CN103512784A - 植物组织切片的制作方法、植物组织切片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种植物组织切片的制作方法、植物组织切片及其应用，属于植物组织切片制作领域，所述方法包括：依次对植物组织样品进行排气、脱水、包埋、修块、切片，得到植物组织切片，所述的脱水，包括：将熔融态的聚乙二醇溶解于超纯水中，制成不同浓度的聚乙二醇溶液；按照所述聚乙二醇溶液浓度由低到高的顺序，依次用所述的不同浓度的聚乙二醇溶液浸润排气后的植物组织样品，最后用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述的样品呈现均一的透明状，得脱水样品；所述的包埋，包括：固定所述脱水样品；用熔融态的聚乙二醇作为包埋剂包埋所述脱水样品，得到聚乙二醇包埋的样品块。该方法简化了制作工艺、无毒害且切片无需进行脱蜡等后续处理。

Description

植物组织切片的制作方法、植物组织切片及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物组织切片的制作方法、植物组织切片及其应用，属于植物组织切片制作领域，特别是涉及一种供光学显微镜观察的植物组织切片的制作方法、该切片及其应用。

背景技术

植物组织切片是通过徒手切取或用切片机切取的动植物组织薄片。供光学显微镜观察用的植物组织切片，其厚度一般为5-10微米，其通常采用石蜡包埋切片制作法制作。

石蜡包埋切片制作法，包括以下步骤：(1)采集、分割样品；(2)杀死与固定：利用药剂如F.A.A固定液等迅速把样品细胞杀死，以保持样品本来的状态和结构；（3）脱水：用脱水剂如酒精等除去样品组织中的水分；（4）透明：用透明剂如二甲苯、氯仿等将脱水剂从样品中除去，使样品透明；（5）浸蜡：用包埋剂石蜡逐渐除去样品的透明剂；（6）包埋：将样品放入包埋盒，用包埋剂石蜡包埋，然后将包埋盒放置低温下冷却，制成蜡块；（7）修块：将已制成的蜡块切成小块，每一小块包含一块样品，然后按照所需的切面切小蜡块，直至观察到样品切面；（8）切片：用烧红的蜡铲把小蜡块底部牢固的粘接在载蜡器上，用切片机切出符合要求的切片备用。上述方法制得的切片，经脱蜡、染色、脱水透明和封片处理后即可制得供光学显微镜观察的玻片标本。

发明人在实现本发明的过程中，发现现有技术至少存在以下问题：

上述方法制作切片时所用的透明剂二甲苯、氯仿等为致癌物，有损操作人员的身体健康；制得的切片必须经过脱蜡工艺，才能制成供光学显微镜观察的玻片标本。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种植物组织切片的制作方法、植物组织切片及其应用。所述技术方案如下：

一方面，提供了一种植物组织切片的制作方法，所述方法包括：依次对植物组织样品进行排气、脱水、包埋、修块、切片，得到植物组织切片，所述的脱水，包括：将熔融态的聚乙二醇溶解于超纯水中，制成不同浓度的聚乙二醇溶液；按照所述聚乙二醇溶液浓度由低到高的顺序，依次用所述的不同浓度的聚乙二醇溶液浸润排气后的植物组织样品，最后用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述的样品呈现均一的透明状，得脱水样品；所述的包埋，包括：固定所述脱水样品；用熔融态的聚乙二醇作为包埋剂包埋所述脱水样品，得到聚乙二醇包埋的样品块。

较佳的，所述的脱水，包括：将熔融态的聚乙二醇溶解于超纯水中，制成几种不同浓度的聚乙二醇溶液，所述的几种不同浓度的聚乙二醇溶液中，聚乙二醇的体积百分比浓度梯度为15-25%；在绝对压力为0.01-1MPa、温度为60-75℃的条件下，按照聚乙二醇浓度由低到高的顺序，依次用所述的几种不同浓度的聚乙二醇溶液浸润所述样品，最后，用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述样品呈现均一的透明状，得到脱水样品。

