CN114486762A - 一种体内虾青素转化力的检测方法 - Google Patents

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张丽莉
黄世玉
王国栋
龚筱婷
卢锡琴
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
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Abstract

本发明公开了一种体内虾青素转化力的检测方法。本发明通过对水产动物肝胰腺组织进行切片处理，显微镜观察并用Photoshop软件进行红、黄颜色分离，通过公式计算像素比K值，并根据不同置信区间设定的数值确定水产动物体内虾青素转化力大小。本发明不需要提取虾青素，即可对体内虾青素的转化力进行检测，检测效率高，可以了解不同水产动物个体间虾青素转化能力。通过Kr:Ky对虾青素转化力进行分级，级数越高其转化力越强。方法简单、实用。可为虾青素生物合成过程中相关酶的表达调控网络的识别、信号传导通路、级联传递途径和信号转导组分等理论研究奠定基础。

Description

一种体内虾青素转化力的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体内虾青素转化力的检测方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin,3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β，β-胡萝卜素)又称虾黄质或龙虾壳色素，是1种酮式萜烯类不饱和结构的类胡萝卜素，是类胡萝卜素合成过程中的终级产物，在600多种类胡萝卜素中抗氧化能力最强，比β-胡萝卜素、玉米黄质、角黄素高10倍，比α-生育酚高100倍左右，因此虾青素也被誉为“超级维生素E”。天然的虾青素主要存在于鱼类、甲壳类、藻类、酵母菌以及一些细菌中。在自然界中，虾青素是由藻类等植物光合作用产生的，虾蟹等食用后贮存于头壳及身体等部位动物体，不能自行合成虾青素，但可以由其他类胡萝卜素作为前体转化而成。
目前，虾青素含量的检测一般包括两个步骤：虾青素的提取和浓度检测。虾青素的提取方法主要有溶剂提取法和二氧化碳超临界流体萃取法，前者应用较为普遍，后者由于硬件设施要求高而较为少用。此外，还有酶解法、碱解法、微波辅助提取法、负压空化法等能够提高提取效率的辅助提取方法，这些方法一般适用于藻类和虾蟹壳中虾青素的提取。
目前，虾青素的检测方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法两类方法，还有激光拉曼光谱法，液质联用色谱法，薄层扫描检测。分光光度法是较常用的虾青素检测方法，但该法在测定过程中容易受到干扰，难以精确定量。液相色谱法是虾青素检测的主要方法。但液相色谱法存在着虾青素酯难以有效分离、标准品缺少、耗时长等问题。检测过程中如果温度和碱浓度偏高容易引起虾青素的异构化和损失，导致检测结果不准确。液相色谱-质谱法能够用于南极磷虾虾青素酯及脂肪酸的结构鉴定，实现虾青素多种几何异构体的分离；但对人员和设备要求比较高。
以上虾青素的检测方法均需要经过两个步骤，即先进行虾青素的提取，后进行浓度检测，目前暂未有体内虾青素转化力检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种体内虾青素转化力的检测方法。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种体内虾青素转化力的检测方法，包括以下步骤：
S1.组织取样和预处理：选取水产动物肝胰腺组织样品若干，取样后切片处理，获得组织切片；
S2.显微镜观察拍照：在显微镜下观察并拍照后用Photoshop软件进行红、黄颜色分离，并统计相同大小部位的各颜色的像素点。通过以下公式进行计算像素比K值；
Kn＝N*ML/A*M
其中n为r(红色)或y(黄色)；
N为r或y的像素；
ML为r或y的平均像素亮度值；
A为照片总像素值；
M为照片平均像素亮度。
得到红黄2种颜色的像素比比值Kr:Ky，
根据如下表格，确定所述水产动物体内虾青素的转化力：
Figure BDA0003485991230000021
表格中，级数越高，表明所述水产动物体内虾青素的转化力越强。
优选地，所述切片为冷冻切片。
优选地，所述水产动物为能区分代谢类胡萝卜素强弱的个体。
本发明与现有技术相比，具有以下突出优点：
1、不需要提取虾青素，即可对体内虾青素的转化力进行检测，检测效率高。
2、通过虾青素转化力数据，可以了解不同水产动物个体间虾青素转化能力。
3、可为虾青素生物合成过程中相关酶的表达调控网络的识别、信号传导通路、级联传递途径和信号转导组分等理论研究奠定基础。
