
2-Epimerizzazione.
10 g del polisaccaride K5 N-deacetilato N-solfato vengono disciolti in 600 mi di tampone HEPES 25 mM, pH 6,5, contenente CaCh 50 mM. La soluzione ottenuta viene fatta ricircolare attraverso una colonna da 50 mi caricata cori la resina contenente l’enzima immobilizzato.
Questa operazione è condotta a 37°C con un flusso di 200 ml/h per 24 ore.
11 prodotto ottenuto viene purificato tramite ultrafiltrazione e precipitazione con etanolo. Il precipitato viene risolubìlizzato in acqua ad una concentrazione del 10%.
Si ottiene un prodotto epimerizzato con rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 48 / 52 contro un rapporto di 0 /100 del prodotto di partenza.
La percentuale di epimerizzazione è stata calcolata con <1>H-NMR (fig.
6).
La resa, calcolata misurando il contenuto di acidi uronici contro standard col metodo al carbazolo (Bitter and Muir Anal. Biochem. 39, 88-92-1971) è pari al 90%.
d) La soluzione contenente il prodotto epimerizzato con concentrazione 10% proveniente dallo stadio c) viene portata a 10°C con bagno raffeddato e poi viene passata su resina a scambio catìonico IR-120 H<+ >(50 mi). Sia la colonna che il contenitore dell’eluato sono mantenuti a 10°C. Dopo il passaggio della soluzione la resina viene lavata con 3 volumi di acqua deionizzata. Il pH del permeato risulta maggiore di 6. La soluzione acida viene portata a neutralità con una soluzione acquosa al 15% di tetrabutilammonio idrossido. La soluzione risultante viene concentrata a 1/10 del volume in evaporatore rotante a 40°C sotto vuoto, e liofilizzata.
Il prodotto viene sospeso in 200 mi di DMF e addizionato con 150 g dell’addotto piridina-S03 disciolti in 200 mi di DMF. La soluzione viene mantenuta a 45°C per 18 ore.
Alla fine della reazione la soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente e addizionata con 1200 mi di acetone saturato con sodio cloruro.
Il precipitato ottenuto viene separato dal solvente tramite filtrazione, solubilizzato con 100 mi di acqua deionizzata e addizionato con sodio cloruro fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione viene portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2 N e addizionata con 300 mi di acetone. Il precipitato viene separato mediante filtrazione. Il solido ottenuto viene solubilizzato con 100 mi di acqua deionizzata e purificato dai sali residui tramite diafiltrazione come descritto nello stadio b).
L'analisi <13>C-NMR su un’aliquota liofilizzata del prodotto supersolfatato è mostrata in fig. 7.
e) La soluzione contenente il prodotto dello stadio d) viene passata su resina a scambio cationico IR-120 H<+ >(50 mi). Dopo il passaggio della soluzione la resina viene lavata con 3 volumi di acqua deionizzata. Il pH del permeato risulta maggiore di 6. La soluzione acida viene portata a neutralità con piridina. La soluzione risultante viene concentrata a 1/10 del volume in evaporatore rotante a 40°C sotto vuoto, e liofilizzata.
li prodotto ottenuto, in forma di sale di piridina, viene addizionato con 500 mi di una soluzione di DMSO/metanolo (9/1 V/V). La soluzione viene mantenuta a 60°C per 3,5 ore e poi viene addizionata con 50 mi di acqua deionizzata ed infine viene trattata con 1650 mi di acetone saturo di sodio cloruro.
Il solido ottenuto viene purificato tramite diafiltrazione come descritto nello stadio b) ottenendo una soluzione con concentrazione 10%.
L'analisi <13>C-NMR su un'aliquota liofilizzata è riportato in fig. 8 e mostra un contenuto di solfati in posizione 6 deH’amminozucchero del 35%.
f) La soluzione contenente il prodotto dello stadio e) viene passata su resina a scambio cationico IR-120 hT (50 mi). Dopo il passaggio della soluzione la resina viene lavata con 3 volumi di acqua deionizzata. Il pH del permeato risulta maggiore di 6. La soluzione acida viene portata a neutralità con una soluzione acquosa al 15% di tetrabutilammonio idrossido. La soluzione risultante viene concentrata a 1/10 del volume in evaporatore rotante a 40°C sotto vuoto, e liofilizzata.
