CN102276716B - 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法 - Google Patents
一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法，其特点是：处理阶段用NaOH溶液、H2O2溶液和脱脂剂处理洗净的牛蛙皮分别除去非胶原蛋白、色素和脂肪，提取阶段以乙酸溶液和乙酸-蛋白酶分别浸提得到酸溶胶原和酶溶胶原，纯化阶段利用盐多次盐析，最后透析冻干得到海绵状牛蛙皮胶原。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图表明牛蛙皮胶原含有分子量为30万、20万和10万的γ链、β链和α链，其中α链为两条，很好地保留了胶原的三股螺旋结构。提取过程中除特殊说明外操作温度均在15℃以下，得到的产品干重提取率不低于80％，色白，品质优良。
Description
技术领域
本发明涉及一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法，属于生物医用材料的制备领域。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，占体内蛋白质总量的25％-30％，是腱、软骨、皮肤和血管的主要成分，I型胶原蛋白分子由三条肽链组成，两条αI链、一条α∏链，三条肽链以特有的左手螺旋相互缠绕构成右手螺旋，分子结构显现独特的甘氨酸-X-Y(X、Y为其他种类的氨基酸，多为脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸)周期结构。胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性，因此，胶原蛋白在医学、美容、化妆品、保健品和食品中有着广泛的应用。
迄今为止，猪、牛等陆生动物的皮和跟腱仍然是提取未变性天然胶原的主要原材料。但是由于疯牛病和口蹄疫等动物传染性疾病全球肆虐，并且尚无有效治疗方法，以致人们对使用从陆生动物组织中提取的未变性天然胶原产生恐慌。于是，寻求更高质量和更高安全性的提取未变性天然胶原的原材料迫在眉睫。目前，水产动物组织中提取胶原蛋白已经成为可行之径，其胶原相比陆生动物在安全性上具有更大的优势，同时，它还具有陆生动物所没有的一些特点，因此，水产动物已经成为未变性天然胶原提取材料的新目标。
牛蛙，属脊椎动物门，两栖纲蛙科中的大型种类，体重可超过1000克。牛蛙的营养价值非常丰富，每100克蛙肉中含蛋白质19.9克，脂肪0.3克，是一种高蛋白质、低脂肪、低胆固醇营养食品，备受人们的喜爱。牛蛙养殖业日益壮大，牛蛙产量逐年增加。牛蛙的皮肤组织重量约占其体量的5％，食用过程中通常被废弃，造成了大量的生物资源的浪费。从遗弃的牛蛙皮肤组织中提取优质未变性天然胶原，深度开发高附加值产品，不仅可以解决废弃物的污染问题，更重要的是，生物质资源的综合开发和高值利用，将产生巨大的环境效益和社会效益。
目前，未变性天然胶原蛋白的提取方法主要有酸法、碱法、酶法和结合法，如CN101979654A和CN101948900A分别介绍了以鱼皮和牛软骨为原料的酶法提取胶原蛋白的方法，CN1385489A介绍了一种从鸡胸软骨中碱法提取胶原蛋白的方法，CN1155549A介绍了一动物结缔组织为原料的酸法提取胶原蛋白的方法，此外，人们还将上述几种方法结合使用来提取胶原。不过，上述方法的原料多为哺乳动物或鱼类，鲜有涉及两栖类动物，同时，单一方法提取未变性天然胶原蛋白的产率均不太理想。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法，其特点是该方法采用预处理、提取和纯化三步：预处理用氢氧化钠溶液、双氧水溶液和脱脂剂处理分别除去非胶原蛋白、色素和脂肪；提取则用乙酸溶液和乙酸-蛋白酶先后提取得到酸溶胶原和酶溶胶原溶液；纯化则是利用多次盐析后冻干得到海绵状牛蛙皮胶原。较好地保存了胶原蛋白的三股螺旋结构及其生理功能。提高了牛蛙皮废弃物的附加值，牛蛙皮未变性天然胶原蛋白的提取率不低于80％。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为摩尔份数。
从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法包括以下步骤：
(1)原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1∶20-40，浓度为0.05-0.2M/LNaOH溶液处理24-48h，维持匀速搅拌，中途换液2-5次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1∶5-30，体积浓度为1％-8％的H2O2溶液处理12-48h，维持匀速搅拌，中途换液2-4次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1∶10-50，体积浓度为30％-70％脱脂剂处理12-24h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
(2)未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮60-100重量份用浓度为0.1-2M/L乙酸溶液浸提24-48h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为0.1-2M/L乙酸溶液复提6-24h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液；向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为0.1-2M/L乙酸溶液，并加入浓度为1％-5％蛋白酶浸提24-48h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
(3)未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为0.6-4M/L盐分别盐析，在温度4℃以下，以5000-20000rpm离心10-15min，沉淀用浓度为0.1-2M/L乙酸溶液复溶，盐析2-4次；将得到的沉淀分别溶于浓度为0.1-2M/L乙酸中，以浓度为0.1-1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2-3天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原；
