CN110484610B - 一种促进荧光原位杂交的组合物及杂交液，荧光原位杂交探针工作液、荧光原位杂交方法 - Google Patents

一种促进荧光原位杂交的组合物及杂交液，荧光原位杂交探针工作液、荧光原位杂交方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进荧光原位杂交的组合物及杂交液，荧光原位杂交探针工作液、荧光原位杂交方法，属于分子病理诊断技术领域。本发明中的促进荧光原位杂交的组合物，添加了异硫氰酸胍，异硫氰酸胍能够促进探针中的DNA与样本中的DNA进行结合，提高杂交效率；因此探针工作液能够实现快速杂交、短时杂交。由该组合物制成杂交液，并调整了传统组分氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖的浓度；得到的杂交液在3h内即可完成杂交，并且杂交后仍然具有信号亮度强并且特异性好的特点。

Description

一种促进荧光原位杂交的组合物及杂交液，荧光原位杂交探 针工作液、荧光原位杂交方法
技术领域
本发明涉及一种促进荧光原位杂交的组合物及杂交液，荧光原位杂交探针工作液、荧光原位杂交方法，属于分子病理诊断技术领域。
背景技术
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
目前，国内无论是外周血、骨髓等细胞样本，还是石蜡包埋组织样本，为充分促进探针和目的核酸分子的充分杂交，达到富集探针信号的目的，FISH诊断的实验体系仍为过夜杂交的传统FISH操作流程。对于细胞样本，前期处理简单迅速，无需石蜡包埋、切片及长时间烤片等繁杂的处理过程，而传统过夜杂交FISH实验体系耗时久，效率低下，且不能当天出具样本检验报告，是限制对细胞染色体异常情况做出快速诊断的主要步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进荧光原位杂交的组合物，其可以大幅度的促进荧光原位杂交的效率。
本发明还提供了一种促进荧光原位杂交的杂交液，其对于细胞样本具有较好的促进荧光原位杂交效果。
本发明还提供了一种荧光原位杂交探针工作液，其能够解决细胞样本传统FISH过夜杂交效率低下、不能满足国内临床诊断当天出具样本检验报告的需求的问题。
本发明还提供了一种荧光原位杂交方法，能够在短时间完成杂交，杂交后信号亮度强并且特异性好。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种促进荧光原位杂交的组合物，由甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍组成，所述甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍的摩尔-体积-质量比为0.05-0.15mol：25-35mL：25-30g。
本发明中的促进荧光原位杂交的组合物中添加了异硫氰酸胍，异硫氰酸胍是一种强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，促使核酸物质解聚得到释放，降低双链DNA的Tm值达到促进分子杂交的作用。因此本发明中的组合物能够促进荧光原位杂交的效率，缩短荧光原位杂交时间。
一种促进荧光原位杂交的杂交液，所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为0.5-1.5mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液。
本发明中的快速杂交液，在传统的FISH杂交液的基础上，添加了异硫氰酸胍，因此能够促进荧光原位杂交的效率，缩短荧光原位杂交时间。
若异硫氰酸胍过多易引起荧光信号背景增高且对荧光信号强度提高没有太大作用；若异硫氰酸胍过少会造成荧光信号亮度降低。因此优选的，所述异硫氰酸胍的浓度为1mol/L。
若甲酰胺过多则会造成配制杂交缓冲液时由于液体体积过大，造成配制困难且对荧光信号强度提高没有太大作用；若甲酰胺过少则杂交TM值过高，荧光探针杂交效率低，荧光信号亮度降低。因此优选的，所述甲酰胺的体积浓度为30%。
若硫酸葡聚糖浓度过多对促进荧光信号亮度并没有明显改善作用且容易造成杂交缓冲液粘度过大，对实验实施造成难度；若硫酸葡聚糖浓度过少则会造成荧光信号强度降低。因此优选的，所述硫酸葡聚糖的质量浓度为28%。
