JP2015072212A - 凍結切片作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】凍結切片のための包埋の際、試料の取り扱いや方向付けが容易になり、所望の凍結切片を安定して作製できる凍結切片作製方法を提供する。【解決手段】凍結切片作製方法は、アクリルアミドゲルで挟まれた、包埋剤に埋め込まれた生物組織を準備する工程と、前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に凍結させる工程と、凍結した前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に、薄切する工程と、を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、凍結切片作製方法に関する。

生物組織から凍結切片を作製するのは、臨床から基礎生物学研究に至るまで、広く行われている手技である。

具体的には、試料を包埋皿に入れてOCTcompoundなどの包埋剤を満たし、ドライアイスや液体窒素で凍結してブロックを作製する。そして、クライオスタットを用いて、凍結した試料を数μｍから数十μｍに薄切する。薄くきれいな凍結切片を作製するためには、固定の条件、組織の状態、凍結の仕方、機械の使用方法など、切片の質に影響する様々なファクターがあり、形態が保たれた凍結切片を作製するのは容易ではない。

特開２００４−３７４３４号公報（特許文献１）では、低温でも強い粘着力を有する粘着フィルムを凍結試料表面に貼り付けて、薄切することにより形態の保たれた凍結切片を作製できることが示されている。それによって、硬組織を含む試料、軟骨を含む試料から良好な切片標本を作製する事が可能になるとされる。

特開２００４−３７４３４号公報

凍結切片を作る際、試料のある中心部が凍結されるまで数分かかり、その間に、試料は包埋剤の底に沈んで、角度がわからなくなることがある。また、包埋剤は凍結すると白くなり、その後は、試料の形が見えなくなる。特に、横隔膜のような薄い膜状の組織の場合、試料の方向が明確になっていなければ、刃の試料に当たる角度が調整できず、切片の作製は難しくなる。また、薄い膜状の組織の場合、扱い方が難しく、すぐにロール状になるので、安定して延びた形で包埋するのが難しい。

そこで、本発明は、凍結切片のための包埋の際、試料の取り扱いや方向付けが容易になり、所望の凍結切片を安定して作製できる凍結切片作製方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施形態は、生物組織の凍結切片の作製方法であって、アクリルアミドゲルで挟まれた、包埋剤に埋め込まれた生物組織を準備する工程と、前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に凍結させる工程と、凍結した前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に、薄切する工程と、を含む、凍結切片の作製方法である。前記生物組織が、膜状組織であってもよい。

本発明によって、凍結切片のための包埋の際、試料の取り扱いや方向付けが容易になり、所望の凍結切片を安定して作製できる凍結切片作製方法を提供できるようになった。

本発明の一実施形態である凍結切片作製方法を模式的に示す図である。 本発明の一実施例において作製したマウス横隔膜の切片の写真である。 本発明の一実施例において作製したマウス皮膚の切片の写真である。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）準備工程
初めに、アクリルアミドゲルで挟まれた、包埋剤に埋め込まれた生物組織を準備する。（以降、このように構成された生物組織を組織ブロックと呼ぶ。）組織ブロックが、このような構成を有するのであれば、その製造方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして、組織ブロックを準備できる。

ここで、試料となる組織は、生物種や組織の種類は限定されず、動物の組織片でも、植物の組織片でもよく、また個体丸ごとでもよいが、横隔膜や腹膜、上皮や皮膚などの薄い膜状組織（例えば、厚さが１ｍｍ以下であることが好ましく、０．５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以下であることがさらに好ましく、０．１ｍｍ以下であることがもっとも好ましい。）、小さな胚や組織片（例えば、長さが１０ｍｍ以下であることが好ましく、５ｍｍ以下であることがより好ましく、３ｍｍ以下であることがさらに好ましく、１ｍｍ以下であることがもっとも好ましい）など、特に凍結切片作成が難しい試料に、好ましく適用できる。