Il prodotto, in forma di sale di tetrabutilammonio, viene sospeso in 200 mi di DMF. La sospensione viene raffreddata a 0°C e trattata con 40 g dell’addotto piridina-S03 disciolto in 100 mi di DMF. L’agente solfatante viene addizionato tramite singola aggiunta.
La soluzione si lascia a 0°C per 1 ,5 ore e poi viene trattata con 750 mi di acetone saturo di sodio cloruro.
Il solido ottenuto viene purificato tramite diafiitrazione come descrìtto nello stadio b).
g) La soluzione proveniente dallo stadio f) viene trattata come descritto nello stadio b) per ΓΝ-solfatazione.
L’analisi <13>C-NMR su un'aliquota liofilizzata del prodotto ottenuto è mostrata in fig. 9.
Il prodotto ottenuto mostra le caratteristiche chimico-fisiche e biologiche riportate in tabella 2 - riga 3 confrontate con il IV° standard internazionale di eparina e il l° standard internazionale di eparina a basso peso molecolare.
Esempio 2
E’ stato ripetuto l'esempio 1 con la differenza che nello stadio c) è stato impiegato l’enzima immobilizzato C-5 epimerasi estratto da mastocitoma murino come descritto da Jacobsson et al J. Biol. Chem. 254, 2975-2982 (1979), con un tampone di reazione contenente CaCI240mM, pH 7,4. Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 59,5 : 40,5 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 4.
Esempio 3
E’ stato ripetuto l'esempio 1 con la differenza che nello stadio c) è stato impiegato l’enzima immobilizzato C-5 epimerasi estratto da fegato bovino come descritto in W096/14425, con un tampone di reazione a pH 7,4 e tempo di reazione di 32 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è stato di 4 ore.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 55,4 : 44,6 e le caratteristiche descrìtte nella tabella 2 riga 5.
Esempio 4
Viene ripetuto l’esempio 1 con la differenza che nello stadio c) viene impiegato l’enzima ricombinante C-5 epimerasi in soluzione, impiegando per repimerizzazione 10 g di K5 N-deacetilato N-solfato disciolti in 1000 mi di tampone HEPES 25 mM pH 6,5 contenente CaCI2 50 mM. A questa soluzione vengono addizionati 1,5 x 10<11 >cpm equivalenti di enzima ricombinante descritto nell’esempio 1. La soluzione viene mantenuta a 37°C per 24 ore. La soluzione viene poi trattata a 100°C per 10 minuti per denaturare l’enzima ed infine viene filtrata su filtro 0,45 μ per ottenere la soluzione limpida contenente il prodotto. Il prodotto ottenuto viene poi purificato tramite diafiltrazione e precipitazione con etanolo o acetone. Il precipitato viene risolubilizzato in acqua ad una concentrazione del 10% e trattato come nell’esempio 1 mantenendo però il tempo di reazione dello stadio e) per 2 ore.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 56 : 44 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 6. Esempio 5
Viene ripetuto l'esempio 4 impiegando nello stadio c) l’enzima da mastocitoma murino già descritto nell’esempio 2, in soluzione, con tampone di reazione a pH 7,4 contenente BaCI240 mM e mantenendo la reazione per 18 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è di 3 ore. Il prodotto ottenuto presenta un rappòrto acido iduronico/acido glucuronico di 40,1 : 59,9 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 7.
Esempio 6
Viene ripetuto l’esempio 4 impiegando nello stadio c) l’enzima C-5 epimerasi da fegato bovino già descritto nell’esempio 3, in soluzione con tampone di reazione contenente MnCI2 12,5 mM e mantenendo la reazione per 14 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è di 4 ore. Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 44,3 : 55,7 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 8.
