CN112159445B - β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核苷酸类物质提纯技术领域，尤其是涉及一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法。β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法，包括如下步骤：采用硅胶柱对β‑烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，湿法上样后进行梯度洗脱；所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～90％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β‑烟酰胺单核苷酸；收集体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗的洗脱液，脱色处理后，脱溶处理。本发明的纯化方法得到的β‑烟酰胺单核苷酸纯度高、收率高。

Description

β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法

技术领域

本发明涉及核苷酸类物质提纯技术领域，尤其是涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸，又称作β-NMN，是自然存在的生物活性核苷。由于烟酰胺属于维生素B3，因而NMN属于维生素B族衍生物范畴，广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关。NMN是NAD+的前体，其功能也主要通过NAD+体现。随着年龄的增长，NMN和NAD+水平均呈下降趋势，而NAD+代谢产物NAM呈上升趋势。衰老过程中NAD+的下降被认为是导致疾病和残疾的主要原因，如听力和视力丧失，认知和运动功能障碍，免疫缺陷，自身免疫炎症反应失调导致的关节炎、代谢障碍和心血管疾病。

因此，补充NMN能够提高体内NAD+含量，从而延缓、改善、防止衰老等，或改善年龄诱导的代谢紊乱、老年疾病等，具有重要意义。

NMN可以经内源物质合成，也可以由日常饮食中摄入。NMN在日常食物中分布较广，蔬菜、水果和肉类中均含有丰富的NMN。为了进一步提高NMN在医药治疗等领域的应用前景，现有技术中通过人工合成的方式得到NMN。但由于NMN与多种物质极性相近，分离纯化难度较大，合成得到的NMN纯度和收率较低，不适合工业化生产。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，以解决现有技术中存在的制得的β-烟酰胺单核苷酸纯度低、收率低等技术问题。

本发明的第二目的在于提供β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，通过特定制备方法配合纯化方法，有效去除杂质，提高纯度和收率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，包括如下步骤：

采用硅胶柱对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，湿法上样后进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～90％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；

收集体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗的洗脱液，脱色处理后，除溶处理。

在本发明的具体实施方式中，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇中的任一种或多种。

在本发明的具体实施方式中，所述湿法上样后，吸附10～60min，再进行梯度洗脱。优选的，所述湿法上样后，吸附30～40min，再进行梯度洗脱。

在本发明的具体实施方式中，所述硅胶柱的径高比为1﹕(5～10)，优选为1﹕(7～8)。

在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的流速为1～4bv/h，优选为2～3bv/h。

在本发明的具体实施方式中，所述洗脱液的收集方法包括：每0.1～0.2倍柱体积的洗脱液收集于一个容器中，采用HPLC检测每个容器中的洗脱液，根据检测结果进行合并。在实际操作中，为了进一步提高收集的洗脱液中产物的纯度，可分批次收集洗脱液，然后根据HPLC检测结果，进行洗脱液的合并处理。

在本发明的具体实施方式中，所述脱色处理的方法包括：采用活性炭进行所述脱色。在实际操作中，可在洗脱液中加入活性炭搅拌脱色后过滤，或可将洗脱液过活性炭柱子进行脱色。

在本发明的具体实施方式中，所述除溶处理包括：将脱色处理后的物料旋蒸处理除去醇类溶剂，然后进行冷冻干燥处理。通过旋蒸处理的方式除去低沸点的醇类溶剂，剩余的水相溶剂通过冷冻干燥的方式除去，以得到产物。

在本发明的具体实施方式中，所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物的制备方法包括：

(a)烟酰胺核糖的氯化物与三氯氧磷在溶剂中，于-10～20℃反应5～10h，停止反应；

(b)向步骤(a)反应后的物料中加水破坏，然后缓慢加入碱液中和，过滤并采用醇的水溶液洗滤饼，收集滤液，将所述滤液进行除盐处理，固液分离收集液体。

在本发明的具体实施方式中，所述溶剂包括磷酸三甲酯。

在本发明的具体实施方式中，所述烟酰胺核糖的氯化物与所述三氯氧磷的质量比为(1.2～1.8)﹕1，优选为(1.4～1.5)﹕1。

本发明还提供了β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括前述任意一所述β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，通过采用特定的层析分离条件，能够有效分离β-烟酰胺单核苷酸和各个杂质，提高纯化处理后的β-烟酰胺单核苷酸产物的纯度和收率，适宜于大规模生产。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，包括如下步骤：