4、通过Kr:Ky对虾青素转化力进行分级，级数越高其转化力越强。方法简单、实用。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为不同品系米虾肝胰腺切片图。
大写字母标记的图片是相应小写字母标记的局部放大图。
a、A:红色品系米虾肝胰腺；
b、B:黄色品系米虾肝胰腺；
c、C:白色品系米虾肝胰腺。
图2为不同品系米虾的红色色素像素比图。
图3为不同品系米虾的黄色色素像素比图。
图4为不同品系米虾的红黄色素像素比比值图。
图5为不同品系米虾类胡萝卜素代谢含量图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验动物
不同体色米虾(红、黄和白品系)来自厦门灌口米虾养殖场，米虾按照体色分别放养于事先清理干净的不同玻璃缸(0.45m×0.16m×0.30m)中培养，玻璃缸中需要加入水草提供虾躲藏和供给氧气的作用，并提前加入适量的硝化细菌改良水质，培育期间水温控制在20～26℃，试验期间pH值7～8，溶氧7.7mg/L；每隔一天换一次水，每次换水量为养殖水体的1/3。每天投喂虾饲料(购于厦门嘉康饲料有限公司)2次。
中华锯齿米虾的挑选是在白色背景下随机选择体色鲜艳健壮有活力的个体进行切片实验。将事先挑选的个体用解剖工具取样，用镊子固定米虾后，用解剖针或尖头镊子轻轻剖开米虾头胸甲表皮即可获取新鲜肝胰腺组织，操作过程中要保持米虾肝胰腺结构的完整。
实施例1不同品系米虾肝胰腺像素比K值的测定
采用实验室最常用的液氮速冻切片法，将获取的肝胰腺组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)适量加OCT包埋剂浸没组织，将装有肝胰腺的瓶盖缓缓平放入盛有液氮的纸杯中，当瓶盖底部接触液氮时即开始气化沸腾，这时保持原位切勿浸入液氮中，约10-20s组织结成冰块，成冻块后，即可置入冷冻切片机进行冰冻切片。
实验需要提前将冷冻切片机温度预降至所需温度-15℃以下；解剖米虾肝胰腺，并将米虾整个肝胰腺用OCT包埋剂包埋，按照从头到尾的方向切片，切片厚度为15μm，切片完成后再显微镜下观察拍照。本实验红、黄、蓝、白、香吉士和杂交品系各切取30只进行实验观察分析(结果如图1所示)；每只肝胰腺每隔100μm取一次样，每只取3次，计算其色素颜色像素平均值。
在显微镜下观察并拍照后用Photoshop软件进行红、黄颜色分离，并统计相同大小部位的各颜色的像素点。通过以下公式进行计算像素比K值。(Kn＝N*ML/A*M其中n为r(红色)或y(黄色)；N为r或y的像素；ML为r或y的平均像素亮度值；A为照片总像素值；M为照片平均像素亮度)。得到红黄2种颜色的像素点，转化为数字后用利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan进行多重比较；显著水平设为P<0.05；使用origin2018或Excel作图分析，得到图2～图4。
如图1所示，对六种中华锯齿米虾肝胰腺切片用显微镜观察，发现红色品系和黄色品系肝胰腺组织中均有红色、黄色两种颜色；而白色品系肝胰腺组织中无红黄颜色的分布。
由图2可知，对不同米虾肝胰腺进行切片观察处理后发现Kr在在红色品系中最高，黄色品系Kr值较低。红色品系米虾与黄色品系间Kr有显著性差异(P<0.05)。
由图3可知，Ky在黄色品系最高。红色品系Ky较低但与黄色品系间形成显著性差异(P<0.05)。
由图4可知，红色品系和黄品系米虾肝胰腺中均是黄色像素值比红色像素值高；红色品系中Kr:Ky最高，黄色品系Kr:Ky较低；但与红色品系形成显著性差异(P<0.05)。
实施例2体内虾青素代谢的验证
类胡萝卜素在甲壳类动物体内的转化途径分为两大类：一是可以将β-胡萝卜素转化为虾青素，如对虾；二是直接利用中间产物转化为虾青素，如螃蟹；可以将β-胡萝卜素、黄体素和玉米黄素等可以转变形成虾青素；日本对虾也被证明可以从α-胡萝卜素，角黄素，海胆氨酸或玉米黄质中产生虾青素。这与米虾类胡萝卜素代谢数据有相似之处。中华锯齿米虾不同品系类胡萝卜素含量有所不同，在红色品系中主要是虾青素和隐黄质，隐黄质在溶液和游离状态下呈橙黄色，动物体内的类胡萝卜素加工涉及到将膳食类胡萝卜素向靶组织的转运，以及修饰这些分子的局部酶活性，酮化酶能将饮食前体黄色类胡萝卜素转化成红色类胡萝卜素。红色品系中酮化作用强，能将隐黄质尽可能多的转化为虾青素从而使体色呈现出红色。黄色品系类胡萝卜素主要是β-胡萝卜素，是一种橘黄色脂溶性化合物，具有较强的抗氧化性等作用。黄色品系呈现的黄色说明其酮化作用弱，黄色类胡萝卜素没有过多的转化。蓝色品系虾青素的含量是所有品系中最高的。在甲壳类动物中，细胞色素P450酶(CYP酶)催化外源化合物(包括多环芳烃)和生理上重要的内源化合物的氧化代谢。肝胰脏是亲脂性外源性生物吸收和CYP酶依赖性生物转化的主要部位，也是外源性甾体代谢的重要部位。
