CN113698501A - 一种牛源肝素钠的提取精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛源肝素钠的提取精制方法，将牛源粗品肝素溶解后经盐解、酶解、柱层析离子交换、醇沉、氧化、过滤、沉淀、干燥等步骤制得，本发明开创了国内牛源肝素钠生产先河，使得牛脏器得以充分利用，解决了国内一直以来对猪源肝素的依赖。本发明适于规模化生产，产品质量具有高活性、高分子量、高纯度等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及牛源肝素钠的提取精制方法，尤其涉及以牛源粗品肝素为起始原料提取精制牛源肝素钠的方法。
背景技术
1939年，全球第一个上市的药用肝素（商品名Liqueamin）来源于牛肺脏，20世纪50年代以来由于猪小肠黏膜的易获得性以及疯牛病的爆发，使得猪小肠来源的肝素钠逐渐成为牛源肝素钠的替代品。但是随着疯牛病得到控制，以及全球市场对肝素产品消费的日益增长，伊斯兰国家对牛源肝素的大量需求，非洲猪瘟导致的生猪数量的锐减，使得牛源肝素钠重返市场的形式迫在眉睫。
我国的贵州贵阳、新疆伊利和库尔勒、河南郑州、福建泉州、吉林长春等地先后尝试牛源粗品肝素的生产，但均因原料来源短缺和粗品销售等原因，无法维持和发展。目前，国内还没有专业化的牛源肝素钠生产厂家，国内纯化牛源粗品肝素的方法较为粗略，制得的牛源肝素钠或者杂质含量较高，或者活性偏低，或者产品收率较低，或者工艺复杂不利于规模化生产。牛源粗品肝素的特点是颜色较深、效价较低，采用传统方法很难获得符合出口标准的产品。
国外市场有少量的牛源肝素，例如巴西的EXTRASUL是牛源肝素钠的原料药和制剂销售公司，Kin Master Produtos Quimicos Ltda.和Wegmed Caminhos Medicinais Ltda.两家公司仅有牛源肝素钠原料药产品；马来西亚的AIN MEDICARE SDN. BHD.和印尼的PTPratapa Nirmala (Fahrenheit)两家公司仅有牛源肝素钠的制剂产品，其原料药从巴西进口。国外仅有屈指可数的几个国家生产经营牛源肝素钠产品，且因原料来源紧张、供不应求而无法满足全球市场需求。
全球穆斯林人口约有20亿，再加上印度教和犹太教等兼容市场，总人口超过23亿，约占全球人口的1/3，对肝素钠的原料需求为每年度50吨左右，市场容量保守估计约为20-30亿美元。牛源肝素钠具有巨大的市场开发潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种可获得高效价、高分子量、高纯度的注射级牛源肝素钠精品的牛源肝素钠的提取精制方法，以克服肝素钠来源于单一物种的限制，满足市场需求，降低肝素钠单一物种来源的风险。
本发明采用如下技术方案：
一种牛源肝素钠的提取精制方法，其包括如下步骤：
（1）盐解：将牛源粗品肝素溶于纯化水中，加入溶液体积1%~5%氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌1~3h；
（2）酶解：在步骤（1）的反应液中加入反应液质量0.1%~1%的蛋白酶，保温45~55℃酶解3~5h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min；然后降温至30℃以下；
（3）柱层析离子交换：将步骤（2）得到的酶解液经离子交换柱吸附，然后用1~2mol/L氯化钠洗涤，洗涤10~15倍柱床体积时停止洗涤，换用5~8倍柱床体积的4~5mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液；
（4）超滤：使用超滤机将洗脱液超滤浓缩至原体积的1/5~1/4；
（5）醇沉：向步骤（4）所得浓缩液中加入95%乙醇，当加入的乙醇体积为浓缩液体积的0.8~1.2倍时，停止加入，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置3~10h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物；
（6）氧化：将步骤（5）所得沉淀物加水溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入浓度为30%的过氧化氢，氧化8~24h；
（7）沉淀：将步骤（6）所得溶液pH调为6.0~7.0，然后将溶液经微孔滤膜过滤后，向滤液中加入滤液体积1.5~2.5倍量的95%乙醇，常温静置8~16h，收集沉淀物；
（8）膜过滤：将步骤（7）所得沉淀物加入纯化水溶解后，经微孔滤膜过滤，收集滤液；