若氯化钠和柠檬酸钠过多则溶液离子强度增加则易造成核酸杂交时TM升高；若氯化钠和柠檬酸钠过少则溶液缓冲能力较低，pH值，离子强度等稳定性不能保证。因此优选的，所述缓冲溶液为柠檬酸钠缓冲液，pH为7.3-7.5；所述柠檬酸钠缓冲液中氯化钠的浓度为8.5-9.0g/L，柠檬酸钠的浓度为4.2-4.6 g/L。
本发明中的杂交液中添加了异硫氰酸胍，并调整了传统组分氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖的浓度；得到的杂交液具有较好的杂交效果，无需过夜杂交，仅需3h即可完成杂交，并且杂交后仍然具有信号亮度强并且特异性好的特点。
一种荧光原位杂交探针工作液，所述探针工作液中包括探针和杂交液，所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为0.5-1.5mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液。
本发明中的荧光原位杂交探针工作液中添加了异硫氰酸胍，异硫氰酸胍能够促进探针中的DNA与样本中的DNA进行结合，提高杂交效率；因此探针工作液能够实现快速杂交、短时杂交。优选的，所述探针工作液中探针和杂交液的体积比为0.5-1.5：6.5-7.5。
由于基因组中存在较多的重复序列，这些重复序列会与探针形成非特异性结合，造成结果的错误判读；因此优选的，所述探针工作液中还包括用于封闭样本中DNA重复序列的封闭剂。进一步优选的，所述探针工作液中封闭剂和杂交液的体积比为：0.5-1.5：6.5-7.5。
优选的，所述缓冲溶液为柠檬酸钠缓冲液，pH为7.3-7.5；所述柠檬酸钠缓冲液中氯化钠的浓度为8.5-9.0g/L，柠檬酸钠的浓度为4.2-4.6 g/L。
一种荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
1）制备样本，将探针工作液加至样本需杂交区域；
2）于85-95℃条件下变性反应，然后于53-57℃条件下杂交反应，即可；
所述探针工作液中包括探针和杂交液，所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为0.5-1.5mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液。
本发明的荧光原位杂交方法中使用了包含异硫氰酸胍的探针工作液，在对于细胞样本进行荧光原位杂交时，在3h内即可完成杂交，并且具有较好的荧光原位杂交效果。
本发明中通过实验发现对于本发明中的探针工作液来说，变性条件为90±5℃/2min，杂交条件为55±2℃/3h时，杂交信号强，而其余的变性、杂交条件效果较差。因此，优选的，步骤2）为于85-95℃条件下变性1-3min，然后于53-57℃条件下杂交2.5-2.5h，即可。
本发明中的探针工作液更适合于细胞样本的杂交，因此优选的，所述样本为外周血细胞或骨髓细胞样本。优选的，所述缓冲溶液为柠檬酸钠缓冲液，pH为7.3-7.5；所述柠檬酸钠缓冲液中氯化钠的浓度为8.5-9.0g/L，柠檬酸钠的浓度为4.2-4.6 g/L。
附图说明
图1为本发明试验例1中快速杂交液和传统杂交液FISH结果对比图；
图2为本发明试验例2中快速杂交液快速杂交3h和传统杂交液过夜杂交16h的对比结果图；
图3为本发明试验例3中快速杂交液不同变性、杂交条件下FISH结果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
以下实施例及试验例中所使用的红色探针和绿色探针购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号为CF01247，该对探针用于检测JAK2基因断裂。封闭剂Cot-1DNA购自Invitrogen，货号1996778。NP-40购自北京索莱宝科技有限公司，货号N8031。异硫氰酸胍购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A500244。碳酸乙烯酯购自Sigma-Aldrich，货号E26258。甲酰胺购自AMRESCO，货号：2665C106。硫酸葡聚糖购自Solarbio，货号：109A036。氯化钠购自国药，货号：10019318。柠檬酸钠购自国药，货号：10019418。DAPI购自Solarbio，货号：20140725。