类胡萝卜素靶向代谢产物含量测定结果来源于苏州帕诺米克生物医药科技有限公司，靶向代谢物检测(Targeted metabolites)是对目标明确的代谢产物的检测分析，特别针对一种或几种途径的代谢产物。分析方法是采用大量天然和生物变异样本，验证预先确认的代谢物或已鉴定的潜在生物标记物的定量信息。采用分析标准品进行准确的定性定量分析。利用液相、气相、三重四级杆、高分辨质谱等技术手段提供多方面的靶向代谢物检测，通过标准品绘制标准曲线，实现样品中靶向代谢物的绝对定性定量。
类胡萝卜素靶向代谢产物含量测定了红色品系、黄色品系白色品系三种米虾；测定种类为玉米黄素、β-隐黄质、叶黄素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、虾青素等常见的十种类胡萝卜素种类。
类胡萝卜素靶向代谢检测其代谢产物主要为叶黄素、玉米黄质、隐黄质素、α胡萝卜素、β胡萝卜素和虾青素。如图5所示，红色品系虾青素显著多于其他品系(P<0.05)；白色品系中没有检测到虾青素、叶黄素等产物；除白色品系外，其他品系叶黄素和玉米黄质均有检测到。
类胡萝卜素靶向代谢含量进行分析后，发现叶黄素与虾青素含量与红色品系、黄色品系和白色品系肝胰腺中红色色素也有显著性差异；红色品系Kr:黄色品系Kr约为240μg/mg；而类胡萝卜素含量测定数据中红色品系:黄色品系叶黄素含量只有5μg/mg；最高含量虾青素为63.64μg/mg；白色品系无黄颜色出现，黄色品系Ky高于红色品系Ky；与玉米黄质在四种米虾中的含量趋势相近。而红色品系Ky:黄色品系Ky为0.5倍；类胡萝卜素靶向代谢含量测定数据中发现红色品系:黄色品系玉米黄质为0.5倍，叶黄素为5倍；像素值和类胡萝卜素含量关联分析表明，红色像素值与虾青素含量正相关，而黄色像素值与叶黄素和玉米黄质含量正相关。
本文通过靶向代谢物检测到米虾体内类胡萝卜素种类主要为叶黄素、玉米黄质、隐黄质素、α胡萝卜素、β胡萝卜素和虾青素。代谢组数据表明在米虾中红色品系转化虾青素的能力最强，黄色品系转化虾青素的能力弱，白色品系则不转化虾青素。
由此可以将虾青素转化力分为：
0级：动物体不转化虾青素；
1级:动物体转化虾青素能力弱；
3级：动物体转化虾青素能力强；
根据1级和3级转化能力的强弱，可以得到2级：动物体虾青素转化能力在强和弱之间，此时为中等转化水平。
根据米虾红品系、黄品系和白品系切片数据Kr:Ky，利用SPSS软件对数据进行80％、90％、99％置信区间选择得到红、黄和白品系Kr:Ky上下限范围(参见表1)。表1中0级则为白色品系转化虾青素的能力；1级为黄色品系Kr:Ky不同置信区间的数值；3级为红色品系Kr:Ky不同置信区间的数值；2级是置信区间为99％时红品系和黄品系之间虾青素的转化能力。
表1 虾青素转化力分级表
Figure BDA0003485991230000071
本实验发现肝胰腺切片的呈色与类胡萝卜素含量具有一定的关联，其中红色呈色物质为虾青素，通过切片中Kr:Ky能够基本反映机体虾青素的转化能力。
综上所述，本发明不需要提取虾青素，即可对体内虾青素的转化力进行检测，检测效率高。运用本发明方法得到的虾青素转化力数据，可以了解不同水产动物个体间虾青素转化能力。通过Kr:Ky对虾青素转化力进行分级，级数越高其转化力越强。方法简单、实用。可为虾青素生物合成过程中相关酶的表达调控网络的识别、信号传导通路、级联传递途径和信号转导组分等理论研究奠定基础。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种体内虾青素转化力的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1.组织取样和预处理：选取水产动物肝胰腺组织样品若干，取样后切片处理，获得组织切片；
S2.显微镜观察拍照：在显微镜下观察并拍照后用Photoshop软件进行红、黄颜色分离，并统计相同大小部位的各颜色的像素点。通过以下公式进行计算像素比K值；
Kn＝N*ML/A*M
其中n为r(红色)或y(黄色)；
N为r或y的像素；
ML为r或y的平均像素亮度值；
A为照片总像素值；
M为照片平均像素亮度。
得到红黄2种颜色的像素比比值Kr:Ky，
根据如下表格，确定所述水产动物体内虾青素的转化力：
Figure FDA0003485991220000011
表格中，级数越高，表明所述水产动物体内虾青素的转化力越强。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述切片为冷冻切片。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水产动物为能区分代谢类胡萝卜素强弱的个体。
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