CN105061447B - 一种喜树碱的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是公开一种喜树碱的分离纯化方法，具体是一种利用硅藻土过滤、膜分离技术、大孔吸附树脂柱层析吸、制备色谱分离柱集成纯化的方法来制备高纯度喜树碱的技术。解决萃取和吸附对目标物的选择性均低，制备出的喜树碱纯度均不高和采用多次萃取重结晶的方式有机溶剂消耗量大，费工、费时、经济性差，工业生产成本高，对环境污染严重的问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取纯化领域，具体是一种利用硅藻土过滤、膜分离技术、大孔吸附树脂柱层析吸、制备色谱分离柱集成纯化的方法来制备高纯度喜树碱的技术。
背景技术
喜树碱是一种吲哚类生物碱，一般从喜树中提取，其化学结构式如下所示，分子量348.34，分子式：C2OH16N2O4；浅黄色针状结晶，片状结晶，熔点264～266℃，微具吸湿性，在紫外光下显蓝色荧光。喜树碱是目前为止发现唯一的拓扑异构酶(Topoisomerase)抑制剂，具有广普抗肿瘤活性。世界卫生组织已经把喜树碱衍生物的研究作为抗癌药物的主攻方向之一。自1996年美国FDA批准第一个喜树碱类抗癌新药拓扑替康上市后，伊诺替康、9-氨基喜树碱、10-羟基喜树碱等新药相继问世，成为一大类重要临床用抗肿瘤制剂。而喜树碱是合成这些药物的前体，所以高效经济的制备出高纯度的喜树碱意义重大。
现有技术有如下缺陷：①均只采用萃取和吸附进行纯化，由于萃取和吸附对目标物的选择性均低，制备出的喜树碱纯度均不高；②采用多次萃取重结晶的方式，有机溶剂消耗量大，费工、费时、经济性差，工业生产成本高，对环境污染严重。
发明内容
本发明的目的是解决萃取和吸附对目标物的选择性均低，制备出的喜树碱纯度均不高且采用多次萃取重结晶的方式有机溶剂消耗量大，费工、费时、经济性差，工业生产成本高，对环境污染严重的问题。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：由以下步骤构成：
1)喜树碱溶液过硅藻土除杂
1.1)取料液比为1∶5～1∶10的市售喜树碱浸膏与浓度为65％～95％的乙醇，将喜树碱浸膏用浓度为65％～95％的乙醇搅拌溶解；所述料液比中的重量单位为g时，体积单位为mL；
1.2)将硅藻土均匀铺在布氏漏斗中，其厚度为1～2cm；
1.3)将溶解后的喜树碱溶液过滤，去掉其中的固体杂质，得滤液A备用，收集滤渣与下批次喜树碱浸膏混合溶解过滤；
2)膜分离器对喜树碱溶液除杂
将步骤1)中所得的滤液A，过膜分离器，选用截留分子量为1～3万的超滤膜，在表压为0.05～0.2MPa下进行超滤，直至超滤截留液体积降低至滤液A体积的1/5～1/10时止，分别收集截留液和透过液B，截留液里含溶解性淀粉和蛋白质，浓缩干燥后用于饲料蛋白添加剂；
3)制备大孔树脂层析柱
3.1)将LX-60或HPD722树脂进行活化∶取料液比为1∶8～10的LX-60或HPD722树脂与浓度为90％～95％的乙醇，用浓度为90％～95％乙醇浸泡树脂12～24小时，充分溶胀后，用去离子水洗涤至无醇味；然后将活化好的树脂均匀装入中压玻璃层析柱中，使得树脂高度为层析柱的3/5～4/5；
所述料液比中的重量单位为g时，体积单位为mL；
3.2)然后将层析柱的进液管口连接恒流泵，出液管口连接紫外检测器，就组装成喜树碱层析柱分离系统；
4)树脂柱纯化透过液
4.1)将步骤2)中收集到的透过液B，用恒流泵泵入步骤3)中制好的层析柱中，吸附树脂体积与透过液B体积之比为1∶10～30，泵入流速为2～6BV/h，分别收集过柱液和吸附了喜树碱的层析柱，对收集的过柱液，减压浓缩后与下批次的A溶液合并，乙醇回收作为溶剂；对于吸附了喜树碱的层析柱，先用2～5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，用于制备发酵有机肥料；
4.3)然后用浓度为90％～95％的乙醇溶液洗脱已被纯净水经洗涤过的层析柱，洗脱剂用量2～8BV，控制流速为2～6BV/h，收集紫外吸收波长为254nm处的乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液置于旋转蒸发仪内浓缩，浓缩温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩液过孔径为0.22～1.0μm的微孔滤膜，得到喜树碱浓缩液C；
