CN1814756A - 一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法，其步骤是首先对骨组织用金刚沙片切锯成1～2cm的厚度，后放入固定液中，保存；其次是冲洗好的样品进行酒精梯度脱水；第三是脱水完成后，放入渗透中间液，后放入渗透液，间歇抽真空；第四是将渗透好的组织放入包埋瓶中，加入新鲜包埋液，放入冰箱中聚合；第五是聚合完成后，破碎包埋瓶，取出包埋块，在硬组织切片机上进行切片，切片附于载玻片上，干燥；第六是染色处理。本发明简单易行，抗原和酶活性保存完好，冷凝酯渗透好，聚合后硬度高，易于切片，后期容易脱掉，染色后效果好。

Description

一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法

                            技术领域

本发明涉及一种硬组织低温包埋剂(冷凝酯PMG)的制备方法，该材料广泛应用于医学、材料学、生物学等领域的研究。

                            背景技术

国外(主要集中在北欧国家)硬组织切片发展较早，80年代在许多实验室已开展了此项技术，一直都是用甲基丙稀酸甲脂(MMA)常规包埋方法(30度～40度聚合)，甲基丙稀酸甲脂(MMA)可以非常容易而且完全脱掉，制片后染色结果优良，形态细节好(Erben 1997，Embedding of bone samples inmethylmethacrylate：an improved suitable for bonehistomorphometry，histockhemistry，and immunohistochemistry.J HistochemCytochem)。可以认为甲基丙稀酸甲脂(MMA)是目前作为硬组织包埋的最适合材料。但包埋聚合时产生的高温对组织的损伤和抗原的损失(Wolf E，Roser K，Hahn M，etal 1992.Emzy me and immunohistochemistry on undecalcifed bone andbone marrow biopsies after embedding in pladtic：a new embeddng method for routineapplication.VirchowsArch A Pathol Anat Histopathol)无法做如核蛋白作为抗原和所有酶的制片(O.Laboux，L-G.Ste-Marie，F.H.Glorieux，and A.Nanci.QuantitativeImmunogold Labeling of bone Sialoprotein and Osteopontin inMethyulmethacrylate-embedded Rat bone)，低温包埋是21世纪后期才开始有人专门进行研究，2000年后偶尔可见相关文献报道，大多是用甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA或GMA)进行低温包埋，以德国Heraeus-kulzer公司研制的产品使用最多，如Technovit7100；还有美国SPI公司的Low-acid GMA，都是这种类型的低温包埋产品，但效果不是很理想，其缺陷是明显的：要切出0.5～1um薄片才能染色，而且要求样品很小，不适合较大一点的骨齿等硬组织的切片，由于甲基丙烯酸羟乙基酯无法用有机溶液脱掉，免疫组化及一般病理染色后的敏感性和清晰度都较差(Saito C，Hayashi M，Sakai A，Fujie M，Kuroiwa H，Kuroiwa T 1998 Improvedsensitivity for high resolution in situ hybridization using resin extraction ofmethylmethacrylate embedded material.Biootechnic Histochem)。近年Heraeus-kulzer公司推出了一种新产品Technovit9100NEW，它的主要成分是MMA可低温包埋聚合，在国外文献中已有实验室开始试用这种产品，它的配方成分复杂，主要是加入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)粉剂，以及通过调节剂减缓聚合的速率，它是目前较成功的低温包埋材料。

国内各主要骨科研究所及实验室，各家口腔生物学实验室以及一些应用了硬组织包埋技术的材料实验室，由于各种原因，都只进行MMA常规包埋，做一般常规染色，免疫组化还是通过脱钙，石蜡包埋制片。几乎没有硬组织低温包埋方面的研究，更没有研制出相应的低温包埋材料。这一领域的探索比较落后，国内的病理技术人员应共同努力，迎头赶上。而有机材料的生产厂家更应多协作，开发出高质量的包埋产品，以适应病理技术工作的需要。