促进荧光原位杂交的组合物的实施例1
本实施例中促进荧光原位杂交的组合物，由甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍组成，所述甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍的摩尔-体积-质量比为0.05-0.15mol：25-35mL：25-30g。
促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1
本实施例中促进荧光原位杂交的杂交液，包括氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍。其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L（两者构成1×SSC，pH为7.4）；甲酰胺的体积浓度为30%；硫酸葡聚糖的质量浓度为28%；异硫氰酸胍的浓度为1mol/L；其余为水。
杂交液的对比例1
本对比例中FISH杂交缓冲液，包括：氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖；其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L（两者构成1×SSC，pH为7.4）；甲酰胺的体积浓度为30%；硫酸葡聚糖的质量浓度为28%；其余为水。
杂交液的对比例2
本对比例中FISH杂交缓冲液，包括：氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖；其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L（两者构成1×SSC，pH为7.4）；甲酰胺的体积浓度为50%；硫酸葡聚糖的质量浓度为10%；其余为水。
杂交液的对比例3
本对比例中FISH杂交缓冲液，包括：氯化钠、柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、碳酸乙烯酯；其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L（两者构成1×SSC，pH为7.4）；硫酸葡聚糖的质量浓度为20%；碳酸乙烯酯的体积浓度为15%；其余为水。
荧光原位杂交探针工作液的实施例1
本实施例中荧光原位杂交探针工作液包括：探针、封闭剂和杂交液，所述杂交液中包括氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L（两者构成1×SSC，pH为7.4）；甲酰胺的体积浓度为30%；硫酸葡聚糖的质量浓度为28%；异硫氰酸胍的浓度为1mol/L；其余为水。
探针为检测JAK2基因断裂的红色探针和绿色探针；封闭剂为Cot-1DNA；红色探针、绿色探针、封闭剂和杂交液以：1 μL红色探针、1 μL绿色探针、1 μL Cot-1DNA、7 μL杂交缓冲液配制得到。
荧光原位杂交方法的实施例1
本实施例中细胞样本快速杂交方法，包括：将探针、封闭剂、快速杂交缓冲液混匀后，加至细胞样本需杂交区域；于85-95℃条件下变性1-3min，然后于53-57℃条件下杂交2.5-2.5h，即可。所述快速杂交缓冲液中包括氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；其中氯化钠的浓度为8.75g/L，所述柠檬酸钠的浓度为4.4 g/L；甲酰胺的体积浓度为30%；硫酸葡聚糖的质量浓度为28%；异硫氰酸胍的浓度为1mol/L。
试验例1
将适用于细胞样本的快速杂交缓冲液的实施例1、FISH杂交缓冲液的对比例1-3同时对于细胞样本进行荧光原位杂交，步骤如下：
1、样本处理
①将2mL-3mL外周血淋巴细胞（肝素钠抗凝）细胞样本放置于离心机（2000rpm）中离心5min，弃上清；
②向细胞悬液中加入10mL的低渗缓冲液（配方为0.075M的KCl）吹打混匀，静置2min，37℃恒温水浴20 min，然后加入固定液（冰乙酸：甲醇为1：3，现配现用）1mL吹打混匀，室温固定10 min；
③再离心5 min，弃上清，加入10mL固定液，吹打混匀，-20℃沉淀> 30 min；
