CN114295444A - 一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法。所述的方法包括样品处理和包埋、冰冻切片机预冷、冷冻切片、制片。本发明提供的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法取新鲜材料直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，是一种最为简便且效果良好的切片方式，适合作为用于空间转录组学分析中的桃果实冰冻切片方法。

Description

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法。

背景技术

桃是一种具有农业意义的水果，不仅具有经济价值，作为酚类化合物、氰苷和植物雌激素的重要来源，在人类健康方面具有重要意义。果皮毛的有无以及果肉特征和果实形状都是对桃子进行分类的商业特征。水蜜桃有果皮毛，油桃无果皮毛。桃的果皮毛除了与果实的商品性质有关，并且在抵御非生物胁迫因素(干旱、高强度紫外线和冰冻等)方面起着关键作用，果皮毛也是抵御病原体或食草动物攻击等生物胁迫的重要屏障。桃果皮毛是一对等位基因(G/g)控制的单基因性状，有毛G对无毛g为显性。目前的研究证明了MYB家族转录因子基因PpeMYB25是桃果实中果皮毛形成的正调控因子。在桃果皮毛发育过程中是否还有其他基因起作用，这是一个未知的问题。

植物组织切片最初是用于观察组织结构，随后发现和其他技术的连用可用于检测细胞水平的转录、代谢等细胞活性。植物组织切片包括半薄切片、石蜡切片、冰冻切片等技术，相比其他方法，冰冻切片制片周期短、对样本的损伤较小，能最大程度保证细胞的真实状态，对于分析细胞水平的转录、代谢变化，具有较大优势。

空间转录组能从细胞水平上的呈现完整个体或者器官的基因表达的动态。组织系统由不同的细胞亚群组成，它们在特定组织中的空间位置与它们的功能紧密交织在一起。组织特异性基因表达定义了它们独特的生物学作用，而富集的表达基因通常在维持组织或细胞特异性功能方面发挥作用。识别细胞/组织中的转录组及其调控是破译基因的细胞/组织特异性功能的关键。

尽管单细胞RNA测序(scRNA-seq)已经有效的解决了细胞异质性的问题，并且这种单细胞分析技术的应用极大地促进了动植物发育过程的实验研究。但是，scRNA-seq利用原生质体进行检测，在组织解离步骤中分离单个细胞会丢失它们在组织中的空间定位信息和3D构造，这种空间信息对于理解正常和胁迫处理下的细胞间通讯、不同发育阶段结构和细胞类型的关联是至关重要的。

为了克服这些不足，空间转录组学(Spatial Transcriptome，ST)应运而生，ST将样本中RNA原位与SPOT矩阵杂交，并整合RNA-Seq转录本数据映射到组织图像特定的位置，利用每个SPOT探针上特异的条形码进行定位。利用空间转录组学和单细胞RNA测序联合分析，可以在其天然组织环境中定位转录特征的单个细胞。ST在研究人神经元分化、心脏发育、癌症和肿瘤等方面已经广泛运用起来，并且取得了进展性的成就。但是在植物方面的应用较少，与哺乳动物组织相比，植物组织及细胞面临着许多特殊的挑战，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢物，使得植物组织硬度、脆度增强、含水量增加，这些特性需要与哺乳动物组织相比有很大不同的操作程序，并且通常需要针对物种或组织进行特定的优化。

在进行空间转录组学分析时，冷冻切片的制作是最重要，也是最基础的一环。组织切片的质量和完整性直接决定了空间转录组数据的准确性。现有技术公开的组织冰冻切片方法存在液氮速冻后的桃果实组织脆弱，经包埋固定后切片效果不理想，大部分冰冻切片中桃果实破碎，失去完整性的问题。可能是因为桃果实细胞中含有大液泡，经液氮速冻后液泡破裂，导致组织破碎。另外，桃果实的内果皮会木质化变硬，在冰冻状态下也可能导致组织破碎。目前关于用于空间转录组学分析的植物组织冰冻切片的方法尚未完善，所以没有成熟的技术体系来制备用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，且可用于空间转录组学分析的冰冻切片方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，所述的方法包括以下步骤：

