CN108593793B - 一种采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法，通过东莨菪碱粗提物的制备、配位层析柱的制备、层析柱平衡、层析分离、流出液合并与干燥等步骤制得纯化后的东莨菪碱。本发明对现有的东莨菪碱色谱分离法进行改进，在层析分离介质中引入配位剂，使得东莨菪碱提取物只需一步层析分离即可达到较高纯度(纯度为90％‑99％，回收率为70％‑85％)，大大缩短了生产流程，减少了有机溶剂的使用量，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及原料药制备领域，具体涉及一种采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法。
背景技术
东莨菪碱是一种广泛存在于茄科植物中的生物碱，其具有解痉、散瞳、抗胆碱、镇痛、镇静等多种功能，已被广泛应用于临床药学中，国内外对其纯品需求量非常的大。然而，由于东莨菪碱本身为手性分子，其药用有效形态为左旋体，故在提取分离过程中，受酸碱环境、光照、温度等条件的影响，东莨菪碱易消旋化生成D,L-东莨菪碱，失去光学活性。为此，采取色谱法进行东莨菪碱的分离以更好的保持其稳定性已取得了一定程度的应用，例如：氧化铝色谱、强酸性阳离子交换色谱等。但是，传统色谱分离仍存在富集性差、产品得率低、回收率低、纯度低等一系列问题，特别是对诸如东莨菪碱此类在植物内含量较低且结构相似的干扰物质含量较高的组分，在进行色谱分离前往往需要辅助多步液液萃取进行初步处理，且在色谱分离后需采用其他方式进行精细纯化才能达到高纯度要求，这使得分离工艺繁琐而冗长，增加了东莨菪碱的生产成本，因此，对东莨菪碱的色谱分离法进行改进，使其具有更高的富集性和分离效果具有重大的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法，以提高东莨菪碱的富集性和分离效果。
本发明采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法，包括如下步骤：
步骤1：东莨菪碱粗提物的制备
取干燥的洋金花用粉碎机粉碎，过40目筛，得到洋金花粉末；将所得洋金花粉末加入氨水与二氯甲烷的混合液中进行超声波提取，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取液并干燥后即得东莨菪碱粗提物；
步骤2：配位层析柱的制备
取填料与配位剂置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5-15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入4.6mm×250mm色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；
步骤3：配位层析柱平衡
用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液冲洗步骤2得到的配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；
步骤4：层析分离
将东莨菪碱粗提物用乙酸乙酯复溶，过滤除去不溶物后加入配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中东莨菪碱的含量；
步骤5：流出液合并与干燥
将步骤4中东莨菪碱含量≥90％的流出液(低于该浓度的流出液均浓缩后再重新层析分离)合并并在减压条件下浓缩干燥，即得纯化后的东莨菪碱。
步骤1中，洋金花粉末与二氯甲烷的质量体积比为1g:10mL；洋金花粉末与氨水(质量浓度为23-25％)的质量体积比为1g:2mL。
步骤1中，超声波提取的功率为250W，时间为30min。
步骤2中，所述填料为硅胶、氧化铝、聚酰亚胺中的任意一种；所述配位剂为醋酸钠、硫酸铜、硝酸银、氯化镁、氯化钙中的一种或几种；配位剂的添加质量为填料质量的2％-15％。
步骤3、4中，所述乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液是由乙酸乙酯、甲醇和浓氨(质量浓度为23-25％)按体积比17:2:1的比例混合构成。
步骤4中，HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪为Agilent 1260；色谱柱为SGE protecol C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液(含0.0175mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)，体积比为1:2；检测波长为216nm。
本发明分离纯化后获得的东莨菪碱的纯度为90％-98％，回收率为70％-85％。
本发明的有益效果体现在：
本发明采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱，其对现有的东莨菪碱色谱分离法进行改进，在色谱分离介质中引入配位剂，使得东莨菪碱提取物只需一步层析分离即可达到较高纯度，大大缩短了生产流程，减少了有机溶剂的使用量，降低了生产成本。本方法的原理是在层析分离介质中引入配位剂后可提高分离介质的选择性，扩大东莨菪碱与其他结构相似杂质在层析分离特性上的差异，提高层析柱对东莨菪碱的富集性和分离效果，从而达到提高产品纯度和回收率的目的。其中，在东莨菪碱粗提物的制备中，采用超声波辅助二氯甲烷法进行提取，此方法不仅具有更高的提取率，而且制得的提取物具有更少的杂质含量，为层析分离过程提供了便利，在层析分离过程中采用配位层析柱进行吸附，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液进行洗脱，可一次性将东莨菪碱纯度提高至90％以上，纯化回收率均在70％以上，相较于普通色谱法减少了生产步骤，降低了有机溶剂的用量，经济实用，适合工业化生产。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
本实施例中采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法如下：
1、东莨菪碱粗提物的制备
取干燥的洋金花用粉碎机粉碎，过40目筛，得到洋金花粉末；将所得洋金花粉末加入氨水和二氯甲烷中进行超声波提取(洋金花粉末与二氯甲烷的质量体积比为1g:10mL；洋金花粉末与氨水(质量浓度为23-25％)的质量体积比为1g:2mL)，超声波功率为250W，超声时间为30min，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取液并干燥后即得东莨菪碱粗提物；
2、配位层析柱的制备
取硅胶与醋酸钠置于样品粉碎机中研磨，醋酸钠的添加量为硅胶质量的12％，得到粒径为5-15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入4.6mm×250mm色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；
