CN106092682B - 快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，包括：(1)将水稻花药包埋冷冻、切片，将含有水稻花药组织的切片贴于载玻片上；(2)在切片上滴加Fluo‑3AM荧光探针孵育液，在4～37℃培养箱内避光孵育1～120min后，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片；(3)用荧光显微镜观察装载有Fluo‑3AM荧光探针的切片。该方法快速准确，适用于需要大批量检测和研究工作，并可被推广应用于其他植物组织中游离钙离子分布的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法。
背景技术
钙离子是植物和动物机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白结合激活多种蛋白激酶，从而在许多生命活动中担当重要的角色，是细胞分裂、细胞凋亡、细胞感受胞外刺激及环境生态适应等各项生物活动均不可缺少的元素。因此，农作物器官中的钙离子活性与分布检测，对于揭示作物器官的生理活力与细胞凋亡变化具有重要意义。
花器官是农作物生长发育对干旱、高温和冷害等逆境气候响应最敏感和最易受损伤的器官，尤其是对传统的自花授粉农作物(如，水稻、小麦等)而言，花器官发育过程的受到逆境损伤通常不容易被感官觉查，常规生理方法也难以检测到花粉发育过程(包括小孢子母细胞的减数分裂、小孢子的发育、雄配子的形成)的复杂生理生化变化，因而探索水稻和小麦等农作物花药发育过程中Ca2+活性及其分布变化已成为研究其花器官逆境损伤和不育系形成生理过程及其鉴定的一种极重要手段。
目前，在小麦和水稻上广泛使用的检测其花器官Ca2+分布的方法是石蜡切片或半薄切片焦锑酸钾沉淀法，这两种方法的优点是切片进行染色后，其生物组织结构形态和结构较为清晰，细胞界限分明，但是这两种方法的缺点是：(1)制片需要经过取材、固定、梯度脱水、渗透、包埋、切片、染色，特别是石蜡切片更要经过脱蜡、复水、染色、脱水等步骤，制片过程繁琐，耗时长，工作量大，难以进行大批量的样品检测；(2)在石蜡切片和半薄切片制片过程中要经过固定，杀死细胞，使切片组织丧失酶活，不能用来检测活细胞。
Fluo-3AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后产生较强的荧光，可以检测游离钙离子分布。例如Zhang(参考文献：Zhang，W.H.，Rengel，Z.and Kuo，J.(1998)Determination of intracellular Ca2+in cells of intact wheat roots：loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3under low temperature.PLANT JOURNAL，15，147-151.)使用完整的新鲜的小麦根组织通过低温装载Fluo-3AM探针观察小麦根细胞内游离钙离子的分布；刘炜(参考文献：刘炜，孙德兰，王红，简令成，尚忠林，王学臣and赵可夫(2001)低温处理对冬、春小麦细胞Ca2+时空变化的影响.植物学报，1218-1223.)用Fluo-3AM染色，通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)方法，对小麦叶肉细胞原生质体Ca2+的时空变化进行了比较；郭光明(参考文献：郭光明，张福锁，尚忠林and张锡梅(2002)硼对百合花粉萌发过程中细胞内游离钙离子的影响.中国农业大学学报，7，32-37.)利用激光共聚焦显微镜观察低温装载有钙离子荧光探针Fluo-3的百合花粉的细胞内游离钙离子；Zhu(参考文献：Zhu，K.，Guo，X.，Guo，X.，Peng，W.and Zhou，H.(2013)Protective effects of wheatgerm protein isolate hydrolysates (WGPIH)against hydrogen peroxide-inducedoxidative stress in PC12cells.Food Research International，53，297-303.)用Fluo-3AM孵育小麦胚芽细胞检测钙离子浓度变化。