4.4)而经浓度为90％～95％乙醇洗脱的层析柱树脂，先用2～5BV的、质量分数为5％的NaOH的溶液，以1～2BV/h的速度进行再生，然后用纯水洗涤至中性；分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液静置后过滤重新利用处理树脂；对于收集的再生层析柱树脂，用于下批次喜树碱的吸附；
5)制备透过色谱柱的喜树碱溶液
将步骤4)中得到的喜树碱浓缩液C，用制备液相色谱仪进行分离制备，浓缩液与色谱柱填料量的体积重量比为1∶30～1∶100，流动相的体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为20～25mL/min，收集出峰时间为6～10min的制备液，得到喜树碱制备液D；
所述浓缩液与色谱柱填料量的体积重量比中，色谱柱填料量单位为g时，浓缩液的单位为L；
6)制备喜树碱结晶
将步骤5)中得到的喜树碱制备液D浓缩至原溶液的1/5～1/4后，用乙酸乙酯萃取一次，用量为浓缩液的2～3倍，收集萃余液与下批次的滤液A合并；而萃取液置于旋转蒸发仪内，再次浓缩，温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩至萃取液体积的1/10～1/8后收集乙酸乙酯用于下批次的萃取，而浓缩液置于温度为0～-15℃，绝对真空度为100～300Pa的条件下冷冻干燥12～24h，即制备出喜树碱冻干粉，纯度达90％以上。
进一步，所述步骤5)中过完树脂的洗脱液浓缩后，使用型号为C18-SPS-100A-9μm的制备色谱柱设备进行制备。
本发明的技术效果是毋庸置疑的，该喜树碱的分离纯化方法有以下优点：
1、利用膜分离技术、大孔吸附树脂柱层析吸、制备色谱柱集成纯化喜树碱，降低了在结晶步骤中杂质的含量，降低了萃取有机溶剂的消耗，该方法更经济、环保。
2、在过膜分离的过程前，先用硅藻土过滤，除去了溶质中大多数的大分子杂质、胶体、增加了分离膜的使用寿命。
3、在上柱吸附前，先用膜分离技术除去了混合溶液中的多糖、氨基酸、鞣质、有机酸，固体蛋白，减小了吸附树脂的吸附压力，增加其有效吸附量。
4、过完树脂柱的解析液，再通过制备色谱柱，其经过不断地吸附解析，喜树碱能够很好的分离出来，制备出的喜树碱纯度高，且减少了结晶次数，降低能耗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1：
一种喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：由以下步骤构成：
1)喜树碱溶液过硅藻土除杂
1.1)将市售的喜树碱浸膏(含10％的喜树碱)500g切成小块，置于5L的烧杯中，料液比为1∶6(g∶mL)，用3L纯度为65％的乙醇搅拌溶解5小时；
1.2)将硅藻土均匀铺在布氏漏斗中，其厚度为2cm；
1.3)将溶解后的喜树碱溶液用布氏漏斗过滤，去掉其中的固体杂质等，得滤液A备用；收集滤渣与下批次喜树碱浸膏混合溶解过滤；
2)膜分离器对喜树碱溶液除杂
将步骤1)中所得的滤液A，过膜分离器，选用截留分子量为1万的超滤膜，在表压为0.1MPa下进行超滤，直至超滤截留液体积降低至滤液A体积的1/5时止，分别收集截留液和透过液B，截留液里含溶解性淀粉和蛋白质，浓缩干燥后用于饲料蛋白添加剂；
3)制备大孔吸附树脂柱
3.1)将LX-60树脂进行活化∶取料液比(g∶mL)为1∶8的LX-60树脂与95％的乙醇，用95％乙醇浸泡树脂24小时，充分溶胀后，用去离子水洗涤至无醇味；然后将活化好的树脂均匀装入中压玻璃层析柱中，使得树脂高度为层析柱的3/5；
3.2)然后将层析柱的进液管口连接恒流泵，出液管口连接紫外检测器，就组装成喜树碱层析柱分离系统。
4)树脂柱纯化透过液
4.1)将步骤2)中收集到的透过液B，用恒流泵泵入步骤3)中制好的层析柱中，吸附树脂体积(L)与透过液B体积(L)之比为1∶10，泵入流速为4BV/h，分别收集过柱液和吸附了喜树碱的层析柱，对收集的过柱液，减压浓缩后与下批次的A溶液合并，乙醇回收作为溶剂；对于吸附了喜树碱的层析柱，先用5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，用于制备发酵有机肥料；
