CN102062709B

CN102062709B - 一种鱼类组织快速切片方法

Info

Publication number: CN102062709B
Application number: CN201010585906A
Authority: CN
Inventors: 叶元土; 蔡春芳; 殷永风; 张宝彤; 向朝林
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-12-13
Also published as: CN102062709A

Abstract

本发明属于显微组织切片领域，具体涉及一种鱼类组织快速切片和染色的技术方法，包括以下步骤：1）使用固定液将鱼组织块固定4～6小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长2mm×宽2mm×高1～2mm大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按照体积比1∶1稀释的鸡蛋清浸泡10～20秒，进行冰冻切片，然后进行贴片；2）贴片后常温下放置3～5min，然后进行染色，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察，该方法不仅缩短了时间，也有效解决了冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。

Description

一种鱼类组织快速切片方法

技术领域

本发明属于显微组织切片领域，具体涉及一种鱼类组织快速切片和染色的技术方法。

背景技术

显微镜观察是对生物组织表面形态、基本结构、细微结构进行观察和分析的有效实验技术方法，也是临床病理快速诊断和部分形态学研究性工作的重要实验方法。但是，需要对生物组织进行切片处理、染色后才能进行有效的显微镜观察和分析，常规的实验切片技术方法包括石蜡切片、冰冻切片方法。

石蜡切片技术方法的一般程序是生物组织预先被固定，蛋白质等已经发生变性，一般是不可逆变性；之后用石蜡对生物组织进行浸蜡（填充细胞、组织便于切片）处理后使用组织切片机进行切片；再将切片组织中的石蜡浸提，脱蜡的切片组织才能进行染色处理。主要优点是所得切片的生物组织能够保持原有的基本形态和结构，显微镜下组织形态和结构较为清晰。而主要缺点是由于要进行石蜡包埋组织快，切片后还需要对组织切片进行脱蜡处理，所需时间较长，对于一个生物组织样品从取材到进行切片后染色观察的过程，一般需要6～7天以上；同时，操作程序较为复杂，切片实验工作量较大，对于要进行大批量切片处理的实验难度较大、工作量大、时间长。

冰冻切片技术的一般操作程序是直接将生物组织快进行切片，使用冰冻切片机将生物组织快进行快速冷冻到-25℃（大约3～5min）后马上进行切片处理，切好的组织片经过快速固定后，马上进行染色、显微镜观察和分析。冰冻切片技术方法的优点是可以保持生物组织蛋白质、酶等活性生物分子的生物活性，便于进行组织化学、酶化学和特定生物分子在细胞、组织中的定位分析；同时，从生物材料经过切片、染色到进行显微镜观察分析所需要的时间短、操作快速、简便。但是，冰冻切片技术方法的主要缺点是由于生物组织样品没有进行固定处理，在组织块修切处理、冰冻切片后，细胞和组织内的各类酶、酶原等（如细胞溶酶体中的酶）被激活后，对生物组织进行一定程度的水解；同时，在-25℃下切成5～8??m进行冰冻切片后，由于室温一般会高于0℃，导致已经切好的冰冻切片很快出现融化状态。这些缺点导致冰冻切片操作要求非常快速，同时，染色后的生物细胞、组织的表明形态、细微结构不清晰，较为模糊。

因此，需要研究一种鱼类组织快速切片方法，既可以将石蜡切片的时间缩短，也可以解决冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种鱼类组织快速切片方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鱼类组织快速切片方法，包括以下步骤：

1）使用固定液将鱼组织块固定4～6小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长2mm×宽2mm×高1～2 mm大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按体积比1:1稀释的鸡蛋清浸泡10～20秒，立即进行冰冻切片，然后进行贴片；

2）贴片后常温下放置3～5min，然后进行染色，染色的过程具体为：将切片浸在苏木精溶液中80s，生理盐水浸洗3s，浸入酸液中3～5 s，生理盐水浸洗3s，碱液中10～15 s，伊红溶液中1～3s，用质量分数95%的乙醇水溶液浸泡两次，每次5 s，用100%乙醇浸泡两次，每次5 s，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察；其中，酸液：1000ml水中加入5ml浓盐酸混匀，所述浓盐酸质量分数38%；碱液：1000ml水中加入5ml浓氨水混匀，所述浓氨水质量分数28%；上述生理盐水为鱼用生理盐水，按照质量百分比，所述鱼用生理盐水的配方为：NaCl 0.75%，KCl 0.01%，CaCl ₂ 0.01%，NaHCO ₃ 0.02%，余量为水。

上述技术方案中，步骤1）中，所述鱼组织块包括：鱼肠道组织、鱼肝胰脏组织及其它组织；为了实现良好的固定效果，所述鱼组织块的尺寸为长5～8mm×宽5～8mm×高3 mm。