S101样品处理和包埋：

取桃果实，用去离子水洗净，吸干水分；

将冰上预冷后的OCT包埋剂注入包埋盒；

确认组织切片方向，将桃果实放入装有OCT包埋剂的包埋盒中，再用OCT包埋剂覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡；

立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中，至OCT包埋剂完全冻结；

S102：冰冻切片机预冷：

冰冻切片机冷冻箱温度设置-20℃，速冻台温度设置-20℃；

S103冷冻切片：

在样品台上添加OCT包埋剂打底，将包埋好的桃果实放在样品托上，再将其转移至已经预冷到-20℃的速冻台上静置，样品固定到样品托持承器上固定切片。

S104制片：

将切片平展于速冻台上，调整切片的角度后切片，收集符合要求的切片。

进一步的，步骤S101所述的桃果实为开花后7天的桃果实。

进一步的，步骤S101所述的OCT包埋剂为TissueTek O.C.T.Compound，VWR，25608-930；

进一步的，步骤S101所述的OCT包埋剂添加量≤包埋盒体积的1/3。

进一步的，步骤S101所述的包埋剂完全冻结后，透过OCT包埋剂有桃果实组织裸露未完全包埋，则继续添加OCT包埋剂，直至OCT包埋剂完全包埋桃果实组织。

进一步的，步骤S103所述的包埋好的桃果实上样品托之前修剪，去除多余OCT包埋剂。

进一步的，步骤S103所述静置时间为10±2min。

进一步的，步骤S104所述切片时，先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm切片，观察样本的切片轮廓，符合要求后收集样本切片。

进一步的，步骤S104所述切片后，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT包埋剂快速融化，切片粘附于玻片上。

本发明还提供一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法的用途。

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，所得切片用于空间转录组学分析。

本发明提供的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，取新鲜材料直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，是一种最为简便且效果良好的切片方式，适合作为用于空间转录组学分析中的桃果实冰冻切片方法。

本发明提供的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，为桃果实的组织空间转录组学分析提供技术基础。

不同组织的含水量、形态结构以及细胞的组成成分的多样性等因素都会直接影响冰冻切片的质量,此外，组织包埋、速冻方法、切片温度也会影响切片质量。在原有技术中，组织进行包埋时，需要使用液氮或者干冰进行速冻，速冻之后植物组织切片会出现裂痕，局部或者整体破碎的现象。

附图说明

图1是本发明实施1获得的桃幼果冰冻切片的HE染色成像。

图2是采用已知方法获得的桃幼果冰冻切片成像。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，所述的方法包括以下步骤：

S101样品处理和包埋：

取桃果实，用去离子水洗净，吸干水分；

将冰上预冷后的OCT包埋剂注入包埋盒；

确认组织切片方向，将桃果实放入装有OCT包埋剂的包埋盒中，再用OCT包埋剂覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡；

立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中，至OCT包埋剂完全冻结；

S102：冰冻切片机预冷：

冰冻切片机冷冻箱设置温度-20℃，速冻台设置温度-20℃；

S103冷冻切片：

在样品台上添加OCT包埋剂打底，将包埋好的桃果实放在样品托上，再将其转移至已经预冷到-20℃的速冻台上静置，样品固定到样品托持承器上固定切片。

S104制片：

将切片平展于速冻台上，调整切片的角度后切片，收集符合要求的切片。

进一步的，步骤S101所述的桃果实为开花期后7天的桃果实。

进一步的，步骤S101所述的OCT包埋剂为TissueTek O.C.T.Compound，VWR，25608-930；

进一步的，步骤S101所述的OCT包埋剂添加量≤包埋盒体积的1/3。

进一步的，步骤S101所述的包埋剂完全冻结后，透过OCT包埋剂有桃果实组织裸露未完全包埋，则继续添加OCT包埋剂，直至OCT包埋剂完全包埋桃果实组织。

进一步的，步骤S103所述的包埋好的桃果实上样品托之前修剪，去除多余OCT包埋剂。

进一步的，步骤S103所述静置时间为10±2min。

进一步的，步骤S104所述切片时，先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm切片，观察样本的切片轮廓，符合要求后收集样本切片。