3、配位层析柱平衡
用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)冲洗步骤2得到的配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；
4、层析分离
将东莨菪碱粗提物用乙酸乙酯复溶，过滤除去不溶物后加入配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中东莨菪碱的含量；
HPLC检测条件为：高效液相色谱仪为Agilent 1260，色谱柱为SGE protecol C18(5μm,4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液(含0.0175mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)，体积比为1:2，检测波长为216nm。
5、流出液合并与干燥
将步骤4中东莨菪碱含量≥90％的流出液合并并在减压条件下浓缩干燥，即得纯化后的东莨菪碱。经测定，纯化后的东莨菪碱的纯度为91.6％，回收率为83.4％。
实施例2：
本实施例中采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法如下：
1、东莨菪碱粗提物的制备
取干燥的洋金花用粉碎机粉碎，过40目筛，得到洋金花粉末；将所得洋金花粉末加入氨水和二氯甲烷中进行超声波提取(洋金花粉末与二氯甲烷的质量体积比为1g:10mL；洋金花粉末与氨水(质量浓度为23-25％)的质量体积比为1g:2mL)，超声波功率为250W，超声时间为30min，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取液并干燥后即得东莨菪碱粗提物；
2、配位层析柱的制备
取氧化铝与硫酸铜置于样品粉碎机中研磨，硫酸铜的添加量为氧化铝的8％，得到粒径为5-15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入4.6mm×250mm色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；
3、配位层析柱平衡
用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)冲洗步骤2得到的配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；
4、层析分离
将东莨菪碱粗提物用乙酸乙酯复溶，过滤除去不溶物后加入配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中东莨菪碱的含量；
HPLC检测条件为：高效液相色谱仪为Agilent 1260，色谱柱为SGE protecol C18(5μm,4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液(含0.0175mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)，体积比为1:2，检测波长为216nm。
5、流出液合并与干燥
将步骤4中东莨菪碱含量≥90％的流出液合并并在减压条件下浓缩干燥，即得纯化后的东莨菪碱。经测定，纯化后的东莨菪碱的纯度为99.0％，回收率为77.2％。
实施例3：
本实施例中采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法如下：
1、东莨菪碱粗提物的制备
取干燥的洋金花用粉碎机粉碎，过40目筛，得到洋金花粉末；将所得洋金花粉末加入氨水和二氯甲烷中进行超声波提取(洋金花粉末与二氯甲烷的质量体积比为1g:10mL；洋金花粉末与氨水(质量浓度为23-25％)的质量体积比为1g:2mL)，超声波功率为250W，超声时间为30min，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取液并干燥后即得东莨菪碱粗提物；
2、配位层析柱的制备
取聚酰亚胺置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5-15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入4.6mm×250mm色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得聚酰亚胺层析柱；
3、配位层析柱平衡
用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)冲洗步骤2得到的配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；
4、层析分离
将东莨菪碱粗提物用乙酸乙酯复溶，过滤除去不溶物后加入层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(乙酸乙酯、甲醇、浓氨的体积比为17:2:1)洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中东莨菪碱的含量；
HPLC检测条件为：高效液相色谱仪为Agilent 1260，色谱柱为SGE protecol C18(5μm,4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液(含0.0175mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)，体积比为1:2，检测波长为216nm。
5、流出液合并与干燥
将步骤4中东莨菪碱含量≥90％的流出液合并并在减压条件下浓缩干燥，即得纯化后的东莨菪碱。经测定，纯化后的东莨菪碱的纯度为90.7％，回收率为81.8％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种采用配位柱层析法分离纯化东莨菪碱的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：东莨菪碱粗提物的制备
取干燥的洋金花用粉碎机粉碎，过40目筛，得到洋金花粉末；将所得洋金花粉末加入氨水与二氯甲烷的混合液中进行超声波提取，过滤，滤渣重复提取两次，合并提取液并干燥后即得东莨菪碱粗提物；
步骤2：配位层析柱的制备
取填料与配位剂置于样品粉碎机中研磨，得到粒径为5-15μm的粉末，然后加入乙酸乙酯，混合均匀后装入色谱柱，静置1d，使配位离子与填料充分配位结合，即得配位层析柱；
步骤3：配位层析柱平衡
用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液冲洗步骤2得到的配位层析柱，冲洗至无配位离子反应为止；
步骤4：层析分离