4.3)然后用95％(体积分数)的乙醇溶液洗脱已被纯净水经洗涤后的层析柱，洗脱剂用量5BV，控制流速为3BV/h，收集紫外吸收波长为254nm处的乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液置于旋转蒸发仪内浓缩，浓缩温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩液过孔径为0.45μm的微孔滤膜，得到喜树碱浓缩液C。
4.4)而经95％乙醇洗脱的层析柱树脂，先用5BV的、质量分数为5％的NaOH的溶液，以2BV/h的速度进行再生，然后用纯水洗涤至中性。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液静置后过滤重新利用处理树脂。对于收集的再生层析柱树脂，用于下批次喜树碱的吸附。
5)制备透过色谱柱的喜树碱溶液
将步骤4)中得到的喜树碱浓缩液C，用制备液相色谱仪进行分离制备，浓缩液(L)与色谱柱填料量(g)比为1∶50，流动相的体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为20mL/min，收集出峰时间为6～10min的制备液，得到喜树碱制备液D；
6)制备喜树碱结晶
将步骤5)中得到的喜树碱制备液D浓缩至原溶液的1/5后，用乙酸乙酯萃取一次，用量为浓缩液的2.5倍，收集萃余液与下批次的滤液A合并。而萃取液置于旋转蒸发仪内，再次浓缩，温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩至萃取液体积的1/10后收集乙酸乙酯用于下批次的萃取，而浓缩液置于温度为-5℃，绝对真空度为300Pa的条件下冷冻干燥12h，即制备出喜树碱冻干粉。
最后HPLC检测纯度达93.42％。
实施例2：
一种喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：由以下步骤构成：
1)喜树碱溶液过硅藻土除杂
1.1)将市售的喜树碱浸膏(含10％的喜树碱)300g切成小块，置于5L的烧杯中，料液比为1∶10(g∶mL)，用3L纯度为95％的乙醇搅拌溶解5小时；
1.2)将硅藻土均匀铺在布氏漏斗中，其厚度为2cm；
1.3)将溶解后的喜树碱溶液用布氏漏斗过滤，去掉其中的固体杂质等，得滤液A备用；收集滤渣与下批次喜树碱浸膏混合溶解过滤；
2)膜分离器对喜树碱溶液除杂
将步骤1)中所得的滤液A，过膜分离器，选用截留分子量为1万的超滤膜，在表压为0.2MPa下进行超滤，直至超滤截留液体积降低至滤液A体积的1/10时止，分别收集截留液和透过液B，截留液里含溶解性淀粉和蛋白质，浓缩干燥后用于饲料蛋白添加剂；
3)制备大孔吸附树脂柱
3.1)将HPD722树脂进行活化∶取料液比(g∶mL)为1∶10的HPD722树脂与95％的乙醇，用95％乙醇浸泡树脂24小时，充分溶胀后，用去离子水洗涤至无醇味；然后将活化好的树脂均匀装入中压玻璃层析柱中，使得树脂高度为层析柱的4/5；
3.2)然后将层析柱的进液管口连接恒流泵，出液管口连接紫外检测器，就组装成喜树碱层析柱分离系统。
4)树脂柱纯化透过液
4.1)将步骤2)中收集到的透过液B，用恒流泵泵入步骤3)中制好的层析柱中，吸附树脂体积(L)与透过液B体积(L)之比为1∶20，泵入流速为2BV/h，分别收集过柱液和吸附了喜树碱的层析柱，对收集的过柱液，减压浓缩后与下批次的A溶液合并，乙醇回收作为溶剂；对于吸附了喜树碱的层析柱，先用5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，用于制备发酵有机肥料；
4.3)然后用95％(体积分数)的乙醇溶液洗脱已被纯净水经洗涤后的层析柱，洗脱剂用量6BV，控制流速为2BV/h，收集紫外吸收波长为254nm处的乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液置于旋转蒸发仪内浓缩，浓缩温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩液过孔径为0.22μm的微孔滤膜，得到喜树碱浓缩液C。
4.4)而经95％乙醇洗脱的层析柱树脂，先用5BV的、质量分数为5％的NaOH的溶液，以2BV/h的速度进行再生，然后用纯水洗涤至中性。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液静置后过滤重新利用处理树脂。对于收集的再生层析柱树脂，用于下批次喜树碱的吸附。
5)制备透过色谱柱的喜树碱溶液