采用硅胶柱对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，湿法上样后进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～90％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；

收集体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗的洗脱液，脱色处理后，除溶处理。

在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～85％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～45％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸。然后，收集体积分数为35％～45％的醇类溶剂的水溶液淋洗的洗脱液，脱色处理后，除溶处理。

在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～2个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～85％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～45％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸。

如在不同实施方式中，体积分数为75％～85％的醇类溶剂的水溶液可以为甲醇的水溶液、乙醇的水溶液和异丙醇的水溶液中的一种或多种；醇类溶剂的水溶液的体积分数可以为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％等等。

如在不同实施方式中，体积分数为35％～45％的醇类溶剂的水溶液可以为甲醇的水溶液、乙醇的水溶液和异丙醇的水溶液中的一种或多种；醇类溶剂的水溶液的体积分数可以为35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％等等。

如在不同实施方式中，采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，其中，可淋洗1个柱体积、1.1个柱体积、1.2个柱体积、1.3个柱体积、1.4个柱体积、1.5个柱体积、2个柱体积、3个柱体积、4个柱体积、5个柱体积等等，以将前杂全部淋洗出来。

如在不同实施方式中，用体积分数为75％～85％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，其中，可淋洗0.5个柱体积、0.6个柱体积、0.7个柱体积、0.8个柱体积、0.9个柱体积、1个柱体积等等。

如在不同实施方式中，用体积分数为35％～45％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸。通过采用特定的洗脱剂，将β-烟酰胺单核苷酸从硅胶柱上洗脱下来，并保证与其他杂质成分的有效分离。

在本发明的优选实施方式中，所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～1.5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为80％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为40％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸。

具体的，可采用常规玻璃层析柱，将分析纯硅胶采用醇类溶剂拌匀后，湿法装柱，装入玻璃层析柱中，装填体积为玻璃层析柱容积的75％～85％，如80％。其中，玻璃层析柱的容积可根据待分离纯化的β-烟酰胺单核苷酸粗产物的量进行调整。

在本发明的具体实施方式中，所述硅胶的目数为100～400，如200～300目硅胶。

在本发明的具体实施方式中，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇和异丙醇中的任一种或多种。

在本发明的具体实施方式中，所述湿法上样后，吸附10～60min，再进行梯度洗脱。优选的，所述湿法上样后，吸附30～40min，再进行梯度洗脱。

在本发明的具体实施方式中，所述湿法上样的上样量以体积计为1/20～1/10倍柱体积。

在本发明的具体实施方式中，所述硅胶柱的径高比为1﹕(5～10)，优选为1﹕(7～8)。

在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的流速为1-4bv/h，优选为2-3bv/h。

在本发明的具体实施方式中，所述洗脱液的收集方法包括：每0.1～0.2倍柱体积的洗脱液收集于一个容器中，采用HPLC检测每个容器中的洗脱液，根据检测结果进行合并。在实际操作中，为了进一步提高收集的洗脱液中产物的纯度，可分批次收集洗脱液，然后根据HPLC检测结果，进行洗脱液的合并处理。

在本发明的具体实施方式中，所述脱色处理的方法包括：采用活性炭进行所述脱色。在实际操作中，可在洗脱液中加入活性炭搅拌脱色后过滤，或可将洗脱液过活性炭柱子进行脱色。

在本发明的具体实施方式中，所述除溶处理包括：将脱色处理后的物料旋蒸处理除去醇类溶剂，然后进行冷冻干燥处理。通过旋蒸处理的方式除去低沸点的醇类溶剂，剩余的水相溶剂通过冷冻干燥的方式除去，以得到产物。

在本发明的具体实施方式中，所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物的制备方法包括：(a)烟酰胺核糖的氯化物与三氯氧磷在溶剂中，于-10～20℃反应5～10h，停止反应；

(b)向步骤(a)反应后的物料中加水，加碱液中和，过滤并采用醇的水溶液洗滤饼，收集滤液，将所述滤液进行除盐处理，固液分离收集液体。

在本发明的具体实施方式中，所述除盐处理包括：冷冻静置，使盐析出；或者，除水，使盐析出。除水的方式可包括：于20～25℃旋除水。当盐析出后，通过过滤等方式除去盐，收集液体，备用。