较佳的，所述包埋，包括：将包埋盒水平放置；将一托底紧靠所述包埋盒内壁放置；迅速沿所述托底与所述包埋盒接触的位置注入少量熔融态的聚乙二醇；待所述聚乙二醇凝固后，继续迅速加入熔融态的聚乙二醇直至其淹没所述托底；将所述脱水样品放入所述包埋盒使其紧靠所述托底；待聚乙二醇开始凝固，所述脱水样品的位置固定后，继续注入熔融态的聚乙二醇至其充满所述包埋盒；将注满聚乙二醇的包埋盒静置，直至聚乙二醇完全凝固后，得到聚乙二醇包埋的样品块。

较佳的，所述脱水和所述包埋中所用的聚乙二醇的分子量为1500-2500。

教教的，所述脱水和所述包埋中所用的聚乙二醇的聚合度为2000，分子量为1800-2200，熔点为49-53℃。

较佳的，所述植物组织样品为0.3cm×0.3cm×0.5cm大小的细长条；所述切片包括：将所述样品固定在切片机的载物台上，调整所述切片机，使其刀片的倾斜角为30-40°，缓慢切取，得植物组织切片。

较佳的，所述修块，包括：破开所述包埋盒，去除多余的聚乙二醇，使所述样品及所述托底露出。

较佳的，所述排气，包括：将所述样品置于超纯水中，常压下煮沸，保持沸腾状态20-45分钟，然后迅速将所述样品转移至15-30℃的超纯水中，常压、室温下浸泡30-60分钟；至少重复进行上述步骤3-5次，得到排气后的样品，所述排气后的样品能自由沉入盛满超纯水的容器的底部。

用去离子水反复冲洗所述切片，得到脱去包埋剂的切片。

另一方面，提供了一种由上述制作方法制成的植物组织切片。

又一方面，提供了一种由上述植物组织切片制备供光学显微镜观察的玻片标本的方法，所述方法包括：脱去切片的包埋剂、将脱去包埋剂的切片制成供光学显微镜观察的玻片标本；所述脱去切片的包埋剂，具体为：用去离子水反复冲洗所述切片，得到脱去包埋剂的切片。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明提供的制作方法采用包埋剂作为脱水剂，在脱水过程中同时实现包埋剂的浸渍，并且，无需进行透明处理即可进行包埋，既简化了切片的制作工艺又避免了使用透明剂对操作人员的危害；由此方法制成的切片经去离子水冲洗后即可用于制备供光学显微镜观察的玻片标本，无需进行脱蜡等后续处理，工艺简单。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为由实施例1提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87.）下观察到的细胞结构图；

图2为由对比例1提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87.）下观察到的细胞结构图；

图3为由实施例1提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87）下观察到的细胞结构图；

图4为由对比例1提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87）下观察到的细胞结构图；

图5为由实施例2提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87）下观察到的细胞结构图；

图6为由对比例2提供的切片制成的玻片标本在63X倍普通光学显微镜（Exposure:200ms;Gain:1.0;Saturation:1.5;Gamma:0.87）下观察到的细胞结构图；

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例提供了一种植物组织切片的制作方法，所述方法包括以下步骤：

步骤（1）：获取植物组织样品；

根据所得切片的用途需要，获取适量植物组织样品，本实施例中，所述植物组织样品为阔叶木杨木的木茎，在体视显微镜下将阔叶木杨木的木茎修整成0.3cm×0.3cm×0.5cm大小、表面平整的细长条，所述细长条即为阔叶木杨木的木茎组织样品；