（9）干燥：将步骤（8）所得滤液分装至冷冻干燥盘中，真空干燥后制得注射级牛源肝素钠。
进一步的，步骤（1）中，每0.7亿单位的牛源粗品肝素溶于8L纯化水中。
进一步的，步骤（2）中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
进一步的，步骤（3）中，离子交换柱为阴离子交换柱。
进一步的，步骤（4）中，超滤条件为：将1000~5000Da的超滤膜安装至超滤机上，将进液管、回流管置于药液中，打开回流端阀门，开启蠕动泵，调节回流管路压力为0.1-0.3MPa，超滤浓缩至洗脱液体积为原体积的1/5~1/4时，超滤结束。
进一步的，步骤（6）中，所述过氧化氢的添加量为沉淀物加水溶解后体积的1-5%。
进一步的，步骤（6）中，所述过氧化氢的分步加入过程为：第1步加入过氧化氢总量的30~40%，反应1~3h；第2步加入过氧化氢总量的30~40%，反应1~3h；第3步加入过氧化氢总量的20~40%，搅拌反应至氧化结束。
进一步的，步骤（7）和步骤（8）中，所述微孔膜过滤时的微孔孔径为0.22~0.45μm，压力为0.2~0.4MPa。
本发明的有益效果在于：
一、采用现代化层析技术对牛源粗品肝素进行分离纯化，以强阴离子树脂作为填料，通过离子交换原理来去除核酸、蛋白质，避免了传统调酸、调碱等除核酸、蛋白质手段对肝素结构的破环，有效保护了肝素分子的活性基团，提升了产品质量。
二、采用超滤技术对洗脱液进行浓缩，使洗脱液体积减少为原来的1/5~1/4，从而大大减少了乙醇沉淀步骤的乙醇用量，节能降耗。
三、采用双氧水分步氧化法，通过特定条件与特定步骤下的双氧水氧化，有效除去产品颜色，最大限度保护产品活性、使产品回收率大幅提高，同时避免了采用高锰酸钾氧化产生难以过滤的二氧化锰的问题。
四、特别是本发明含有高温处理、层析柱离子交换、氧化等去除/灭活病毒的有效工艺步骤，具有足够的病毒去除/灭活能力，曾委托国外一家能够提供全套的GLP和GMP病毒安全检测机构对Vaccinia、BVDV、EMCV、PPV、BSE（朊病毒）等执行病毒灭活工艺验证研究，每种病毒均被灭活8个LOG值以上，即病毒至少都被灭活108以上。
本发明以牛源粗品肝素为原料，经过盐解、酶解、柱层析离子交换、醇沉、氧化、过滤、沉淀、干燥等步骤获得高效价、高分子量、高纯度的注射级牛源肝素钠精品。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
以下结合附图1以及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
a.盐解 将牛源粗品肝素0.7亿单位溶于8L纯化水中，加入80g氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌1h。
b.酶解 在步骤a的反应液中加入8g的木瓜蛋白酶，保温45~55℃酶解3h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min，通过热变性使蛋白酶失活。然后降温至30℃以下。
c.柱层析离子交换将上述酶解液经阴离子交换柱吸附，吸附操作条件为：将酶解液经蠕动泵打入离子交换柱中，控制流速5~10ml/min。然后用1.5mol/L氯化钠洗涤，洗涤10倍柱床体积时停止洗涤。换用5倍柱床体积的4mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。
d.超滤 将1000~5000Da的超滤膜安装至超滤机上，将进液管、回流管置于药液中，打开回流端阀门，开启蠕动泵，调节回流管路压力为0.1-0.3MPa，超滤浓缩至洗脱液体积为原体积的1/4时，超滤结束。
e.醇沉 向步骤d所得浓缩液中加入95%乙醇，加入的乙醇体积为浓缩液体积的0.8倍，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置3h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物。
f.氧化将步骤e所得沉淀物加水4L溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入40mL的浓度为30%的过氧化氢，氧化8h。分步加入的具体过程为：第1步加入过氧化氢16ml，反应1~3h；第2步加入过氧化氢16ml，反应1~3h；第3步加入过氧化氢总量的8ml，搅拌反应至氧化结束。
g.沉淀氧化结束，将步骤f所得溶液pH值调为6.0~7.0，然后将溶液以0.2~0.4MPa的压力经0.45μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入滤液体积1.5倍量的95%乙醇，常温静置8h，收集沉淀物。