在本发明的具体实施方式中，搅拌脱色时，活性炭的用量为烟酰胺核糖的氯化物的质量的0.8～1.2倍，如可以为1倍。

收集的滤液为含有β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸粗产物。

具体的合成路线如下：

在实际操作中，将烟酰胺核糖的氯化物与溶剂的混合物降温至-15～-10℃，缓慢滴加三氯氧磷，然后于-10～20℃反应5～10h，通过TLC监控反应完毕，停止反应。

在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，于氮气保护下进行反应。

在本发明的具体实施方式中，所述溶剂包括磷酸三甲酯。其中，所述烟酰胺核糖的氯化物与所述磷酸三甲酯的用量比为1g﹕(3～5)mL，优选为1g﹕(3～4)mL。

在本发明的具体实施方式中，所述烟酰胺核糖的氯化物与所述三氯氧磷的质量比为(1.2～1.8)﹕1，优选为(1.4～1.5)﹕1。

采用本发明的纯化方法对相应制备方法制得的β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行纯化处理，制得的β-烟酰胺单核苷酸产物纯度≥98.6％；并且，以烟酰胺核糖的氯化物作为起始原料，制得的β-烟酰胺单核苷酸产物的收率≥59％，并且可达到66.28％。

本发明还提供了β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括前述任意一所述β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法。

实施例1

本实施例提供了β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氮气保护下，将烟酰胺核糖的氯化物2.91g(10mmol)和磷酸三甲酯10mL投入到50mL的三口瓶中，降温到-10℃，缓慢滴加三氯氧磷2.00g，然后于-5℃反应8h，TLC监控反应完毕。

(2)向步骤(1)反应后的物料中，加入0.1mL水破坏，然后加入稀碱液(如稀NaOH的水溶液)中和，过滤掉析出的盐，并采用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤过滤的滤饼，收集滤液。将所述滤液于20℃旋除水后，过滤掉析出的盐，用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤滤饼，收集液体用于上样。

(3)准备径高比为1﹕8的100mL玻璃层析柱，取80mL的200-300目的分析纯硅胶，采用无水甲醇拌匀，湿法装柱；然后将步骤(2)得到的液体缓慢加入硅胶柱中，吸附30min。

(4)然后采用无水甲醇约1～1.5倍柱体积(如1.2～1.3倍柱体积)淋洗至前杂完全出来，然后改用体积分数为80％的甲醇水溶液约0.6～0.8倍柱体积(如0.65倍)淋洗，然后再用体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；收集体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗的洗脱液，合并前述洗脱液中含纯β-烟酰胺单核苷酸产品的部分，进行脱色处理，然后旋蒸除去脱色处理后的物料中的甲醇，剩余水相采用冷冻干燥处理，得到2.00g白色粉末；

其中，所述脱色处理包括：过活性炭柱子进行脱色。

采用HPLC将得到的2.00g白色粉末与NMN标准品对照，为同一峰位。

实施例2

本实施例提供了β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氮气保护下，将烟酰胺核糖的氯化物29.07g(100mmol)和磷酸三甲酯100mL投入到250mL的三口瓶中，降温到-10℃，缓慢滴加三氯氧磷20.11g，然后于-5℃反应8h，TLC监控反应完毕。

(2)向步骤(1)反应后的物料中，缓慢滴入1mL水破坏，然后加入稀碱液中和，过滤掉析出的盐，并采用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤过滤的滤饼，收集滤液，冷冻保存24h，过滤析出的盐，用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤滤饼，收集液体用于上样。

(3)准备径高比为1﹕7左右的1000mL玻璃层析柱，取800mL的200-300目的分析纯硅胶，采用无水甲醇分散成悬浮状，装入玻璃层析柱中，压实；然后将步骤(2)得到的液体缓慢加入硅胶柱中，吸附30min。

(4)然后采用无水甲醇约1～1.5倍柱体积淋洗至前杂完全出来，然后改用体积分数为80％的甲醇水溶液约0.6～0.8倍柱体积淋洗，然后再用体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；收集体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗的洗脱液，合并前述洗脱液中含纯β-烟酰胺单核苷酸产品的部分，进行脱色处理，然后旋蒸除去脱色处理后的物料中的甲醇，剩余水相采用冷冻干燥处理，得到21.6g白色粉末；