④可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀清洗干净为止（重复洗涤则无需静置30min）。
2、制片
①取制备好的5μL细胞样本悬液滴加到-20℃预冷的载玻片上（需粘附性载玻片），室温下晾干，用10×物镜在倒置显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞数量在100-200个为宜；
②将制备好的细胞样本片于60℃烤片约0.5小时。
注：每个病例至少要多制一张片子备用。剩余的细胞悬液-20℃可保存一个月。
3、样本预处理
①将细胞样本片放入纯水中浸泡5min取出，显微镜下观察细胞样本片，
②若样本片背景干净，此步骤（样本预处理）可省略；若背景杂质较多可继续进行本步骤。
③用去离子水洗涤三次，取出玻片，再将其放入37℃胃蛋白酶溶液（每50mL胃蛋白酶溶液加入1管原位杂交用蛋白酶）中消化30s-2min（可通过预实验确定酶消化效力）。
4、样本脱水
①取出消化后的玻片，将其放入2×SSC中室温浸泡5 min；
②取出玻片，再将其依次放入70%、85%、无水乙醇中各2 min，取出玻片，室温晾干。
5、样本与探针变性、杂交（注意避光）
①配制探针工作液：取1 μL红色探针、1 μL绿色探针、1 μL Cot-1DNA、7 μL杂交缓冲液（促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1、FISH杂交液的对比例1-3）混匀离心，将探针工作液到杂交区域，盖上盖玻片；
②用橡胶水泥封住盖玻片四周；
③将玻片置于杂交仪上，于90℃条件下变性2min，然后于55℃条件下杂交3h。
6、杂交后洗涤（注意避光）
①将盛有洗涤缓冲液I（配方为17.5g/L氯化钠，8.8 g/L柠檬酸钠，0.3% NP-40）的考普林缸放入水浴锅中，预热到72℃±1℃，30 min；
②取出载玻片，小心除去橡胶水泥，将切片置于洗脱液II（配方为17.5g/L氯化钠，8.8 g/L柠檬酸钠，0.1% NP-40）中，浸泡10min至盖玻片自然脱落（或较易去除）；
③将去除盖玻片的载玻片从洗脱液II转移至72℃±1℃的洗涤液I（配方为17.5g/L氯化钠，8.8 g/L柠檬酸钠，0.1% NP-40）中浸泡2min；
④将72℃±1℃洗涤液I中载玻片取出置于室温的洗涤缓冲液II（配方为17.5g/L氯化钠，8.8 g/L柠檬酸钠，0.1% NP-40）中孵育2min；
⑤依次在70%、85%的乙醇溶液中浸泡2min后置于室温晾干（注意避光）。
7、DAPI染色、封片
滴加10 μL DAPI复染液到切片组织上，避免气泡，盖上盖玻片，室温复染约10 min或 -20℃避光复染20 min（若无法及时阅片可置于-20℃储存）。
8、镜检（阅片），荧光显微镜下观察。注：样本切片应-20℃避光储存。
结果如图1所示，其中A为FISH杂交液的对比例1；B为FISH杂交液的对比例2；C为促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1；D为FISH杂交液的对比例3。从图中可以看出，使用本发明中的促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1的杂交效果最好，信号最强、特异性最好。
试验例2
将促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1、FISH杂交液的对比例1同时对于细胞样本进行荧光原位杂交，步骤如下：（其中1-4、6-8步骤同试验例1，此处不再赘述）
1、样本处理：本试验例中使用的细胞样本为外周血淋巴细胞。
2、制片
3、样本预处理
4、样本脱水
5、样本与探针变性、杂交（注意避光）
①配制探针工作液：取1 μL红色探针、1 μL绿色探针、1 μL Cot-1DNA、7 μL杂交缓冲液混匀离心，将探针工作液到杂交区域，盖上盖玻片；
②用橡胶水泥封住盖玻片四周；
③将玻片置于杂交仪上：
适用于细胞样本的快速杂交缓冲液的实施例1：于90℃条件下变性2min，然后于55℃条件下杂交3h；
FISH杂交缓冲液的对比例1：于82℃条件下变性6min，然后于37℃条件下过夜杂交。
6、杂交后洗涤（注意避光）。
7、DAPI染色、封片。
8、镜检（阅片）。