h.膜过滤将步骤g所得沉淀物加入4L纯化水溶解后，以0.2~0.4MPa的压力经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
i.干燥 将步骤h所得滤液分装至冷冻干燥盘中，开启真空冷冻干燥机，真空干燥后制得注射级牛源肝素钠0.62亿单位。
实施例2
a.盐解 将牛源粗品肝素1.4亿单位溶于16L纯化水中，加入480g氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌2h。
b.酶解 在步骤a的反应液中加入88g的木瓜蛋白酶，保温45~55℃酶解4h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min，通过热变性使蛋白酶失活。然后降温至30℃以下。
c.柱层析离子交换将上述酶解液经阴离子交换柱吸附，吸附操作条件为：将酶解液经蠕动泵打入离子交换柱中，控制流速10~20ml/min，然后用1.5mol/L氯化钠洗涤，洗涤12.5倍柱床体积时停止洗涤。换用6.5倍柱床体积的4.5mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。
d.超滤 将1000~5000Da的超滤膜安装至超滤机上，将进液管、回流管置于药液中，打开回流端阀门，开启蠕动泵，调节回流管路压力为0.1-0.3MPa，超滤浓缩至洗脱液体积为原体积的1/4时，超滤结束。
e.醇沉 向步骤d所得浓缩液中加入95%乙醇，加入的乙醇体积为浓缩液体积的1.0倍，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置6h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物。
f.氧化将步骤e所得沉淀物加水8L溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入240mL的浓度为30%的过氧化氢，氧化16h。分步加入的具体过程为：第1步加入过氧化氢84ml，反应1~3h；第2步加入过氧化氢84ml，反应1~3h；第3步加入过氧化氢72ml，搅拌反应至氧化结束。
g.沉淀氧化结束，将溶液pH值调为6.0~7.0，然后将溶液以0.2~0.4MPa的压力经0.45μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入滤液体积2倍量的95%乙醇，常温静置12h，收集沉淀物。
h.膜过滤将步骤g所得沉淀物加入8L纯化水溶解后，以0.2~0.4MPa的压力经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
i.干燥 将步骤h所得滤液分装至冷冻干燥盘中，开启真空冷冻干燥机，真空干燥后制得注射级牛源肝素钠1.25亿单位。
实施例3
a.盐解 将牛源粗品肝素2.1亿单位溶于24L纯化水中，加入1200g氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌3h。
b.酶解 在步骤a的反应液中加入240g的木瓜蛋白酶，保温45~55℃酶解5h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min，通过热变性使蛋白酶失活。然后降温至30℃以下。
c.柱层析离子交换将上述酶解液经阴离子交换柱吸附，吸附操作条件为：将酶解液经蠕动泵打入离子交换柱中，控制流速15~30ml/min，然后用1.5mol/L氯化钠洗涤，洗涤15倍柱床体积时停止洗涤。换用8倍柱床体积的5mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。
d.超滤 将1000~5000Da的超滤膜安装至超滤机上，将进液管、回流管置于药液中，打开回流端阀门，开启蠕动泵，调节回流管路压力为0.1-0.3MPa，超滤浓缩至洗脱液体积为原体积的1/4时，超滤结束。
e.醇沉 向步骤d所得洗脱液中加入95%乙醇，加入的乙醇体积为洗脱液体积的1.2倍，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置10h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物。