Esempio 7
Viene ripetuto l’esempio 4 impiegando nello stadio c) un tampone di reazione a pH 7,4 contenente MgCI237,5 mM e mantenendo la reazione per 16 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è di 4 ore.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 47,5 : 52,5 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 9.
Esempio 8
Viene ripetuto l’esempio 3 impiegando nello stadio c) un tampone di reazione a pH 7,0 contenente MgCI2 10 mM, CaCI25 mM, MnCI2 10 mM e mantenendo la reazione per 24 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è di 3 ore.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 44,8 : 55,2 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 10.
Esempio 9
Viene ripetuto l’esempio 6 impiegando nello stadio c) un tampone di reazione a pH 7,4 contenente MgCb 10 mM, CaCl 5 mM, MgCl2 10 mM e mantenendo la reazione per 24 ore. Inoltre nello stadio e) il tempo di reazione è di 3 ore.
Il prodotto ottenuto presenta un rapporto acido iduronico/acido glucuronico di 52 : 48 e le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 11. Esempio 10
Il campione ottenuto nell’esempio 3 avente una distribuzione dei pesi molecolari ottenuta secondo Harenberg and De Vries J. Chromatography 261, 287-292 (1983) (Fig. 10) viene sottoposto a separazione tramite tecnica di gel filtrazione. In particolare 1 grammo di prodotto viene disciolto in 20 mi di soluzione tampone NaCI 1 M e deposto su una colonna contenente 1000 mi di resina Sephacryl HR S-400 (Amersham-Pharmacia). La colonna viene quindi eluita con 2000 mi di soluzione tampone NaCI 1 M e raccolta in frazioni uguali da 50 mi tramite raccoglitore di frazioni (Gilson). Dopo la determinazione del contenuto di prodotto su ogni frazione tramite analisi al carbazolo (Bitter and Muir Anal. Biochem. 39, 88-92-1971) le frazioni risultanti contenenti il campione vengono raggruppate in frazione A e frazione B rispettivamente corrispondenti alla porzione ad alto peso molecolare e a basso peso molecolare. Queste frazioni dopo concentrazione al 10 percento del volume tramite evaporatore sotto vuoto vengono desalate in colonna contenente 500 mi di resina Sephadex G-10 (Amersham-Pharmacia),
Le soluzioni contenenti i prodotti desalati vengono liofilizzate ottenendo la frazione A e la frazione B (fig. 11 A e fig. 11 B). I prodotti ottenuti presentano le caratteristiche descritte nella tabella 2 righe 12 e 13.
Esempio 11
Il campione ottenuto nell’esempio 4 viene sottoposto a degradazione controllata con acido nitroso come descritto nel brevetto WO 8203627. In particolare 5 g di campione vengono disciolti in 250 mi di acqua e portati a 4°C con bagno termostatato. Il pH si porta a 2.0 con acido cloridrico 1 N raffreddato a 4°C e poi vengono addizionati velocemente 10 mi di una soluzione di sodio nitrito all'1%. Se necessario il pH viene riportato a 2 con acido cloridrico 1 N e si mantiene sotto agitazione lenta per 15 minuti. La soluzione viene neutralizzata con NaOH 1N raffreddata a 4°C. Si aggiungono quindi 250 mg di sodio boro idruro disciolti in 13 mi di acqua deionizzata e si lascia reagire per 4 ore. Si porta a pH 5,0 con acido cloridrico 1 N é si lascia per 10 minuti per distruggere l’eccesso di sodio boro idruro, e poi si neutralizza con NaOH 1N. Il prodotto viene recuperato tramite precipitazione con 3 volumi di etanolo e poi viene essiccato in stufa a vuoto. Il prodotto ottenuto presenta le caratteristiche descritte nella tabella 2 riga 14.
TABELLA 2 - Attività anticoagulante ed antitrombotica dei prodotti ottenuti dagli esempi descritti.