结果如图2所示，其中A为促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1；B为FISH杂交液的对比例1。从图中可以看出，使用本发明中的促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1的杂交效果杂交3h，即能够很好实现细胞样本快速杂交且信号亮度和特异性，能够达到传统过夜杂交效率90%以上。
试验例3
将促进荧光原位杂交的杂交液的实施例1在不同杂交条件下对于细胞样本进行荧光原位杂交，步骤如下：（其中1-4、6-8步骤同试验例1，此处不再赘述）
1、样本处理：本试验例中使用的细胞样本为外周血淋巴细胞。
2、制片
3、样本预处理
4、样本脱水
5、样本与探针变性、杂交（注意避光）
①配制探针工作液：取1 μL红色探针、1 μL绿色探针、1 μL Cot-1DNA、7 μL杂交缓冲液混匀离心，将探针工作液到杂交区域，盖上盖玻片；
②用橡胶水泥封住盖玻片四周；
③将玻片置于杂交仪上，杂交条件分别为：
a-1 ：于80℃条件下变性2min，然后于50℃条件下杂交3h；
a-2 ：于80℃条件下变性2min，然后于55℃条件下杂交3h；
a-3：于80℃条件下变性2min，然后于60℃条件下杂交3h；
b-1：于90℃条件下变性2min，然后于50℃条件下杂交3h；
b-2 ：于90℃条件下变性2min，然后于55℃条件下杂交3h；
b-3：于90℃条件下变性2min，然后于60℃条件下杂交3h。
6、杂交后洗涤（注意避光）。
7、DAPI染色、封片。
8、镜检（阅片）。
结果如图3所示，从图中可以看出，b-2：于90℃条件下变性2min、然后于55℃条件下杂交3h的杂交效果最好，而其他条件下杂交信号较弱，因此本发明中选用90℃条件下变性2min、然后于55℃条件下杂交3h的条件下进行快速杂交。在实际的实验中，变性条件90±5℃/2min、杂交条件55±2℃/3h都可以达到较好的效果。本发明中的快速杂交液和快速杂交方法针对细胞样本能够快速出具诊断结果，提高效率，满足临床样本当天出具报告的需求。

Claims (8)

1.一种促进荧光原位杂交的杂交液，其特征在于：所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为1mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液；所述缓冲液pH为7.3-7.5。
2.根据权利要求1所述的促进荧光原位杂交的杂交液，其特征在于：所述缓冲溶液为柠檬酸钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的促进荧光原位杂交的杂交液，其特征在于：所述柠檬酸钠缓冲液中氯化钠的浓度为8.5-9.0g/L，柠檬酸钠的浓度为4.2-4.6 g/L。
4.一种荧光原位杂交探针工作液，其特征在于：所述探针工作液中包括探针和杂交液，所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为1mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液；所述缓冲液pH为7.3-7.5。
5.根据权利要求4中所述的荧光原位杂交探针工作液，其特征在于：所述探针工作液中还包括用于封闭样本中DNA重复序列的封闭剂。
6.根据权利要求5中所述的荧光原位杂交探针工作液，其特征在于：所述探针工作液中封闭剂和杂交液的体积比为：0.5-1.5：6.5-7.5。
7.一种非诊断目的的荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）制备样本，将探针工作液加至样本需杂交区域；
2）于85-95℃条件下变性反应，然后于53-57℃条件下杂交反应，即可；
所述探针工作液中包括探针和杂交液，所述杂交液中包括甲酰胺、硫酸葡聚糖和异硫氰酸胍；所述异硫氰酸胍的浓度为1mol/L，甲酰胺的体积浓度为25-35%，硫酸葡聚糖的质量浓度为25-30%；余量为缓冲溶液；所述缓冲液pH为7.3-7.5。
8.根据权利要求7所述的非诊断目的的荧光原位杂交方法，其特征在于：步骤2）为于85-95℃条件下变性1-3min，然后于53-57℃条件下杂交2.5-3.5h，即可。
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