上述技术方案中，步骤1）中，将鱼组织块固定前，先将鱼组织块在鱼用生理盐水中洗净，然后用吸水纸吸干表面水分。

上述技术方案中，步骤1）中，所述固定液为鲍音（Bouin’s）液，所述鲍音（Bouin’s）液的配置方法为：饱和苦味酸75ml中加入福尔马林(40%甲醛)25ml再加入冰醋酸5ml混匀。

上述技术方案中，步骤1）所述冰冻切片步骤中，样品台（冷台）温度设定为-25℃、刀片温度设定为-20℃；将切片组织块快速贴在样品台（冷台）上进行切片；优选地，将面积最大的一面贴向样品台，3～5min后即可进行切片；切片厚度要求为：肠道为4～5μm，肝胰脏为2～5μm，其他组织5～8μm。

上述技术方案中，步骤1）所述贴片步骤中，直接用洁净的载玻片将切下的组织片迅速贴片，一张载玻片可以贴2～4张切片材料；该步骤中，由于稀释的鸡蛋清既可以作为包埋剂，同时又作为粘贴剂，因此载玻片可以不再使用粘贴剂。

上述技术方案中，步骤2）中，整个染色过程中，将切片放入和拿出溶液时动作要柔和，以防脱片；所述酸液不加乙醇只用鱼用生理盐水，可以避免造成脱片。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明中，将新鲜的鱼类组织样本经过4～6小时的苦味酸固定后，使用冰冻切片机在进行冰冻切片，冰冻切片不需再进行固定，只需要简单脱去苦味酸后即可进行染色、封片处理、显微镜观察，得到实验结果。从鱼体取出组织块样品，经过固定、冰冻切片、组织染色、树胶封片，到进行显微镜观察得到实验结果，可以在8小时以内得到实验结果；因此，不仅缩短了时间（石蜡切片需要6～7天才能得到实验结果），也有效解决了冰冻切片的组织、细胞的溶解、显微镜下图像模糊的问题。

2、本发明组织切片快速、操作简便，适合与快速切片检测、形态观察和细微结构观察分析。从组织取样到显微镜观察结果只需要8小时即可完成。

3、本发明适合于鱼类组织切片观察和分析，整个操作程序、溶液配制、染色程序和方法等，均适合鱼类组织切片的需要。

4、本发明适合于对批量的鱼类组织切片需要，对于病理切片、基础研究切片等样本数量多、批处理量大的检测和研究工作特别适用。

5、本发明切片质量高，组织片与载玻片粘合牢固、不易掉片；组织、细胞染色效果好，显微镜下组织、细胞的图像清晰、反差明显；重复性好，切片封片后可以长时间保存。

附图说明

图1a为实施例中采用常规冰冻切片得到的草鱼肠道切片；

图1b为实施例中采用实施例一的切片方法得到的草鱼肠道切片；

图1c为实施例中采用常规石蜡切片方法得到的草鱼肠道切片；

图2a为实施例中采用常规冰冻切片得到的草鱼肝胰脏切片；

图2b为实施例中采用实施例一的切片方法得到的草鱼肝胰脏切片；

图2c为实施例中采用常规石蜡切片方法得到的草鱼肝胰脏切片；

图3为实施例中采用实施例一的切片方法得到斑点叉尾鮰皮肤粘膜层。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

一种鱼类组织快速切片方法，所述鱼类组织包括：鱼类肠道组织、草鱼肝胰脏、斑点叉尾鮰皮肤，具体包括以下步骤：

⑴组织块的固定方法：将要切片的组织块路快速修剪成长5～8mm×宽5～8mm×高3 mm大小，在0.75%生理盐水中洗净、吸水纸吸干表面水分，立即放入Bouin’s液中进行固定，4～6小时后即可进行切片。Bouin’s液：饱和苦味酸75ml中加入福尔马林(40%甲醛)25ml再加入冰醋酸5ml混匀。

⑵冰冻切片方法：组织块进一步修切：用薄刀片将固定后的组织块进一步修切成2mm×宽2mm×高1～2 mm大小；正式切片前30min开启冰冻切片机电源，设置样品台（冷台）温度为-25℃、刀片温度设定为-20℃；将修切好的组织在按照1:1稀释的鸡蛋清中浸泡10～20s，立即快速贴在样品台（冷台）上，注意要将最大面积的一面贴向样品台，3～5min后即可进行切片。切片厚度要求：肠道为4～5μm，肝胰脏为2～5μm，其他组织5～8μm。贴片：直接用洁净的载玻片将切下的组织片迅速贴片，一张载玻片可以贴2～4张切片材料。贴片后常温下放置3～5min后即可进行染色。

