CN113640080A - 一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物空间转录组学领域，主要涉及到一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。所述方法包括步骤：将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，将新鲜棉花胚组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面；OCT完全冻结后进行切片和制片。本发明方法利用新鲜组织快速低温包埋后切片，获得了结构清晰、完整的冰冻切片，并可用于空间转录组学，得到一个完整的组织样本中产生的全部转录组数据，能够定位和区分功能基因在特定的组织区域内表达情况。根据差异基因的表达情况分析调控细胞群命运、空间组织、集体生长的关键因子，空间基因表达模式的详细分析对于阐述植物发育过程中复杂的调控网络至关重要。
Description
技术领域
本发明涉及植物空间转录组学领域，主要涉及到一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。
背景技术
组织系统由不同的细胞亚群组成，它们在特定组织中的空间位置与它们的功能紧密交织在一起。了解组织系统需要了解它们的组成部分。尽管单细胞RNA测序(scRNA-seq)是解决转录异质性的有力工具，这种单细胞分析的应用极大地促进了发育过程的实验研究。然而，在scRNA-seq必要的组织解离步骤中分离单个细胞会破坏有关它们在天然组织中的空间定位以及它们彼此接近的信息，这种空间信息对于理解正常和胁迫组织下的细胞间通讯是至关重要的。为了克服这些不足，空间转录组学(ST)允许将RNA-Seq转录本数据空间映射到高分辨率组织图像上，空间信息通过使用由>1000个点(100-μm圆形区域)和条形码捕获探针组成的独特微阵列来保持。空间转录组学(ST)可以揭示出丰富的不同基因组的生态位。这将细胞亚群定位到它们所在的组织“邻里”，并指定它们表达的配体和受体，以影响局部细胞间的通讯。当空间转录组学和单细胞RNA测序(scRNA-seq)联合使用时，可以在其天然组织环境中定位转录特征的单个细胞。ST已经被用于研究小鼠嗅球，乳腺癌，黑色素瘤，前列腺癌，牙龈组织，成人心脏组织，小鼠以及模式植物。
与哺乳动物系统相比，植物组织和细胞面临着许多特殊的挑战，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢物。这些特性需要与哺乳动物组织相比有很大不同的操作程序，并且通常需要针对物种或组织进行特定的优化。在进行空间转录组学分析时，冷冻切片的制作至关重要。组织切片的质量和完整性直接决定了空间转录组数据的准确性。
按照现有文献报道的关于植物组织冰冻切片方法进行了棉花胚珠的切片，发现经过液氮速冻后的棉花组织十分脆弱，经包埋固定后切片效果不理想，大部分冰冻切片中棉花胚珠破碎，失去完整性。分析其原因，与现有报道的关于植物冰冻切片方法相比，可能是因为棉花胚珠组织中子房壁、胎座等结构相关，这些结构在不同厚度切片下，形态存在差异。另外，棉花胚珠含有木质素，在冰冻状态下也可能导致组织脆弱。目前关于用于空间转录组学分析的植物组织冰冻切片的方法还不完善，没有成熟的技术体系用于制备空间转录组学分析所需的植物组织冰冻切片。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。
根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法包括以下步骤：
5)取新鲜取棉花胚组织，修剪成合适大小的组织块，清洗干净并吸干水分，置于培养皿中；
6)将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，将新鲜棉花胚组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡，将含有棉花胚组织和OCT的包埋盒进行冷冻凝固；
7)切片：OCT完全冻结后进行切片，将样品托固定到冰冻切片机的预冷样品托持承器上，进行切片，切片厚度为8-10μm；
8)制片：将切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在空间转录组专用的玻片上，得到用于棉花胚珠空间转录组分析的切片。
根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其中，在步骤1)中，修剪棉花胚组织的大小为6.5mm×6.5mm。
根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其中，在步骤2)中，若OCT凝固后，发现透过OCT仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加OCT，直至OCT凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋。
根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其中，在步骤3)中，冰冻切片机预冷至-20℃，样品托持承器温度预冷至-20℃。
根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，还包括步骤：通过HE染色确定目标区域，在确定目标位置之后进行RNA质检。
现有技术中未有应用于棉花胚珠空间转录组分析的冰冻切片技术的报道。本发明的方法制备可用于棉花胚珠空间转录组分析的切片，利用空间转录组技术解读棉花胚珠细胞的基因表达情况，由于是研究RNA转录水平，需尽量减少其降解，然而RNA酶广泛存在，组织冷冻能较好的保障组织中的RNA质量。基于现有的RNAseq技术的基础，RNA测序技术都会在得到样本之后进行冷冻保存，由于RNAseq不考虑细胞的异质性，只需要得到较高质量的RNA即可，所以此方法在利用空间转录组研究棉花胚珠基因表达情况时存在细胞损伤、丢失细胞位置信息的局限。