步骤（2）：用超纯水排出所述样品中的气体，得到排气后的样品；

该步骤中可采用常用的样品排气方法，排出所述样品中的气体，本实施例中排气方法具体包括：

2a、将所述样品置于超纯水中，常压下煮沸，保持沸腾状态20-45分钟，然后迅速将所述样品转移至20℃的超纯水中，常压、室温下浸泡30-60分钟；

2b、反复进行步骤2a，直至所述样品能自由沉入盛满超纯水的容器的底部，若所述样品在进行步骤2a前已经能够自由沉入盛满超纯水的容器的底部，则重复进行步骤2a3-5次，得到排气后的样品。

在所述样品能够自由沉入盛满超纯水的容器的底部后仍然重复进行步骤2a3-5次，能够确保所述样品中的气体能够被尽可能的排空，以便于后续包埋时包埋剂能够完全填充在所述样品的孔隙内，保证所述样品组织硬度均匀，从而确保所得切片中的细胞保持良好的形态。

步骤（3）：用聚乙二醇作为脱水剂为所述排气后的样品脱水，脱水步骤包括：

将熔融态的聚乙二醇溶解于温度不低于其熔融温度的超纯水中，制成不同浓度的聚乙二醇溶液；

按照所述聚乙二醇溶液浓度由低到高的顺序，依次用所述的不同浓度的聚乙二醇溶液浸润排气后的植物组织样品；

最后用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述的样品呈现均一的透明状，得脱水样品；

本实施例所用聚乙二醇的分子量为1500-2500，优选聚乙二醇的聚合度为2000，分子量为1800-2200，熔点为49-53℃（该聚乙二醇购买自北京东方试剂公司），操作步骤如下：

3a、在65℃下预熔聚乙二醇；

3b、将熔融态的聚乙二醇溶解于65℃的超纯水中，制成4种不同浓度的聚乙二醇溶液，所述溶液中聚乙二醇的体积百分比浓度分别为20%、50%、70%、90%；

3c、在绝对压力为0.08MPa、温度为65℃的条件下，用20%的聚乙二醇溶液浸润所述排气后的样品0.5-1h；

接着，在绝对压力为0.06MPa、温度为65℃的条件下，用50%的聚乙二醇溶液在65℃下浸润所述排气后的样品1-1.5h；

然后，在绝对压力为0.04MPa、温度为65℃的条件下，用70%的聚乙二醇溶液在65℃下浸润所述排气后的样品1-2h；

之后，在绝对压力为0.02MPa、温度为65℃的条件下，用90%的聚乙二醇溶液在65℃下浸润所述排气后的样品1-2h；

最后，在绝对压力为0.01MPa、温度为65℃的条件下，用聚乙二醇浸润5-10h，直至所述排气后的样品呈现均一的透明状，得到脱水样品。

预熔温度过高不仅升温时间长而且浪费能源，预熔温度过短无法保证聚乙二醇溶解在同温度下的超纯水中，该温度下预熔聚乙二醇既能保证聚乙二醇的完全溶解在同温度下的超纯水中又能最大限度的缩短升温时间、节约能源；聚乙二醇溶液的浓度梯度设计的不合理会导致样品脱水所需时间过长甚至是脱水不完全，所述的几种不同浓度的聚乙二醇溶液中，聚乙二醇的体积百分比浓度梯度为15-25%时，聚乙二醇的渗透能力较好，脱水效率高，脱水耗时较短，在该浓度梯度范围内优选本实施例的浓度梯度，在该浓度梯度下的聚乙二醇溶液能够保证快速、完全的脱去样品中的水，以保证样品组织硬度的均一；在加压条件下浸润，能够提高浸润效率，进一步缩短脱水时间，但压强过大易对植物细胞造成不同程度的损坏，绝对压力为0.01-1MPa时，既能缩短脱水时间又能够保证植物细胞完好；脱水时，较佳温度范围为60-75℃，当温度过低时，聚乙二醇为固态，当温度过高时，容易导致植物细胞内组分发生反应而变质，不利于获得植物细胞的组分信息。