                            发明内容

本发明的目的在于提供一种硬组织低温包埋——冷凝酯(PMG)的制备方法，方法易行，操作简单，成本低廉，冷凝酯渗透好，后期容易脱掉，染色后效果好。

PMG是一种高分子聚合材料，成分是甲基丙稀酸甲脂(MMA)，在双级引发剂：过氧化苯甲酰(BPO)和N，N-二甲基苯胺的作用下，能在-20～-10℃聚合成透明硬块。作为硬组织(骨，齿，金属，磷酸钙，陶瓷等)的包埋材料，冷凝酯能有效保护组织，特别是生物组织中的蛋白抗原和酶能在低温中得以保持活性，为后期做各种样品实验(硬组织切片，磨片，超薄切片，激光显微切割等)提供完整可信的结果；同时冷凝酯可以从组织切片中完全脱掉，不影响样品的染色和处理；甚至可以对软组织进行低温包埋，低温切片，从而做出效果较好的酶组化学的制片。

硬组织(骨，齿等)病理切片通常是通过脱掉组织中的矿物质，使其变软，再石蜡包埋切片，可进行各种染色以及免疫组化，但无法观察到组织的矿化情况，更不能做和钙等矿物质有关的免疫组化以及酶化学，另外，脱矿时间较长，会对组织产生损伤，影响染色效果。

近年来，国内有些科研机构购买了硬组织切片机，这使骨不脱钙就进行切片成为可能，同时也对样品处理提出了不同的要求，特别是包埋材料的选择尤为重要。因为骨齿样品硬度很高，要用聚合后硬度较高的有机树脂来包埋，国内外实验室普遍使用的是甲基丙稀酸甲脂(MMA)，甲基丙稀酸甲脂单体小分子渗透较快，聚合后硬度高，有利于硬组织切片机切出薄片(5um)，可以进行常规染色，特别是关于骨组织的一些特染，甲基丙稀酸甲脂还有一个优点：容易脱掉，有利于制出高质量的染色片。但是，甲基丙稀酸甲脂的缺点也是明显的：聚合过程产生热量，损伤组织，不能做免疫组化和酶组化。而这种材料又不能在低温下(零度以下)聚合，无法避免它的缺陷。近来有人试用一些用于电镜样品包埋的树脂(环氧树脂，甲基丙烯酸羟乙基酯等)，但这些材料包埋后都不能脱掉，染色效果差。

申请人于2003年开始着手研制一种材料，它应该对组织渗透好而快，能在低温下聚合，且聚合后硬度高，可以制出优质的薄片(4um)，能进行各种染色，特别是免疫组化和酶组化学染色。经过反复实验比较，终于制成了针对于病理骨齿硬组织制片的包埋材料——冷凝酯(PMG)，目前国内已开展硬组织切片的几家实验室均未使用类似产品。冷凝酯(PMG)的研制成功使硬组织不脱钙进行病理研究向前跨越了一大步。其制备步骤如下：

1.取样：要求骨齿组织厚度为1～2cm。

2.固定：普通染色和免疫组化的固定方法不同，如要同一样品做电镜，需加入戊二醛，温度保持在4℃。

3.脱水酒精梯度(30％-100％)脱水，在4℃下进行。

4.渗透冷凝酯/二甲苯(1～2小时)，冷凝酯/聚乙二醇-400(1～2小时)，温度为4℃。

5.包埋冷凝酯/聚乙二醇-400/N N-二甲基苯胺，-20℃包埋，聚合时间为3～5天。

6.切片将聚合好的包埋块放在硬组织切片机上进行切片，也可在冷冻超薄切片机(限小包埋块)，切片厚度为5um，当然也可利用超薄切片机上进行超薄切片，以用作透射电镜观察。5um切片附于明胶镀膜过的载玻片上，在37℃温箱中干燥48小时。

7.染色处理可进行各种常规染色和做免疫组化。以免疫组化染色为例：

将切片放入乙二醇乙醚醋酸酯(MEA)，时间为2小时，中间应更换乙二醇乙醚醋酸酯(MEA)在二甲苯中放置20分钟，中间更换二甲苯二次，切片进行酒精梯度回水(100％-95％-90％-85％-70％-60％-50％-30％-水)，然后可进行相应的免疫组化染色。

现将冷凝酯(PMG)，常规甲基丙稀酸甲脂(MMA)和甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)

三种材料包埋的骨样品，在聚合温度，硬度和免疫组化反应活性三方面作比较：

                   表1.材料的聚合温度(步骤5)