将东莨菪碱粗提物用乙酸乙酯复溶，过滤除去不溶物后加入配位层析柱中，待样品吸附完全后用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液洗脱，分段收集流出液，用HPLC检测各段流出液中东莨菪碱的含量；
步骤5：流出液合并与干燥
将步骤4中东莨菪碱含量≥90％的流出液合并并在减压条件下浓缩干燥，即得纯化后的东莨菪碱；分离纯化后获得的东莨菪碱的纯度为90％-98％，回收率为70％-85％；
步骤2中，所述填料为硅胶、氧化铝、聚酰亚胺中的任意一种；所述配位剂为醋酸钠、硫酸铜、硝酸银、氯化镁、氯化钙中的一种或几种；
配位剂的添加质量为填料质量的2％-15％；
步骤3、4中，所述乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液是由乙酸乙酯、甲醇和浓氨按体积比17:2:1的比例混合构成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1中，洋金花粉末与二氯甲烷的质量体积比为1g:10mL；洋金花粉末与氨水的质量体积比为1g:2mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1中，超声波提取的功率为250W，时间为30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4中，HPLC检测条件为：高效液相色谱仪为Agilent 1260；色谱柱为SGE protecolC18；流动相为乙腈-0.07mol/L磷酸钠溶液，含0.0175mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0，体积比为1:2；检测波长为216nm。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1137742B (de) * | 1960-04-01 | 1962-10-11 | Dr Robert Pfleger | Verfahren zur Gewinnung von Datura-Alkaloiden und deren Salzen |
| DE2040460A1 (de) * | 1970-08-14 | 1972-02-17 | Max Planck Gesellschaft | Scopolaminverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung |
| CN1315324A (zh) * | 2000-03-30 | 2001-10-03 | 科学与工业研究会 | 从植物黄花蒿中分离化合物东莨菪亭的方法 |
| CN101856382A (zh) * | 2010-07-02 | 2010-10-13 | 安徽济人药业有限公司 | 一种提取分离桔梗皂苷有效成分的新方法 |
| CN101921186A (zh) * | 2010-08-12 | 2010-12-22 | 天津科技大学 | 银化硅胶柱层析提取红花籽油中亚油酸的方法 |
| CN104276973A (zh) * | 2013-07-05 | 2015-01-14 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种羟基肉桂酸胺类生物碱及其制备和应用 |
| CN106083871A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-11-09 | 安徽德信佳生物医药有限公司 | 一种洋金花中东莨菪碱的提取纯化方法 |
| CN107235972A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-10-10 | 安徽德信佳生物医药有限公司 | 一种采用膜分离技术提取东莨菪碱的方法 |
-
2018
- 2018-04-19 CN CN201810354630.7A patent/CN108593793B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1137742B (de) * | 1960-04-01 | 1962-10-11 | Dr Robert Pfleger | Verfahren zur Gewinnung von Datura-Alkaloiden und deren Salzen |
| DE2040460A1 (de) * | 1970-08-14 | 1972-02-17 | Max Planck Gesellschaft | Scopolaminverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung |
| CN1315324A (zh) * | 2000-03-30 | 2001-10-03 | 科学与工业研究会 | 从植物黄花蒿中分离化合物东莨菪亭的方法 |
| CN101856382A (zh) * | 2010-07-02 | 2010-10-13 | 安徽济人药业有限公司 | 一种提取分离桔梗皂苷有效成分的新方法 |
| CN101921186A (zh) * | 2010-08-12 | 2010-12-22 | 天津科技大学 | 银化硅胶柱层析提取红花籽油中亚油酸的方法 |
| CN104276973A (zh) * | 2013-07-05 | 2015-01-14 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种羟基肉桂酸胺类生物碱及其制备和应用 |
| CN106083871A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-11-09 | 安徽德信佳生物医药有限公司 | 一种洋金花中东莨菪碱的提取纯化方法 |
| CN107235972A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-10-10 | 安徽德信佳生物医药有限公司 | 一种采用膜分离技术提取东莨菪碱的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Steroidal Alkaloids of Marsdenia rostrata. III* Rostratine and Dihydrorostratine;E. Gellert et al;《Aust. J. Chem》;19741231;第27卷;919-921 * |
| 洋金花中东莨菪碱的提取工艺研究;付传香 等;《安徽化工》;20171231;第43卷(第6期);29-35 * |
| 薄层扫描法测定洋马酊中东茛菪碱和士的宁的含量;陶志华 等;《中国医院药学杂志》;19991231;第19卷(第5期);278-280 * |
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|---|---|
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