組織は、前処理として、固定していても、固定していなくてもよい。固定する場合は、従来法に基づいて固定すればよい。例えば、１０％ホルマリンを用いて、４℃で一晩固定し、その後、段階的に濃度を高めたスクロース溶液のシリーズに浸し、最終的に１５−３０％のスクロース溶液と平衡化する。しかし、本発明の方法では、皮膚などの結合組織が多いサンプルに対しても形状が良好に保存できるため、未固定のサンプルでも容易に凍結切片を作製できる。

組織ブロックを作製するには、まず、２枚のアクリルアミドゲルを準備する。アクリルアミドゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるのと同じ方法で作製すればよい。そのゲル濃度は、特に限定されないが、下限については、１％以上でもよく、２％以上が好ましく、５％以上がより好ましく、１０％以上がさらに好ましく、１５％以上が最も好ましく、ゲル濃度の上限については、５０％以下でもよく、４０％以下が好ましく、３５％以下がより好ましく、３０％以下がさらに好ましく、２５％以下が最も好ましいが、２０％が最も好ましい。ゲルの厚さも特に限定されないが、下限の厚さとして、０．１０ｍｍ以上が好ましく、０．２５ｍｍ以上がより好ましく、０．５０ｍｍ以上が最も好ましく、上限の厚さについては、３．０ｍｍ以下が好ましく、１．５ｍｍ以下がより好ましく、１．００ｍｍ以下が最も好ましいが、０．７５ｍｍが最も好ましい。

アクリルアミドゲルを必要な大きさに切断して、ゲルと台の間に泡が入らないようにして台の上にのせる（図１ 工程２）。後で組織ブロックを凍結する際には、凍結しやすいように台と一緒に凍結してもよく、その場合、台として凍結用包埋皿などを用いればよいが、台の種類は特に限定されず、作業者が適宜選択すればよい。組織ブロックを台と一緒に凍結する場合、台の剥離を防ぐため、台の上に少量の包埋剤を塗布しておくのが好ましい（工程１）。包埋剤は特に限定されず、市販のものでよいが、例えば、ＯＣＴコンパウンド、Ｎｅｇ−５０などが例示できる。

次にゲルの上に適量の包埋剤をのせ、泡が入らないようにしながら、試料となる組織片を包埋剤に埋め込む（図１ 工程３〜４）。試料が完全に包埋剤に埋め込まれる量の包埋剤を用いればよく、そのために、試料の上から、さらに包埋剤を追加してもよい（工程５）が、ちょうど試料が覆われる量の包埋剤を用いるのが好ましい。そして、この段階で、試料の方向を決める。

その上に、適当な大きさに切断した２枚目のゲルを、泡が入らないようにして載せる（工程６）。２枚のゲルの間から包埋剤が漏れた時は、キムワイプ（登録商標）等で拭き取り、包埋剤が不足して泡が入ったときは、包埋剤を追加する。この後、組織ブロックをすぐに凍結しない時は、氷上で保存する。

このように、生物組織を２枚のアクリルアミドゲルで挟むことによって、例えば膜状の組織であっても、ロール状になったりせずに、容易に取り扱いができるようになる。また、包埋剤が極少量で済むので、急速に凍結ができ、氷傷による組織の破壊がおこりにくく、また結合組織の多いサンプルの形状も保存できる。そして、凍結後に白くはなるが、厚みが薄いため、比較的透明で、試料が観察しやすくなる。

（２）凍結工程
次に、組織ブロックを凍結させることによって、生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に凍結させる。このように、生物組織を２枚のアクリルアミドゲルで挟んだ状態で凍らせることによって、容易に、所望の向きで組織を凍結させることができる。また、凍結時におこる自重等によるサンプルのずれが生じにくい。

組織ブロックの凍結方法は特に限定されないが、以下のような方法が例示できる。

［１］有機溶媒＋ドライアイスによる凍結法
ヘキサンやアセトンといった有機溶媒にドライアイスを加え、冷却有機溶媒中に組織ブロックをしずめ、氷傷を防ぐために小刻みにゆすりながら凍結する。