Fluo-3AM探针要求被装载的组织能保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性，上述技术方案中，Fluo-3AM探针的检测对象为完整组织、原生质体或者用于离体培养的花粉、细胞等。但是，水稻花药发育是个连续不间断的复杂过程，其花药结构复杂，且不同发育阶段其花药结构也发生相应的形态变化，例如：S8a时期即二分体时期，药室从外到内依次为外表皮层、内层、中间层、绒毡层、二分体，及连接四个药室的药隔；而S10时期，即小孢子减数分裂中期，药室从外到内依次划分为外表皮细胞，绒毡层，小孢子(参考文献：Zhang，D.andWilson，Z.A.(2009)Stamen specification and anther development in rice.ChineseScience Bulletin，54，2342-2353.)。其次，水稻花药透明性差。因此，若对花药组织直接进行染色，则无法区分花器官发育过程各个组织结构和细胞中钙离子分布。所以需要通过制作即能维持花药结构完整，又能保持花药各组织细胞活性的冰冻切片，才能形象直观的观察并区分水稻花药内部各组织结构钙离子分布。
尹增芳通过制作鹅掌楸花药冰冻切片，装载Fluo-3AM探针，探索了鹅掌楸花粉发育过程中细胞游离Ca2+的分布(参考文献：Yin，Z.，Ning，D.，Li，Y.，Xi，M.and Shi，J.(2007)Dynamic Change of Free Ca2+during Pollen Development of Liriodendrontulipifera×L.chinense.Scientia Silvae Sinicae.43，27-31，175-176.)。
但是通过制作冰冻切片，装载Fluo-3AM探针在观察作物花药，尤其是水稻花药中钙离子分布的应用未见报道。其主要原因在于：首先，鹅掌楸为落叶大乔木，其花药体积大，制作冰冻切片时易于操作，水稻花药的体积远小于鹅掌楸，较难操作；其次，鹅掌楸属于耐寒植物，在-15℃低温下生长完全不受伤害，在制作冰冻切片时，低温冷冻过程中不易形成冰晶，能较好地维持植物细胞的细微结构，保持植物组织的完整性，但是，水稻花药水分含量高，极不耐寒，透明性差，其大量的水分使得植物样品在低温冷冻过程中易形成冰晶，损伤植物细胞的细微结构，难以保持植物组织的完整性；再次，Fluo-3AM的装载效果受到孵育对象，孵育温度、时间及浓度等影响。
目前应用于植物冰冻切片的包埋方法可总结为三种：①直接包埋法，该方法最为简便，但是包埋剂凝固过程缓慢，易形成冰晶损伤，造成切片破损，结构不完整；②液氮速冻法，即将组织放入软塑瓶盖，加适量OCT包埋剂浸没，然后将其放入液氮液面上方，使包埋组织迅速冰结成块，此法会造成组织与包埋剂接触面极易出现气泡，且对于不规则的组织难以固定好方向，影响切片的角度，成片效果差；③冷冻保护剂法，即将组织浸入保护剂中进行固定渗透，降低组织细胞内溶液的冰点，但固定渗透过程中，会影响细胞渗透势，引起细胞内钙离子分布的变化。水稻花药小，水分含量多，更是增加了冰冻切片难度，这三种方法都不能获得最佳效果。
发明内容
本发明提供了一种快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，该方法快速准确，适用于需要大批量检测和研究工作，并可被推广应用于其他植物组织中游离钙离子分布的检测。
一种快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，包括：
(1)将水稻花药包埋冷冻、切片，将含有水稻花药组织的切片贴于载玻片上；
(2)在切片上滴加Fluo-3AM荧光探针孵育液，在4～37℃培养箱内避光孵育1～120min后，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片；
(3)用荧光显微镜观察装载有Fluo-3AM荧光探针的切片。
为保持水稻花药组织细胞的活性，使用刚采摘的新鲜水稻花药，并保证花药完整。
Fluo-3AM荧光探针进入水稻花药细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而滞留在细胞内。Fluo-3可以和游离钙离子结合，并且结合钙离子后产生较强的荧光，从而可以检测水稻花药中游离钙离子分布。水稻花药发育是个连续不间断的复杂过程，其花药结构复杂，且不同发育阶段其花药结构也发生相应的形态变化；其次，水稻花药透明性差。因此，若对花药组织直接进行染色，则无法区分花器官发育过程各个组织结构和细胞中钙离子分布。所以，需要制作即能维持花药结构完整，又能保持花药各组织细胞活性的冰冻切片，用Fluo-3AM荧光探针孵育切片，更能形象直观的观察并区分水稻花药内部各组织结构钙离子分布。