⑶切片快速染色方法和程序：苏木精溶液的染色缸中1min20s，生理盐水浸洗3s，浸入酸液中3~5 s，生理盐水浸洗3s，碱液中10~15 s，伊红溶液中1~3s，再浸入质量百分数95%的乙醇水溶液Ⅰ号染色缸中5 s，浸入质量百分数95%乙醇Ⅱ号染色缸中5 s，浸入100%乙醇Ⅰ号染色缸中5 s后，浸入100%乙醇Ⅱ号染色缸中5 s，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察。注意整个染色过程中放入盒拿出溶液时动作要柔和，以防脱片。

其中，酸液：1000ml水中加入5ml浓盐酸混匀；碱液：1000ml水中加入5ml浓氨水混匀；鱼用生理盐水配方为：NaCl 0.75%，KCl 0.01%，CaCl ₂ 0.01%，NaHCO ₃ 0.02%。

采用上述方法对鱼类肠道组织、草鱼肝胰脏、斑点叉尾鮰皮肤分别进行处理，然后进行显微观察，分别得图1b、图2b和图3。

同时采用常规的冰冻切片方法、石蜡切片方法对鱼类肠道组织、草鱼肝胰脏进行处理，然后进行显微观察，得图1a、图1c、图2a、图2c。

观察的结果为：

1、不同切片方法对鱼类肠道组织切片质量的比较

分别采用本实施例的方法与常规冰冻切片方法、石蜡切片方法，对草鱼肠道组织进行切片处理，采用本方法得到的切片质量完全可以达到石蜡切片的质量，均好于常规冰冻切片的质量。见图1a、图1b和图1c。

2、不同切片方法对鱼类肝胰脏组织切片质量的比较

肝胰脏组织含有较多的水解酶，采用常规冰冻切片的切片质量较差，见图2c细胞界限较为模糊。采用石蜡切片技术对肝胰脏进行组织切片观察得到的图像质量较好，见图2a但操作繁琐，所花费时间较长。使用本实施例的快速切片技术方法得到的草鱼肝胰脏切片质量可以达到石蜡切片的效果，图像质量高、细胞界限清晰，见图2b。

3、采用本发明的快速切片方法对斑点叉尾鮰皮肤的切片效果

采用本实施例的鱼类组织快速切片方法对斑点叉尾鮰皮肤粘膜层进行了切片实验，得到图3的实验结果，切片质量较好，显微镜下图像清晰、图像反差度高。

上述实际应用结果证明，本发明的鱼类组织快速切片方法可以使用鱼类不同组织的切片需要。

Claims

1. 一种鱼类组织快速切片方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使用固定液将鱼组织块固定4～6小时，然后将固定后的鱼组织块修切成长2mm×宽2mm×高1～2 mm大小的切片组织块，然后使用蒸馏水按照体积比1:1稀释的鸡蛋清浸泡10～20秒，进行冰冻切片，然后进行贴片；

2）贴片后常温下放置3～5min，然后进行染色，染色的过程具体为：将切片浸在苏木精溶液中80s，生理盐水浸洗3s，浸入酸液中3～5 s，生理盐水浸洗3s，碱液中10～15 s，伊红溶液中1～3s，用质量分数95%的乙醇水溶液浸泡两次，每次5 s，用100%乙醇浸泡两次，每次5 s，然后晾干，用中性树胶和盖玻片封片后即可显微镜下观察；其中，酸液：1000ml水中加入5ml浓盐酸混匀，所述浓盐酸质量分数38%；碱液：1000ml水中加入5ml浓氨水混匀，所述浓氨水质量分数28%；上述生理盐水为鱼用生理盐水，按照质量百分比，所述鱼用生理盐水的配方为：NaCl 0.75%，KCl 0.01%，CaCl₂ 0.01%，NaHCO₃ 0.02%，余量为水。

2. 根据权利要求1所述切片方法，其特征在于，步骤1）中，所述鱼组织块的尺寸为长5～8mm×宽5～8mm×高3 mm。

3. 根据权利要求1所述切片方法，其特征在于，步骤1）中，将鱼组织块固定前，先将鱼组织块在鱼用生理盐水中洗净，然后用吸水纸吸干表面水分。

4. 根据权利要求1所述切片方法，其特征在于，步骤1）中，所述固定液为鲍音液。

5. 根据权利要求1所述切片方法，其特征在于，步骤1）所述冰冻切片步骤中，样品台温度设定为-25℃、刀片温度设定为-20℃；将切片组织块快速贴在样品台上进行切片。

6. 根据权利要求5所述切片方法，其特征在于，将面积最大的一面贴向样品台，3～5min后即可进行切片；切片厚度要求为：肠道为4～5μm，肝胰脏为2～5μm，其他组织5～8μm。