［２］冷却した金属ブロックによる圧着凍結法
液体窒素中に沈め冷却した金属ブロック上に組織ブロックをおくことで凍結する。この場合、台を金属ブロックと接するようにするのが好ましい。

［３］液体窒素とイソペンタンによる凍結法
液体窒素にビーカーにいれたイソペンタンを平衡状態になるまで冷却し、組織ブロックをイソペンタン中に沈め、小刻みにゆすりながら凍結させる。

これらのいずれの凍結法でも凍結ブロックを得ることができるが、氷傷の回避や組織の形態維持、急速凍結のため、［３］がより好ましい。

（３）切片作製工程
この工程では、凍結した組織ブロックから、凍結切片をつくる。すなわち、凍結した生物組織を、包埋剤とアクリルアミドゲルと共に、薄切する。この工程は、従来と同じように切片を作るのであるが、薄切する時に、凍結したアクリルアミドゲルごと薄切する点に特徴がある。以下、切片作製の一例を記載する。

まず、−１０℃〜−４０℃程度に冷却したクライオスタット内に、凍結した組織ブロックをいれサンプルが庫内の温度になじむまで５−３０分程度放置する。その後、台を外す。カミソリなどを使用してもよいが、あるいは、台の両端を内側に軽く押し出すようにしても台が外れる場合がある。そして、ミクロトームの試料固定台に包埋剤をミクロトームと垂直方向に細長く塗布し、包埋剤が凍結する前に、凍結したアクリルアミドゲルが試料固定台と垂直になるように、またミクロトームと垂直になるようにたてて、包埋剤を凍結させることで、組織ブロックを試料固定台に固定する。

その後、トリミングや面出しなどを行い、所定の厚さで切片を作製する。アクリルアミドゲルの薄切片は、凍結切片の温度が上がって包埋剤が融解するとともにスライドグラスから剥がれる。遅くとも、染色時に行う洗浄でアクリルアミドゲルは剥離し、目的のサンプルだけがスライドグラス上に残る。

以下、上記の凍結切片の作製方法に従って、マウス横隔膜及びマウス皮膚の切片を作製した。

まず、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させた後、下腹部を切開し、胃、腸、肝臓等の臓器を切除して横隔膜を露出させ、胸腔にそってはさみを入れてマウス横隔膜を採取した。次に、マウスから皮膚片を採取し、解剖用はさみとピンセットを用いて上皮真皮および周辺組織を剥離して、皮膚とした。これらの組織片を、未固定のままOCTcompoundに包埋した。

２０％アクリルアミドゲルは、以下の試薬を順次加え、固まる前にゲルメーカーに注ぎ、厚さ０．７５ｍｍのゲルを作製した。

２回蒸留水 ７６５μＬ
３０％アクリルアミド溶液 ７，５ｍＬ
１．５Ｍ トリス（ｐＨ８．８） ２．８２ｍＬ
１０％ ＳＤＳ １１２．５μＬ
１０％ ペルオキソ二硫酸アンモニウム ５７μＬ
ＴＥＭＥＤ １１．４μＬ

マウス横隔膜及びマウス皮膚は、２枚のゲルの間に、ゲルと平行になるように配置し、液体窒素とイソペンタンを用いて凍結させた。作製した組織ブロックを用いて、−２５℃で、１０μｍの厚さの凍結切片を作製した。その後、標準的な方法で、ヘマトキシレン−エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。図２にマウス横隔膜の切片の写真を、図３にマウス皮膚の切片の写真を載せた。

このように、本発明の方法によると、膜状組織であっても、取り扱いや方向付けが容易になり、所望の凍結切片を安定して作製できるようになった。

Claims (2)

1. 生物組織の凍結切片の作製方法であって、
   アクリルアミドゲルで挟まれた、包埋剤に埋め込まれた生物組織を準備する工程と、
   前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に凍結させる工程と、
   凍結した前記生物組織を、包埋剤とアクリルアミドと共に、薄切する工程と、
   を含む、凍結切片の作製方法。
2. 前記生物組織が、膜状組織である、請求項１に記載の凍結切片の作製方法。