材料	冷凝酯	甲基丙稀酸甲脂	甲基丙烯酸羟乙基酯
				聚合温度	-20℃-18℃	30℃-42℃	-10℃-4℃

                          表2.聚合后的硬度(步骤6)

材料	冷凝酯	甲基丙稀酸甲脂	甲基丙烯酸羟乙基酯	牙釉质	牙本质	牙骨质
							努普硬度KHN MPa	650～810	640～810	380～420	3430～4310	680	400～430

                      表3.抗体的免疫活性(步骤7)

材料	OC	OPN	PINP	ON	ALP	BSP
							冷凝酯	+++	+++	+++	+++	++	+
甲基丙稀酸甲脂	++	-	-	-	-	-
							甲基丙烯酸羟乙基酯	+	-	-	-	-	-
所用抗体及量	羊抗兔3.3ug/ml	羊抗兔3.3ug/ml	羊抗鼠7ug/ml	羊抗鼠8ug/ml	羊抗鼠10ug/ml	羊抗兔10ug/ml

注：OC-骨钙蛋白 OPN-骨桥蛋白 PINP-I型胶原 N端前肽 ON-骨连蛋白ALP-碱性磷酸酶 BSP-唾液蛋白 +++强阳性 ++阳性 +弱阳性 -无反应

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：用PMG进行低温包埋的处理过程和常规的病理切片的操作过程相似，简单易行，而整个过程花费时间较短，不象石蜡包埋的骨组织需要进行长时间的脱钙(如要进行免疫组化，则需要在乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙，时间更长)，因为各步骤均在低温(-20℃--18℃)中进行，抗原和酶活性保存完好，冷凝酯(PMG)渗透好，聚合后硬度高，易于切片，后期容易脱掉，染色后效果好。

                     具体实施方式

一种硬组织低温包埋剂——冷凝酯(PMG)制备步骤如下：

硬组织低温包埋的技术流程有别于石蜡包埋的样品处理。

1、对骨组织用金刚沙片切锯成1～2cm的厚度，切锯的过程中伴随冷流水冲洗，要求速度快，完成后放入预冷的固定液中，4℃保存。固定液配置及固定步骤分别如下：

1.6％多聚甲醛4℃中24小时——5％蔗糖配制的磷酸缓冲液配制的新鲜冷藏固定液(PH7.4)(配方：1份8％多聚甲醛，1份0.04M磷酸缓冲液和10％蔗糖混合PH7.4，2份双蒸水)24小时——固定完成后，组织在4℃，PH7.4，0.02M磷酸缓冲液中冲洗过夜。

2、冲洗好的样品进行酒精梯度脱水：30％-50％-60％-70％-85％-90％-95％-100％-100％均在4℃中进行，每个浓度时间为2～3小时。间歇抽真空处理(-0.64大气压)，15分钟/小时。

3、脱水完成后，放入渗透中间液(PMG/二甲苯体积比为1∶1)中1小时，4℃，然后放入渗透液(冷凝酯基础原液/聚乙二醇-400体积比为100∶2)渗透液中含有1.5％干燥处理过的过氧化苯甲酰，时间为2小时，温度为4度，间歇抽真空(-0.64大气压)，15分钟/小时。

4、将渗透好的组织放入包埋瓶中，加入新鲜包埋液(冷凝酯基础原液/聚乙二醇-400/N N-二甲基苯胺的体积比为100∶5∶1，内含3％过氧化苯甲酰)，迅速放入-20℃冰箱中，聚合时间为3～5天。

5、聚合完成后，破碎包埋瓶，取出包埋块，在硬组织切片机上进行切片，也可在冷冻超薄切片机(限小包埋块)，切片厚度为5um，当然也可利用超薄切片机上进行超薄切片，以用作透射电镜观察。5um切片附于明胶镀膜过的载玻片上，在37℃温箱中干燥48小时。

6、染色处理，以免疫组化染色为例：将切片放入乙二醇乙醚醋酸酯(MEA)，时间为2小时，中间(中间指2小时之间)应更换乙二醇乙醚醋酸酯(MEA)在二甲苯中放置20分钟，中间(中间指20分钟之间)更换二甲苯二次，切片进行酒精梯度回水(100％-95％-90％-85％-70％-60％-50％-30％-水)，然后可进行相应的免疫组化染色。