其中，所述脱色处理包括：过活性炭柱子进行脱色。

采用HPLC将得到的21.6g白色粉末与NMN标准品对照，为同一峰位。

实施例3

本实施例提供了β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氮气保护下，将烟酰胺核糖的氯化物29.10g(100mmol)和磷酸三甲酯100mL投入到250mL的三口瓶中，降温到-10℃，缓慢滴加三氯氧磷20.82g，然后于-5℃反应8h，TLC监控反应完毕。

(2)向步骤(1)反应后的物料中，缓慢滴入1mL水破坏，然后加入稀碱液中和，过滤掉析出的盐，并采用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤过滤的滤饼，收集滤液。将所述滤液于20℃旋除水后，让盐充分析出，过滤掉析出的盐，用体积分数为60％的甲醇的水溶液洗涤滤饼，收集液体用于上样。

(3)准备径高比为1﹕9的1000mL玻璃层析柱，取800mL的200-300目的分析纯硅胶，采用无水甲醇拌匀，装入玻璃层析柱中，压实；然后将步骤(2)得到的液体缓慢加入硅胶柱中，吸附30min。

(4)然后采用无水甲醇约1～1.5倍柱体积淋洗至前杂完全出来，然后改用体积分数为80％的甲醇水溶液约0.6～0.8倍柱体积淋洗，然后再用体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；收集体积分数为60％的甲醇水溶液淋洗的洗脱液，合并前述洗脱液中含纯β-烟酰胺单核苷酸产品的部分，进行脱色处理，然后旋蒸除去脱色处理后的物料中的甲醇，剩余水相采用冷冻干燥处理，得到22.4g白色粉末；

其中，所述脱色处理包括：过活性炭柱脱色。

采用HPLC将得到的22.4g白色粉末与NMN标准品对照，为同一峰位。

实施例4

本实施例参考实施例1的方法，区别在于：将步骤(3)-(4)中所涉及的无水甲醇、各体积分数的甲醇的水溶液分别替换成无水乙醇、各相应体积分数的乙醇的水溶液。

实施例5

本实施例参考实施例1的方法，区别在于：将步骤(3)-(4)中所涉及的无水甲醇、各体积分数的甲醇的水溶液分别替换成异丙醇、各相应体积分数的异丙醇的水溶液。

实验例

为了对比说明不同实施例的制备方法最终得到的β-烟酰胺单核苷酸的收率和纯度，将各实施例得到的粉末进行HPLC检测(检测条件参考现行标准)，并以烟酰胺核糖的氯化物作为初始原料计算收率，结果如下表1所示。

表1不同实施例的β-烟酰胺单核苷酸的收率和纯度

编号	收率/％	纯度/％
			实施例1	59.08	99.51
实施例2	63.92	99.20
			实施例3	66.28	99.23
实施例4	65.07	99.01
			实施例5	63.07	98.67

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用硅胶柱对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，湿法上样后进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱包括：采用醇类溶剂作为流动相淋洗1～5个柱体积脱除前杂，再用体积分数为75％～90％的醇类溶剂的水溶液淋洗0.5～1个柱体积，再用体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗至洗脱液中无β-烟酰胺单核苷酸；

收集体积分数为35％～70％的醇类溶剂的水溶液淋洗的洗脱液，脱色处理后，除溶处理；

所述醇类溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的任一种或多种；

所述β-烟酰胺单核苷酸粗产物的制备方法包括：

(a)烟酰胺核糖的氯化物与三氯氧磷在溶剂中，于-10～20℃反应5～10h，停止反应；

(b)向步骤(a)反应后的物料中加水，缓慢加入碱液中和，过滤并采用醇的水溶液洗滤饼，收集滤液，将所述滤液进行除盐处理，固液分离收集液体；

所述烟酰胺核糖的氯化物与所述三氯氧磷的质量比为(1.2～1.8)﹕1；

所述溶剂为磷酸三甲酯。

2.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述湿法上样后，吸附10～60min，再进行所述梯度洗脱。

3.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述湿法上样后，吸附30～40min，再进行所述梯度洗脱。

4.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述硅胶柱的径高比为1﹕(5～10)。

5.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述硅胶柱的径高比为1﹕(7～8)。

6.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为1～4bv/h。

7.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为2～3bv/h。

8.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述脱色处理的方法包括：采用活性炭进行所述脱色。

9.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述除溶处理包括：将所述脱色处理后的物料旋蒸处理除去醇类溶剂，然后进行冷冻干燥处理。

10.β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-9任一项所述的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法。