I riferimenti da 1 ) a 6) hanno il significato descritto per la tabella 1.
Dalla tabella si evidenzia che il prodotto ottenuto con il presente processo mostra attività comparabili con l’eparina estrattiva nei test riferiti al fattore Xa (1 ) mentre è ridotta l’attività anticoagulante globale (2) e sono marcatamente maggiori quei test che si riferiscono all’inibizione della trombina (3,4). Queste caratteristiche configurano nei prodotto maggiori proprietà antitrombotiche e minori effetti collaterali come l’effetto bleeding rispetto all’eparina estrattiva.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Derivati del polisaccaride K5 N-deacetilati N-solfatati, epimerizzati almeno fino al 40% di acido L-iduronico rispetto al totale di acidi uranici, aventi peso molecolare da 2.000 a 30.000 D, contenenti da 25 a 50% in peso delle catene ad alta affinità per ATII II ed aventi un’attività anticoagulante ed antitrómbotica espressa come rapporto HCII/antiXa compresa fra 1 ,5 e 4.
- 2. Derivati secondo la rivendicazione<' >1 , caratterizzati dal fatto di avere peso molecolare compreso fra 4.000 e 8.000 D.
- 3. Derivati secondo la rivendicazione 1 , caratterizzati dal fatto di avere peso molecolare compreso fra 18.000 e 30.000 D.
- 4. Processo per la preparazione di derivati del polisaccaride K5 come definiti nella rivendicazione 1, comprendente in sequenza la preparazione del polisaccaride K5 da Escherichia Coli, N-deacetilazione ed N-solfatazione, C-5 epimerizzazione dell’acido D-glucuronico ad acido L-iduronico, supersolfatazione, O-desolfatazione selettiva, 6-O-solfatazione selettiva ed N- solfatazione, caratterizzato dal fatto che detta C-5 epimerizzazione è condotta mediante impiego dell’enzima glucuronosil C-5 epimerasi in soluzione o in forma immobilizzata in presenza di cationi bivalenti specifici.
- 5. Processo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto enzima è scelto dal gruppo comprendente glucuronosil C-5 epimerasi ricombinante, glucuronosil C-5 epimerasi da mastocitoma murino e glucuronosil C-5 epimerasi da estrazione da fegato bovino.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detti cationi bivalenti sono scelti dal gruppo comprendente Ba, Ca, Mg e Mn e vengono utilizzati singolarmente o in combinazione tra loro.
- 7. Processo secondo le rivendicazioni da 4 a 6, caratterizzato dal fatto che detta C-5 epimerizzazione con l’enzima in soluzione è condotta mediante dissoluzione di una quantità di enzima C-5 epimerasi compresa fra 1 ,2x10<7 >e 1,2x10<11 >cpm in 2-2000 mi di tampone Hepes 25 mM ad un pH da 5,5 a 7,4 contenente da 0,001 a 10 g di K5 N-deacetilato N-solfatato ed uno o una combinazione di detti cationi a concentrazione compresa fra 10 e 60 mM.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detta C-5 epimerizzazione con l’enzima in soluzione è condotta a temperatura compresa fra 30 e 40°C per un tempo compreso fra 1 e 24 ore.
- 9. Processo secondo le rivendicazioni da 4 a 6, caratterizzato dal fatto che detta C-5 epimerizzazione con l’enzima in forma immobilizzata è condotta facendo ricircolare 20-1000 mi di una soluzione di Hepes 25 mM ad un pH da 6 a 7,4, contenente 0,001-10 g di K5 N-deacetilato N-solfatato ed uno di detti cationi a concentrazione compresa fra 10 e 60 mM, attraverso una colonna contenente da 1,2x10<7 >a 3x10<11 >cpm dell’enzima immobilizzato su un supporto inerte.
- 10. Processo secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detta C-5 epimerizzazione è condotta a temperatura fra 30 e 40°C facendo ricircolare detta soluzione con un flusso di 30-160 ml/ora per un tempo compreso fra 1 e 24 ore.
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