进一步的，步骤S104所述切片后，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT包埋剂快速融化，切片粘附于玻片上。

本发明还提供一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法的用途。

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，所得切片用于空间转录组学分析。

实施例1

结合图1所示。

一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法

1.冰冻切片机预冷：

启动冰冻切片机(LEICA CM1950)，冷冻箱设定温度为-20℃，速冻台温度设定为-20℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。

2.样品制备：

取新鲜桃幼果，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中(若OCT凝固后，发现透过OCT仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加OCT，直至OCT凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋)。立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中冷冻30min，等到OCT完全冻结后便可以进行切片。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的OCT，便于切片和黏连样品托。在样品托上添加OCT包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品拖上液态OCT相黏连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。

3.切片：

将样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。首先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm，切片同时用普通吸取切片，初步观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。

4.制片：

将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT快速融化，以有利于切片粘附。

切片的HE染色成像如图1所示。由图1可以看出，取新鲜材料直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，适合作为用于空间转录组学分析中的桃果实冰冻切片方法。

实施例2

结合图2所示。

利用原有冰冻切片方法进行桃幼果切片

1.冰冻切片机预冷：

启动冰冻切片机(LEICA CM1950)，冷冻箱设定温度为-20℃，速冻台温度设定为-10℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。

2.样品制备：

取新鲜桃幼果，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。将新鲜样本迅速放入液氮预冷的异戊烷中冰冻15min。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中(若OCT凝固后，发现透过OCT仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加OCT，直至OCT凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋)。立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中冷冻30min，等到OCT完全冻结后便可以进行切片。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的OCT，便于切片和黏连样品托。在样品托上添加OCT包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品拖上液态OCT相黏连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。

3.切片：

将样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。首先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm，切片同时用普通吸取切片，初步观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。

4.制片：

将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT快速融化。

组织进行包埋时，需要使用液氮或者干冰进行速冻，速冻之后植物组织切片会出现裂痕，局部或者整体破碎的现象。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

S101样品处理和包埋：

取桃果实，用去离子水洗净，吸干水分；

将冰上预冷后的OCT包埋剂注入包埋盒；

确认组织切片方向，将桃果实放入装有OCT包埋剂的包埋盒中，再用OCT包埋剂覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡；

立即将包埋盒放在干冰或-80℃冰箱中，至OCT包埋剂完全冻结；

S102：冰冻切片机预冷：

冰冻切片机冷冻箱温度设置-20℃，速冻台温度设置-20℃；

S103冷冻切片：

在样品台上添加OCT包埋剂打底，将包埋好的桃果实放在样品托上，再将其转移至已经预冷到-20℃的速冻台上静置，样品固定到样品托持承器上固定切片，

S104制片：

将切片平展于速冻台上，调整切片的角度后切片，收集符合要求的切片。

2.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S101所述的桃果实为开花后7天的桃果实。

3.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S101所述的OCT包埋剂为TissueTek O.C.T.Compound，VWR，25608-930。

4.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S101所述的OCT包埋剂添加量≤包埋盒体积的1/3。

5.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S101所述的包埋剂完全冻结后，透过OCT包埋剂有桃果实组织裸露未完全包埋，则继续添加OCT包埋剂，直至OCT包埋剂完全包埋桃果实组织。

6.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S103所述的包埋好的桃果实上样品托之前修剪，去除多余OCT包埋剂。

7.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S103所述静置时间为10±2min。

8.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S104所述切片时，先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm切片，观察样本的切片轮廓，符合要求后收集样本切片。

9.根据权利要求1所述的一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，其特征在于：步骤S104所述切片后，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT包埋剂快速融化，切片粘附于玻片上。

10.一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法，所得切片用于空间转录组学分析。

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