作为优选，步骤(1)中，水稻花药包埋冷冻的方法为：
将包埋剂冷冻至边缘凝固而中心区域仍呈液态，再将水稻花药置于中心区域内，再另加液态的包埋剂将水稻花药充分包埋，然后迅速冷冻至包埋剂完全凝固。
水稻花药中水分含量高，极不耐寒，其中大量的水分使得水稻花药在低温冷冻过程中容易形成冰晶，损伤水稻花药细胞的细微结构，难以保持组织的完整性。上述的包埋冷冻方法中，先行部分冷冻的包埋剂隔开了水稻花药组织和液氮的直接接触，能防止组织冻裂，最大程度的减少包埋过程中气泡的产生，再次速冻的过程中能维持细胞内各种酶的活性，使水分结晶过程非常迅速，细胞内外的介质变得更加粘稠，从而不能形成较大的冰晶，能使样品保持良好的形态结构，保持组织的完整性。
作为优选，对水稻花药在中心区域内的放置角度进行标记。
水稻花药体积较小，若采用普通的包埋冷冻方法，在切片时需要寻找切片角度，而采用上述包埋冷冻方法时，对水稻花药的放置角度做下标记，切片时就省去了寻找切片角度的步骤，可以保证切片的完整性并使制片过程简单便捷。
作为优选，所述的包埋剂为OCT包埋剂。
包埋剂完全凝固后，在冰冻切片机的恒冷箱内进行切片。
作为优选，步骤(1)中，切片的厚度为8～15μm。
切片厚度过薄容易损伤花药结构，很难得到完整切片；若切片太厚，如60μm时，则会造成花药内组织结构不清晰，细胞高度重叠，无法观察并并区分水稻花药内部各组织结构，影响对钙离子分布的观察。
作为优选，步骤(1)中，载玻片的温度为室温。
在恒冷箱内切出的切片与室温的载玻片之间存在温差，当二者贴于一起时，彼此分子间发生转移而产生吸附力，使切片与载玻片牢固的贴附于一起，因此，切片与载玻片之间可以不再使用粘贴剂。
作为优选，步骤(2)中，Fluo-3AM荧光探针孵育液的配制方法为：用二甲基亚砜将Fluo-3AM荧光探针配制成储存液，再用缓冲溶液将储存液稀释至10～30μM，配置成Fluo-3AM荧光探针孵育液。
所述的缓冲溶液为无酚红的D-Hank’s溶液。
作为优选，步骤(2)包括：
(a)将粘贴有切片的载玻片用缓冲溶液浸洗；
(b)用吸水纸从载玻片的一端吸去多余的缓冲溶液，在切片所在的位置滴加Fluo-3AM荧光探针孵育液，在10～35℃培养箱内避光孵育1～20min；
(c)取出载玻片，用吸水纸从载玻片一端吸去多余的Fluo-3AM荧光探针孵育液后，在缓冲溶液内浸洗，用吸水纸吸去缓冲溶液后，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片。
荧光探针孵育温度、时间及浓度都会影响Fluo-3AM荧光探针的装载效果：水稻花药细胞壁中存在着非特异性酯酶，会迅速将Fluo-3AM剪切形成Fluo-3，滞留在细胞壁，若荧光探针浓度过低，则Fluo-3AM不能完全装载各细胞；若荧光探针浓度过高，会发生非辐射跃迁，降低发光效率，导致荧光猝灭；若孵育温度低，酯酶活性较低，孵育时间变长，也会导致不同程度的荧光猝灭；若孵育温度高，可以缩短时间，但是由于高温会加剧晶格振动，增强发光中心的晶格弛豫，使得无辐射跃迁几率增大，也会造成发光中心或周围的微环境发生某种本质性变化，从而降低发光效率。
作为优选，孵育温度为25～30℃，孵育时间为3～10min，Fluo-3AM荧光探针孵育液的浓度为20μM。
在此条件下，Fluo-3AM荧光探针的装载效果良好，并且水稻花药组织中Fluo-3AM荧光探针的发光效率较高。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)与石蜡切片或半薄切片焦锑酸钾沉淀法测定植物组织中钙离子分布的方法相比，本发明的方法快速简便，在2～3小时内即可得到实验结果，有效缩短了实验时间，可被进一步应用于其他植物组织中游离钙离子的分布，对于观察水稻花药发育阶段、基础研究切片等需要大批量检测和研究工作特别适用；
(2)本发明中的包埋冷冻方法具有以下优点，首先，先行部分冷冻的包埋剂隔开了植物组织和液氮的直接接触，能防止组织冻裂，最大程度的减少包埋过程中气泡的产生，再次速冻的过程中能维持细胞内各种酶的活性，使水分结晶过程非常迅速，细胞内外的介质变得更加粘稠，从而不能形成较大的冰晶，能使样品保持良好的形态结构，保持组织的完整性；再次，采用本发明的包埋冷冻方法时可用调整植物组织的放置角度并做下标记，切片时就省去了寻找切片角度的步骤，可以保证切片的完整性并使制片过程简单便捷。本发明中的包埋冷冻方法适用于其他植物组织，包括不规则组织。