(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。
脱脂剂为异丙醇、丁醇和丙酮中的至少一种。
蛋白酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶、真菌复合酶和537蛋白酶中的至少一种。
盐为氯化钠、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的任一种。
从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法制备得到未变性天然胶原。
未变性天然胶原用于医学、美容、化妆品、保健品和食品领域。
性能测试
未变性天然牛蛙皮胶原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图1所示，结果表明牛蛙皮胶原含有分子量为30万、20万和10万的γ链、β链和α链，其中α链为两条，很好地保存了胶原蛋白的三股螺旋结构。
本发明有如下优点：
1、预处理方法能很大限度地除去非胶原蛋白和色素；
2、分别使用酸法和酸酶结合法提取胶原，干重提取率不低于80％，产品色纯白，品质优良；
3、制得的天然胶原不同于水解胶原，它具有独特的生物相容性、低抗原性和生物降解性；
4、所有流程均在低温下操作，保留了胶原特有的三股螺旋结构，保证了胶原蛋白的活性和结构的完整性。
附图说明
图1.为未变性天然牛蛙皮胶原蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图
1为酸溶牛蛙皮未变性天然胶原，2为酶溶牛蛙皮未变性天然胶原，其中，Mark为标准样，分子量分别为66kDa、97.4kDa、116kDa、200kDa。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：
(1)原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1∶20，浓度为0.05M/L NaOH溶液处理48h，维持匀速搅拌，中途换液5次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1∶5，体积浓度为8％的H2O2溶液处理12h，维持匀速搅拌，中途换液2次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1∶10，体积浓度为30％异丙醇处理24h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
(2)未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮60g(干重15.6g)用浓度为0.1M/L乙酸溶液浸提24h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为0.1M/L乙酸溶液复提6h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液，向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为0.1M/L乙酸溶液，并加入浓度为1wt％胃蛋白酶浸提48h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
(3)未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为0.6M/L氯化钠分别盐析，在温度4℃以下，以20000rpm离心10分钟，沉淀用浓度为0.1M/L乙酸溶液复溶，盐析2次；将得到的沉淀分别溶于浓度为0.5M/L乙酸中，以浓度为0.1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白12.8g，干重提取率为82.05％；
(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。
实施例2：
(1)原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1∶40，浓度为0.2M/L NaOH溶液处理24h，维持匀速搅拌，中途换液2次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1∶30，体积浓度为1％的H2O2溶液处理48h，维持匀速搅拌，中途换液4次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1∶50，体积浓度为70％丁醇处理12h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
(2)未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮100g(干重26.0g)用浓度为2M/L乙酸溶液浸提48h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为2M/L乙酸溶液复提24h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液，向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为2M/L乙酸溶液，并加入浓度为5wt％酸性蛋白酶浸提24h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
(3)未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为4M/L硫酸铵分别盐析，在温度4℃以下，以5000rpm离心15分钟，沉淀用浓度为2M/L乙酸溶液复溶，盐析4次；将得到的沉淀分别溶于浓度为2M/L乙酸中，以浓度为1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理3天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白20.91g，干重提取率为80.44％；
(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。
实施例3：