f.氧化将步骤e所得沉淀物加水12L溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入600mL的浓度为30%的过氧化氢，氧化24h。分步加入的具体过程为：第1步加入过氧化氢240ml，反应1~3h；第2步加入过氧化氢180ml，反应1~3h；第3步加入过氧化氢180ml，搅拌反应至氧化结束。
g.沉淀氧化结束，将步骤f所得溶液pH值调为6.0~7.0，然后将溶液以0.2~0.4MPa的压力经0.45μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入滤液体积2.5倍量的95%乙醇，常温静置16h，收集沉淀物。
h.膜过滤将步骤g所得沉淀物加入12L纯化水溶解后，以0.2~0.4MPa的压力经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
i.干燥 将步骤h所得滤液分装至冷冻干燥盘中，开启真空冷冻干燥机，真空干燥后制得注射级牛源肝素钠1.89亿单位。
效果例
取上述实施例1、实施例2、实施例3制得的牛源肝素钠样品分别进行理化性质检测，结果表明三个样品检测结果均符合企业内控质量标准，主要指标检测结果见下表1。
表1 牛源肝素钠主要指标检测结果
上述检测结果表明，三批牛源肝素钠主要指标检测结果均符合标准要求，且核酸、蛋白质、重金属、乙醇残留等杂质含量远低于质量标准要求，而活性远高于质量标准要求。
Claims (6)
1.一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）盐解：将牛源粗品肝素溶于纯化水中，加入溶液体积1%~5%氯化钠搅拌溶解，将溶液升温至45~55℃，用盐酸调溶液pH值8.0~9.0，保温搅拌1~3h；
（2）酶解：在步骤（1）的反应液中加入反应液质量0.1%~1%的蛋白酶，保温45~55℃酶解3~5h，反应结束，将反应液迅速升温至85~95℃，保温10~30min；然后降温至30℃以下；
（3）柱层析离子交换：将步骤（2）得到的酶解液经离子交换柱吸附，然后用1~2mol/L氯化钠洗涤，洗涤10~15倍柱床体积时停止洗涤，换用5~8倍柱床体积的4~5mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液；
（4）超滤：使用超滤机将洗脱液超滤浓缩至原体积的1/5~1/4；
（5）醇沉：向步骤（4）所得浓缩液中加入95%乙醇，当加入的乙醇体积为浓缩液体积的0.8~1.2倍时，停止加入，搅拌10~30min，然后在15~35℃下静置，静置3~10h后沉淀物与上清液分层，收集沉淀物；
（6）氧化：将步骤（5）所得沉淀物加水溶解后，用氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0~11.5，然后升温到30~60℃，分3步加入浓度为30%的过氧化氢，氧化8~24h；
（7）沉淀：将步骤（6）所得溶液pH调为6.0~7.0，然后将溶液经微孔滤膜过滤后，向滤液中加入滤液体积1.5~2.5倍量的95%乙醇，常温静置8~16h，收集沉淀物；
（8）膜过滤：将步骤（7）所得沉淀物加入纯化水溶解后，经微孔滤膜过滤，收集滤液；
（9）干燥：将步骤（8）所得滤液分装至冷冻干燥盘中，真空干燥后制得注射级牛源肝素钠。
2.根据权利要求1所述的一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，步骤（1）中，每0.7亿单位的牛源粗品肝素溶于8L纯化水中。
3.根据权利要求1所述的一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，步骤（3）中，离子交换柱为阴离子交换柱。
4.根据权利要求1所述的一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，步骤（6）中，所述过氧化氢的添加量为沉淀物加水溶解后体积的1-5%。
5.根据权利要求4所述的一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，步骤（6）中，所述过氧化氢的分步加入过程为：第1步加入过氧化氢总量的30~40%，反应1~3h；第2步加入过氧化氢总量的30~40%，反应1~3h；第3步加入过氧化氢总量的20~40%，搅拌反应至氧化结束。
6.根据权利要求4所述的一种牛源肝素钠的提取精制方法，其特征在于，步骤（7）和步骤（8）中，所述微孔膜过滤时的微孔孔径为0.22~0.45μm，压力为0.2~0.4MPa。
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