将步骤4)中得到的喜树碱浓缩液C，用制备液相色谱仪进行分离制备，浓缩液(L)与色谱柱填料量(g)比为1∶70，流动相的体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为25mL/min，收集出峰时间为6～10min的制备液，得到喜树碱制备液D；
6)制备喜树碱结晶
将步骤5)中得到的喜树碱制备液D浓缩至原溶液的1/5后，用乙酸乙酯萃取一次，用量为浓缩液的3倍，收集萃余液与下批次的滤液A合并。而萃取液置于旋转蒸发仪内，再次浓缩，温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩至萃取液体积的1/8后收集乙酸乙酯用于下批次的萃取，而浓缩液置于温度为-5℃，绝对真空度为100Pa的条件下冷冻干燥12h，即制备出喜树碱冻干粉。
最后检测纯度达98.21％。
实施例3：
一种喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：由以下步骤构成：
1)喜树碱溶液过硅藻土除杂
1.1)将市售的喜树碱浸膏(含10％的喜树碱)300g切成小块，置于5L的烧杯中，料液比为1∶10(g∶mL)，用3L纯度为90％的乙醇搅拌溶解5小时；
1.2)将硅藻土均匀铺在布氏漏斗中，其厚度为2cm；
1.3)将溶解后的喜树碱溶液用布氏漏斗过滤，去掉其中的固体杂质等，得滤液A备用；收集滤渣与下批次喜树碱浸膏混合溶解过滤；
2)膜分离器对喜树碱溶液除杂
将步骤1)中所得的滤液A，过膜分离器，选用截留分子量为1万的超滤膜，在表压为0.05MPa下进行超滤，直至超滤截留液体积降低至滤液A体积的1/8时止，分别收集截留液和透过液B，截留液里含溶解性淀粉和蛋白质，浓缩干燥后用于饲料蛋白添加剂；
3)制备大孔吸附树脂柱
3.1)将HPD722树脂进行活化∶取料液比(g∶mL)为1∶10的HPD722树脂与95％的乙醇，用95％乙醇浸泡树脂24小时，充分溶胀后，用去离子水洗涤至无醇味；然后将活化好的树脂均匀装入中压玻璃层析柱中，使得树脂高度为层析柱的4/5；
3.2)然后将层析柱的进液管口连接恒流泵，出液管口连接紫外检测器，就组装成喜树碱层析柱分离系统。
4)树脂柱纯化透过液
4.1)将步骤2)中收集到的透过液B，用恒流泵泵入步骤3)中制好的层析柱中，吸附树脂体积(L)与透过液B体积(L)之比为1∶30，泵入流速为5BV/h，分别收集过柱液和吸附了喜树碱的层析柱，对收集的过柱液，减压浓缩后与下批次的A溶液合并，乙醇回收作为溶剂；对于吸附了喜树碱的层析柱，先用5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，用于制备发酵有机肥料；
4.3)然后用95％(体积分数)的乙醇溶液洗脱已被纯净水经洗涤后的层析柱，洗脱剂用量6BV，控制流速为4BV/h，收集紫外吸收波长为254nm处的乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液置于旋转蒸发仪内浓缩，浓缩温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩液过孔径为0.45μm的微孔滤膜，得到喜树碱浓缩液C。
4.4)而经95％乙醇洗脱的层析柱树脂，先用5BV的、质量分数为5％的NaOH的溶液，以4BV/h的速度进行再生，然后用纯水洗涤至中性。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液静置后过滤重新利用处理树脂。对于收集的再生层析柱树脂，用于下批次喜树碱的吸附。
5)制备透过色谱柱的喜树碱溶液
将步骤4)中得到的喜树碱浓缩液C，用制备液相色谱仪进行分离制备，浓缩液(L)与色谱柱填料量(g)比为1∶70，流动相的体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为25mL/min，收集出峰时间为6～10min的制备液，得到喜树碱制备液D；
6)制备喜树碱结晶
将步骤5)中得到的喜树碱制备液D浓缩至原溶液的1/5后，用乙酸乙酯萃取一次，用量为浓缩液的3倍，收集萃余液与下批次的滤液A合并。而萃取液置于旋转蒸发仪内，再次浓缩，温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩至萃取液体积的1/10后收集乙酸乙酯用于下批次的萃取，而浓缩液置于温度为-5℃，绝对真空度为200Pa的条件下冷冻干燥12h，即制备出喜树碱冻干粉。