步骤（4）：用聚乙二醇作为包埋剂包埋所述脱水样品，得到聚乙二醇包埋的样品块；

本实施例所用聚乙二醇的分子量为1500-2500，优选聚乙二醇的聚合度为2000，分子量为1800-2200，熔点为49-53℃，（该聚乙二醇购买自北京东方试剂公司），操作步骤如下：

常压室温下，将包埋盒放置在水平桌面上，本实施例中，所述包埋盒选用普通聚碳酸酯材料制成的包埋盒，其外部尺寸为2.5cm×2.5cm×2.0cm，壁厚0.1cm；

用镊子将一托底紧靠所述包埋盒内壁放置，本实施例中所述托底为0.7cm×0.7cm×0.7cm的立方体木质托底；

迅速沿所述木质托底与所述包埋盒接触的位置注入少量预熔好的聚乙二醇，以使所述木质托底与所述包埋盒固定；

待所述聚乙二醇凝固后，继续迅速加入熔融态的聚乙二醇直至其淹没所述木质托底；

用镊子将上述脱水样品放入所述包埋盒，用镊子小心扶住样品，使其时刻紧靠所述木质托底；

待聚乙二醇开始凝固，所述脱水样品的位置固定后，即可抽出镊子，继续注入聚乙二醇至其充满所述包埋盒，以防止凝固后的样品块中存在塌陷或者气泡，加注过程要迅速以尽量减少气泡的产生，若发现气泡，则需重复该步骤，重新进行包埋；

在常压室温下，将注满聚乙二醇的包埋盒静置直至聚乙二醇完全凝固后，得到聚乙二醇包埋的样品块。为加快聚乙二醇的凝固速度，在其他实施例中可以将注满聚乙二醇的包埋盒放置在4℃下冷藏。

聚乙二醇的分子量过大时，在步骤（3）中容易造成浸润不充分；聚乙二醇的分子量过小时通常为液体不能进行包埋，聚乙二醇的分子量在1500-2500之间时能够保证充分浸润样品，且其常温下为固态，因而能对样品进行包埋。

步骤（5）：对所述样品块进行修块，直至露出所述样品；

破开所述包埋盒，用刀片去除多余的聚乙二醇，使所述样品及所述木质托底露出。

步骤（6）：对所述样品进行切片，得阔叶木杨木的木茎组织横切面切片。

修块后，将所述木质托底连同样品一起固定在切片机的载物台上，调整所述切片机，使刀片的倾斜角为30-40°，缓慢切取5－10μm的薄片，得阔叶木杨木的木茎组织横切面切片。本实施例中，所述切片机型号为YD-1508R轮转式切片机。

当所述样品为0.3cm×0.3cm×0.5cm大小的细长条时，在该角度下切取的薄片，其细胞不易受损。

实施例2

本实施例提供了一种植物组织切片的制作方法，所述制作方法与实施例1相同，唯一不同的是，本实施例中植物组织样品为禾本科芒草节间组织样品，得到的是禾本科芒草节间组织横切面切片。

实施例3

本实施例提供了一种用实施例1和2提供的植物组织切片制备供光学显微镜观察的玻片标本的方法，所述方法包括：

将得到的切片放在载玻片上，用去离子水反复冲洗所述切片，得到脱去包埋剂的切片，为保证将包埋剂完全冲洗干净，用40-60ml左右去离子水至少冲洗所述切片4-5次；

用擦镜纸将脱去包埋剂的切片周围多余的水分吸除，然后在脱去包埋剂的切片四周滴入新的去离子水，将盖玻片一侧与所述载玻片接触，然后缓慢的放下所述盖玻片另一侧，操作过程中保证无气泡产生；

盖玻片完全盖上后，用树脂胶将盖玻片四周封死，得到供光学显微镜观察的玻片标本。

对比例1

用传统石蜡包埋切片制作法制作阔叶木杨木的木茎组织横切面切片，具体操作步骤如下：

在体视显微镜下将阔叶木杨木的木茎修整成0.3cm×0.3cm×0.5cm大小、表面平整的细长条；

将所述细长条浸泡在甲醛固定剂中，室温下放置24小时，其中所述甲醛固定剂由9体积PBS(pH7.4)和1体积甲醛混合而成，然后，倒掉甲醛固定剂，加人PBS(pH7.4),每隔8小时更换一次，4℃保存，换液共3天；