冷凝酯(PMG)的基础原液的制备：

1)甲基丙稀酸甲酯(MMA)要经过清洗来去处所含的阻断剂：

a)500ml洗涤液(1升蒸馏水，200g氯化钠，50g氢氧化钠)加入盛有500ml甲基丙稀酸甲酯(二MMA)的分液漏斗中。

b)摇晃5-10次，静置至分层。

c)放弃底部溶液。

d)重复a、b、c步骤二次。

e)用蒸馏水500ml洗涤二次。

f)将甲基丙稀酸甲酯转入塑料瓶中，并加入50g氯化钙。

g)摇晃5～10分钟，吸干甲基丙稀酸甲酯中的水分。

h)用双过滤纸过滤甲基丙稀酸甲酯。

i)放入4℃冰箱中备用。

2)将MMA和甲基丙烯酸羟乙基酯体积比为8∶2混合，放入4℃冰箱中保存。

PMG新鲜液可存放7天，应尽快使用。各项步骤应在实验通风橱中进行。

Claims (3)

1、一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法，它包括下列步骤：

A、对骨组织用金刚沙片切锯成1～2cm的厚度，切锯的过程中流水冲洗，完成后放入预冷的固定液中，4℃保存；

B、冲洗好的样品进行酒精梯度脱水：30％-50％-60％-70％-85％-90％-95％-100％-100％，均在4℃中进行，每个浓度时间为2～3小时，间歇抽真空处理/-0.64大气压，15分钟/小时；

C、脱水完成后，放入渗透中间液/PMG/二甲苯的体积比为1∶1中1小时，4℃，然后放入渗透液/冷凝酯基础原液/聚乙二醇-400体积比为100∶2渗透液中含有1.5％干燥处理过的过氧化苯甲酰，时间为2小时，温度为4℃，间歇抽真空；

D、将渗透好的组织放入包埋瓶中，加入新鲜包埋液/冷凝酯基础原液/聚乙二醇-400/N N-二甲基苯胺的体积比为100∶5∶1，内含3％过氧化苯甲酰，放入-20℃冰箱中，聚合时间为3～5天；

E、聚合完成后，破碎包埋瓶，取出包埋块，在硬组织切片机上进行切片，切片厚度为5um，利用超薄切片机上进行超薄切片，用作透射电镜观察，5um切片附于明胶镀膜过的载玻片上，在37℃温箱中干燥48小时；

F、染色处理，以免疫组化染色，将切片放入乙二醇乙醚醋酸酯，时间为2小时，中间应更换乙二醇乙醚醋酸酯在二甲苯中放置20分钟，中间更换二甲苯二次，切片进行酒精梯度回水：100％-95％-90％-85％-70％-60％-50％-30％-水，进行免疫组化染色。

2、根据权利要求1所述的一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法，其特征在于：固定液配置如下：1.6％多聚甲醛4℃中24小时——5％蔗糖配制的磷酸缓冲液配制的新鲜冷藏固定液，PH7.4，1份8％多聚甲醛，1份0.04M磷酸缓冲液和10％蔗糖混合，PH7.4，2份双蒸水24小时，固定完成后，组织在4℃，PH7.4，0.02M磷酸缓冲液中冲洗过夜。

3、根据权利要求1所述的一种硬组织低温包埋冷凝酯的制备方法，其特征是：冷凝酯的基础原液为：

A、甲基丙稀酸甲酯要经过清洗来去处的阻断剂：

a)500ml洗涤液/1升蒸馏水，200g氯化钠，50g氢氧化钠，加入盛有500ml甲基丙稀酸甲酯的分液漏斗中；

b)摇晃，静置至分层；

c)放弃底部溶液；

d)重复a、b、c步骤二次；

e)用蒸馏水500ml洗涤二次；

f)将甲基丙稀酸甲酯转入塑料瓶中，加入50g氯化钙；

g)摇晃5～10分钟，吸干甲基丙稀酸甲酯中的水分；

h)用双过滤纸过滤甲基丙稀酸甲酯；

i)放入4℃冰箱中备用；

B、将MMA和甲基丙烯酸羟乙基酯的体积比为8∶2混合，放入4℃冰箱中保存。