最后检测纯度达97.38％。
Claims (2)
1.一种喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：由以下步骤构成：
1)喜树碱溶液过硅藻土除杂
1.1)取料液比为1∶5～1∶10的市售喜树碱浸膏与浓度为65％～95％的乙醇，将喜树碱浸膏用浓度为65％～95％的乙醇搅拌溶解；所述料液比中的重量单位为g时，体积单位为mL；
1.2)将硅藻土均匀铺在布氏漏斗中，其厚度为1～2cm；
1.3)将溶解后的喜树碱溶液过滤，去掉其中的固体杂质，得滤液A备用，收集滤渣与下批次喜树碱浸膏混合溶解过滤；
2)膜分离器对喜树碱溶液除杂
将步骤1)中所得的滤液A，过膜分离器，选用截留分子量为1～3万的超滤膜，在表压为0.05～0.2MPa下进行超滤，直至超滤截留液体积降低至滤液A体积的1/5～1/10时止，分别收集截留液和透过液B，截留液里含溶解性淀粉和蛋白质，浓缩干燥后用于饲料蛋白添加剂；
3)制备大孔树脂层析柱
3.1)将LX-60或HPD722树脂进行活化：取料液比为1∶8～10的LX-60或HPD722树脂与浓度为90％～95％的乙醇，用浓度为90％～95％乙醇浸泡树脂12～24小时，充分溶胀后，用去离子水洗涤至无醇味；然后将活化好的树脂均匀装入中压玻璃层析柱中，使得树脂高度为层析柱的3/5～4/5；
所述料液比中的重量单位为g时，体积单位为mL；
3.2)然后将层析柱的进液管口连接恒流泵，出液管口连接紫外 检测器，就组装成喜树碱层析柱分离系统；
4)树脂柱纯化透过液
4.1)将步骤2)中收集到的透过液B，用恒流泵泵入步骤3)中制好的层析柱中，吸附树脂体积与透过液B体积之比为1∶10～30，泵入流速为2～6BV/h，分别收集过柱液和吸附了喜树碱的层析柱，对收集的过柱液，减压浓缩后与下批次的A溶液合并，乙醇回收作为溶剂；对于吸附了喜树碱的层析柱，先用2～5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，用于制备发酵有机肥料；
4.2)然后用浓度为90％～95％的乙醇溶液洗脱已被纯净水经洗涤过的层析柱，洗脱剂用量2～8BV，控制流速为2～6BV/h，收集紫外吸收波长为254nm处的乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液置于旋转蒸发仪内浓缩，浓缩温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩液过孔径为0.22～1.0μm的微孔滤膜，得到喜树碱浓缩液C；
4.3)而经浓度为90％～95％乙醇洗脱的层析柱树脂，先用2～5BV的、质量分数为5％的NaOH的溶液，以1～2BV/h的速度进行再生，然后用纯水洗涤至中性；分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液静置后过滤重新利用处理树脂；对于收集的再生层析柱树脂，用于下批次喜树碱的吸附；
5)制备透过色谱柱的喜树碱溶液
将步骤4)中得到的喜树碱浓缩液C，用制备液相色谱仪进行分离制备，浓缩液与色谱柱填料量的体积重量比为1∶30～1∶100，流动 相的体积比为甲醇∶水＝70∶30，流速为20～25mL/min，收集出峰时间为6～10min的制备液，得到喜树碱制备液D；
所述浓缩液与色谱柱填料量的体积重量比中，色谱柱填料量单位为g时，浓缩液的单位为L；
6)制备喜树碱结晶
将步骤5)中得到的喜树碱制备液D浓缩至原溶液的1/5～1/4后，用乙酸乙酯萃取一次，用量为浓缩液的2～3倍，收集萃余液与下批次的滤液A合并；而萃取液置于旋转蒸发仪内，再次浓缩，温度设定为50℃，压力为0.1MPa，浓缩至萃取液体积的1/10～1/8后收集乙酸乙酯用于下批次的萃取，而浓缩液置于温度为0～-15℃，绝对真空度为100～300Pa的条件下冷冻干燥12～24h，即制备出喜树碱冻干粉，纯度达90％以上。
2.根据权利要求1所述的喜树碱的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤5)中过完树脂的洗脱液浓缩后，使用型号为C18-SPS-100A-9μm的制备色谱柱设备进行制备。
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