依次用体积浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95%的酒精溶液对所述细长条进行脱水，每个梯度的溶液脱水时间为30分钟，然后用纯酒精浸泡1小时；

用过渡浸泡液浸泡所述细长条30分钟，其中所述过渡浸泡液由酒精和二甲苯按体积比为1:1的比例混合而成；

然后用二甲苯浸泡，时刻观察至所述细长条变透明时取出；

在烘箱中，在62℃下预熔石蜡，将预熔的石蜡与二甲苯按体积比为1:1混合形成浸泡液，将所述细长条放入所述浸泡液中，浸泡30分钟，然后用纯石蜡浸泡两次，每次2小时；

在包埋盒中注入石蜡打底，然后放入所述细长条，浇上石蜡包埋成样品块，将所述样品块放入4℃冰箱或水中冷凝，标明细长条放入方向，4℃存放备用；

修块；

将进行修块后的所述样品块固定在木块上，压实；

将固定有所述样品块的木块固定在切片机的载物台上，调整所述切片机，使刀片的倾斜角为30-40°，缓慢切取5－10μm的薄片，得阔叶木杨木的木茎组织横切面切片。本实施例中，所述切片机型号为LEICA SM2010R平推式切片机。

对比例2

用传统石蜡包埋切片制作法制作禾本科芒草节间组织横切面切片，具体操作步骤与对比例1相同。

对比例3

本实施例提供了一种用对比例1和2提供的植物组织切片制备供光学显微镜观察的玻片标本的方法，所述方法包括：

将得到的切片光面朝上平展于平板上；

托起所述平板将所述切片的光面朝下，放于水面上，水温40℃，使所述切片在水平上伸展；

用镊子将伸展后的所述切片放置在脱蜡溶剂中浸泡至石蜡完全溶解，其中所述脱蜡溶剂由丙酮和3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷按体积比为50:1配制而成；

然后，将所述切片贴在预先处理好的载玻片上，在40℃下烘烤过夜，除去所述脱蜡溶剂备用，其中，载玻片的预处理方法如下：将载玻片洗净，放入所述脱蜡溶剂中浸泡10～30s，取出后再放入纯丙酮中10～20s，取出晾干备用；

将盖玻片一侧与烘烤后的所述载玻片接触，然后缓慢的放下所述盖玻片另一侧，操作过程中保证无气泡产生；

盖玻片完全盖上后，用树脂胶将盖玻片四周封死，得到供光学显微镜观察的玻片标本。

将实施例3和对比例3提供的4个玻片标本放至在普通光学显微镜下进行观察，细胞结构分别如图1-6所示。

参见图1和图2，对比例1采用传统石蜡包埋切片制作法获得的切片中凝胶层（GL，gelatinous layer）沿切片方向从次生壁中上发生了剥离，而用本发明提供的方法获得的切片中凝胶层与次生壁紧密相连,并且在切片过程中保持了原有的存在状态；

参见图2和图3，对比例1采用传统石蜡包埋切片制作法获得的切片中,导管细胞壁（V,vessel）在切片过程中发生了破裂，而用本发明提供的方法获得的切片中导管细胞壁较为完整的存在；

参见图5和图6，对比例1采用传统石蜡包埋切片制作法获得的切片中,,芒草节间组织中初生木质素导管（Pxv,Protoxylem vessel），次生木质素导管（Mxv,Metaxylem vessel），厚壁纤维细胞（Sf,sclerenchymafiber）的细胞壁在切片过程中发生了明显的破裂，而用本发明提供的方法获得的这些细胞的细胞壁较为完整的保存。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种植物组织切片的制作方法，所述方法包括：依次对植物组织样品进行排气、脱水、包埋、修块、切片，得到植物组织切片，其特征在于：