(1)原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1∶30，浓度为0.1M/L NaOH溶液处理36h，维持匀速搅拌，中途换液4次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1∶15，体积浓度5％的H2O2溶液处理24h，维持匀速搅拌，中途换液3次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1∶30，体积浓度为50％丙酮处理18h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
(2)未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮80g(干重20.8g)用浓度为1M/L乙酸溶液浸提36h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为1M/L乙酸溶液复提12h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液，向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为1M/L乙酸溶液，并加入浓度为3wt％真菌复合酶浸提36h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
(3)未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为2M/L硫酸钠分别盐析，在温度4℃以下，以10000rpm离心12分钟，沉淀用浓度为1M/L乙酸溶液复溶，用浓度为2M/L硫酸钠盐析3次；得到的沉淀分别溶于浓度为1M/L乙酸中，以浓度为0.5M/L的乙酸溶液为透析液透析处理3天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白17.36g，干重提取率为83.46％；
(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。
实施例4：
(1)原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1∶30，浓度为0.1M/L NaOH溶液处理48h，维持匀速搅拌，中途换液3次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1∶20，体积浓度为3％的H2O2溶液处理24h，维持匀速搅拌，中途换液3次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1∶40，含30％异丙醇和20％丁醇的脱脂剂处理24h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
(2)未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮70g(干重18.2g)用浓度为0.5M/L乙酸溶液浸提36h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为0.5M/L乙酸溶液复提12h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液，向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为0.5M/L乙酸溶液，并加入浓度为1wt％胃蛋白酶和2wt％537酶浸提36h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
(3)未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为0.7M/L硫酸镁分别盐析，在温度4℃以下，以20000rpm离心10分钟，沉淀用浓度为0.5M/L乙酸溶液复溶，用浓度为0.7M/L硫酸镁盐析2次；将得到的沉淀分别溶于浓度为0.5M/L乙酸中，以浓度为0.1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白15.45g，干重提取率为84.87％；
(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行。
Claims (1)
1.一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）原料预处理
将新鲜牛蛙皮除去肌肉、脂肪、血管，洗净，挤干，切碎；加入料液比为1:20-40，浓度为0.05-0.2mol/L NaOH溶液处理24-48h，维持匀速搅拌，中途换液2-5次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至8-12，加入料液比为1:5-30，体积浓度为1%-8%的H2O2溶液处理12-48h，维持匀速搅拌，中途换液2-4次，将牛蛙皮取出，冲洗数次，调节pH至6.0-6.5，用料液比为1:10-50，体积浓度为30%-70%脱脂剂处理12-24h，维持匀速搅拌，取出，冲洗，纯水浸泡过夜，挤干，备用；
（2）未变性天然胶原的提取
将上述预处理所得的牛蛙皮60-100重量份用浓度为0.1-2mol/L乙酸溶液浸提24-48h，维持匀速搅拌，未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为0.1-2mol/L乙酸溶液复提6-24h，得到酸溶牛蛙皮胶原溶液，向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为0.1-2mol/L乙酸溶液，并加入浓度为1wt%-5wt%蛋白酶浸提24-48h，维持匀速搅拌，得到酶溶牛蛙皮胶原溶液；
（3）未变性天然胶原的纯化
将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为0.6-4mol/L盐分别盐析，在温度4℃以下，5000-20000rpm离心10-15分钟，沉淀用浓度为0.1-2mol/L乙酸溶液复溶，盐析2-4次；将得到的沉淀分别溶于浓度为0.1-2mol/L乙酸中，以浓度为0.1-1mol/L的乙酸溶液为透析液透析处理2-3天，冻干，得到海绵状牛蛙皮胶原；
（4）以上步骤中除特殊说明外，均在温度15℃以下进行；
其中脱脂剂为异丙醇、丁醇和丙酮中的至少一种；蛋白酶为酸性蛋白酶、真菌复合酶中的至少一种；盐为氯化钠、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁中的任一种。
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