根据本申请的技术方案，在尝试用低温冻存和冷冻液处理后低温冻存的试验中，多次探索仍无法得到理想的切片，本发明方法利用新鲜组织快速低温包埋后切片，获得了结构清晰、完整的冰冻切片，并可用于空间转录组学，得到一个完整的组织样本中产生的全部转录组数据，能够定位和区分功能基因在特定的组织区域内表达情况。根据差异基因的表达情况分析调控细胞群命运、空间组织、集体生长的关键因子，空间基因表达模式的详细分析对于阐述植物发育过程中复杂的调控网络至关重要。
附图说明
图1显示利用本发明方法获得的棉花胚珠冰冻切片的HE染色成像；
图2为利用现有技术的方法得到的棉花胚珠冰冻切片。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种棉花胚珠冰冻切片用于空间转录组测序
1)冰冻切片机预冷：启动冰冻切片机(LEICACM1950)，冷冻箱设定温度为-20℃,样品托持承器温度设定为-20℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。
2)样品制备：取新鲜棉花胚组织，修剪成合适大小(小于6.5mm×6.5mm)，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将含有组织和OCT的包埋盒放在干冰上或-80℃冰箱中(若OCT凝固后，发现透过OCT仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加OCT，直至OCT凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋)。于干冰或-80℃冰箱中冷冻30min，直至OCT完全冻结后便可以进行切片(若要缩短冷冻时间，包埋后可将干冰盒放入-80℃冰箱，促进OCT冻结)。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的OCT，便于切片与样品托粘连。在样品托上添加OCT包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品托上的液态OCT相粘连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。
3)切片：将样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。首先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm，切片同时用普通吸取切片，初步观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。
4)制片：将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使OCT快速融化，以有利于切片粘附。
5)样本质控：在Visium空间组织优化载玻片中，8个捕获区域中有7个用于组织，一个空区域用于阳性RNA对照。每张载玻片只能测试一种组织类型。载玻片上的切片部分应该是均匀的，没有任何裂缝、撕裂或折叠。通过HE染色确定目标区域，在确定目标位置之后进行成像捕获(见图1)。
利用现有的切片技术进行棉花胚珠冰冻切片，参考“棉花幼嫩组织微观骨架的免疫荧光抗体标记方法”进行并冰冻组织切片，利用其固定、脱水、冰冻切片的方法无法得到完整的棉花胚珠切片(见图2)。
Claims (5)
1.一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)取新鲜取棉花胚组织，修剪成合适大小的组织块，清洗干净并吸干水分，置于培养皿中；
2)将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，将新鲜棉花胚组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡，将含有棉花胚组织和OCT的包埋盒进行冷冻凝固；
3)切片：OCT完全冻结后进行切片，将样品托固定到冰冻切片机的预冷样品托持承器上，进行切片，切片厚度为8-10μm；
4)制片：将切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在空间转录组专用的玻片上，得到用于棉花胚珠空间转录组分析的切片。
2.根据权利要求1所述的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其特征在于，在步骤1)中，修剪棉花胚组织的大小为6.5mm×6.5mm。
3.根据权利要求1所述的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其特征在于，在步骤2)中，若OCT凝固后，发现透过OCT仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加OCT，直至OCT凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋。
4.根据权利要求1所述的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其特征在于，在步骤3)中，冰冻切片机预冷至-20℃，样品托持承器温度预冷至-20℃。
5.根据权利要求1所述的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其特征在于，所述还包括步骤：通过HE染色确定目标区域，然后进行RNA质检。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114295444A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 河南大学 | 一种用于桃果实组织空间转录组学分析的冰冻切片方法 |
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| CN114944193A (zh) * | 2022-05-20 | 2022-08-26 | 南开大学 | 整合单细胞转录组与空间转录组数据的分析方法及系统 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113640080B (zh) | 2023-05-23 |
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