所述的脱水，包括：

将熔融态的聚乙二醇溶解于超纯水中，制成不同浓度的聚乙二醇溶液；

按照所述聚乙二醇溶液浓度由低到高的顺序，依次用所述的不同浓度的聚乙二醇溶液浸润排气后的植物组织样品，最后用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述的样品呈现均一的透明状，得脱水样品；

所述的包埋，包括：

固定所述脱水样品；

用熔融态的聚乙二醇作为包埋剂包埋所述脱水样品，得到聚乙二醇包埋的样品块。

2.根据权利要求1所述植物组织切片的制作方法，其特征在于，所述的脱水，包括：

将熔融态的聚乙二醇溶解于超纯水中，制成几种不同浓度的聚乙二醇溶液，所述的几种不同浓度的聚乙二醇溶液中，聚乙二醇的体积百分比浓度梯度为15-25%；

在绝对压力为0.01-1MPa、温度为60-75℃的条件下，按照聚乙二醇浓度由低到高的顺序，依次用所述的几种不同浓度的聚乙二醇溶液浸润所述样品，最后，用熔融的聚乙二醇浸润所述的样品，直至所述样品呈现均一的透明状，得到脱水样品。

3.根据权利要求1或2所述植物组织切片的制作方法，其特征在于，所述包埋，包括：

将包埋盒水平放置；

将一托底紧靠所述包埋盒内壁放置；

迅速沿所述托底与所述包埋盒接触的位置注入少量熔融态的聚乙二醇；

待所述聚乙二醇凝固后，继续迅速加入熔融态的聚乙二醇直至其淹没所述托底；

将所述脱水样品放入所述包埋盒使其紧靠所述托底；

待聚乙二醇开始凝固，所述脱水样品的位置固定后，继续注入熔融态的聚乙二醇至其充满所述包埋盒；

将注满聚乙二醇的包埋盒静置，直至聚乙二醇完全凝固后，得到聚乙二醇包埋的样品块。

4.根据权利要求1-3任一项所述植物组织切片的制作方法，其特征在于，所述脱水和所述包埋中所用的聚乙二醇的分子量为1500-2500。

5.根据权利要求4所述植物组织切片的制作方法，其特征在于，所述脱水和所述包埋中所用的聚乙二醇的聚合度为2000，分子量为1800-2200，熔点为49-53℃。

6.根据权利要求1-3任一项所述植物组织切片的制作方法，其特征在于：

所述植物组织样品为0.3cm×0.3cm×0.5cm大小的细长条；

所述切片包括：将所述样品固定在切片机的载物台上，调整所述切片机，使其刀片的倾斜角为30-40°，缓慢切取，得植物组织切片。

7.根据权利要求3所述植物组织切片的制作方法，其特征在于：

所述修块，包括：破开所述包埋盒，去除多余的聚乙二醇，使所述样品及所述托底露出。

8.根据权利要求1-7任一项所述植物组织切片的制作方法，其特征在于：所述排气，包括：

将所述样品置于超纯水中，常压下煮沸，保持沸腾状态20-45分钟，然后迅速将所述样品转移至15-30℃的超纯水中，常压、室温下浸泡30-60分钟；

至少重复进行上述步骤3-5次，得到排气后的样品，所述排气后的样品能自由沉入盛满超纯水的容器的底部。

9.由权利要求1-8任一项所述的制作方法制成的植物组织切片。

10.由权利要求9所述的植物组织切片制备供光学显微镜观察的玻片标本的方法，所述方法包括：脱去切片的包埋剂，将脱去包埋剂的切片制成供光学显微镜观察的玻片标本，其特征在于，所述脱去切片的包埋剂，具体为：

用去离子水反复冲洗所述切片，得到脱去包埋剂的切片。

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