附图说明
图1为可见光模式下实施例1中水稻花药的冰冻切片；
图2为实施例1中水稻花药冰冻切片游离钙离子的分布图；
图3为可见光模式下对比例1中水稻花药的冰冻切片；
图4为对比例1水稻花药冰冻切片游离钙离子的分布图；
图5为可见光模式下对比例2中水稻花药的冰冻切片；
图6为对比例2水稻花药冰冻切片游离钙离子的分布图。
具体实施方式
以下实施例以小孢子时期的水稻花药作为材料，采用OCT包埋剂包埋制作冰冻切片，Fluo-3AM染色，获得了水稻花药游离钙离子的分布图像。实验过程如下：
实施例1
1.准备工作：
1)制备无盖的正方体锡纸盒：
先将锡箔纸裁剪成30mm×30mm的正方形，利用10mm×10mm×45mm的比色皿，制备边长为10mm的无盖锡纸盒，要求各个面平整，用于装OCT包埋剂。在锡纸盒的一面用马克笔做标记，用于辨别花药组织的方向或对组织样品进行标号。
2)Fluo-3AM孵育液的制备：
用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3AM配制成1mM的储存液，-20℃储存。使用时，用D-Hank’s(无酚红)溶液将储存液稀释至20μM，-4℃待用。
2.花药取材及包埋：
1)锡箔纸盒内加入约1/3体积的冷冻包埋剂OCT，置于-20℃的冷冻切片机恒冷箱内。
2)立即取一新鲜完整的水稻的小花，快速用镊子拨开小花的外稃和内稃，用镊子捏住花丝取下花药。于此同时，锡箔纸盒内的冷冻包埋剂边缘凝固变白，中心区域仍呈现液态，迅速将花药横置于尚未凝固住的包埋剂内，将花丝朝向做标记的一面，尽量避免气泡。
3)使用OCT包埋剂将花药充分包埋，填满锡箔纸盒。
4)用镊子夹住锡箔纸盒的一个面，迅速将其转移至液氮液面上方0.5cm处，切勿浸入液氮，冷冻至包埋剂变白取出，放入-20℃的冷冻切片机恒冷箱。
3.切片：
1)采用Thermo Scientific Shandon Cryotome FE冰冻切片机，恒冷箱内保持温度-20℃左右。
2)在样品托上添一层OCT包埋剂，去掉锡箔纸盒，将做标记的一面置于样品托上，使OCT包埋剂填满组织和样品托之间的缝隙，待固定完成，3-5min后即可进行切片。
3)片厚10μm，切到目标位置后将切片贴于室温存放的载玻片。因为室温存放的载玻片与冷冻箱中的切片有温差，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。因此，载玻片可以不再使用粘贴剂。
4.装载荧光探针Fluo-3AM：
1)准备三个盛满D-Hank’s(无酚红)溶液的烧杯，将粘有切片的载玻片一端依次在三个烧杯中缓缓浸洗10s去除OCT包埋剂。此步骤的浸洗方法可以避免常规冲洗方法造成的切片脱片的现象。
2)用吸水纸在载玻片一端吸去多余的D-Hank’s(无酚红)溶液，在切片所在位置滴加3-5滴Fluo-3AM孵育液，转移到28℃培养箱内避光孵育10min。
3)取出载玻片，用吸水纸吸去孵育液，用D-Hank’s(无酚红)溶液浸洗3次，每次5s。再次用吸水纸吸干用D-Hank’s(无酚红)溶液。在切片上滴加几滴抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片。置于荧光显微镜下观察。
5.荧光显微镜观察：
1)采用连接电脑的Nikon ECLIPSE Ni荧光显微镜对切片进行观察，关闭房间内的电灯，打开电脑，开启显微镜汞灯。
2)将载玻片放在荧光显微镜的载物台上，用压片夹压住，迅速地选取视野内一个完整的花药，微调至图像清晰，采集图片，如图1所示，其中图中的标尺等于100μm。
3)为了比较清晰的观察到钙离子分布，选择蓝光激发滤板，采集图片，如图2所示，其中图中标尺等于100μm。
对比例1
与实施例1相比，不同之处在于花药用OCT包埋剂包埋冷冻。用荧光显微镜观察，采集图片，如图3、图4所示。
采用直接包埋法制作冰冻切片，由于包埋剂凝固过程缓慢，形成冰晶损伤，造成切片破损，结构不完整，如图3箭头所示。
对比例2
与实施例1相比，不同之处在于切片时切片厚度为60μm，用荧光显微镜观察，采集图片，如图5、图6所示。
切片过厚时，造成花药内组织结构不清晰，细胞高度重叠，无法观察并区分水稻花药内部各组织结构，影响对钙离子分布的观察。
Claims (5)
1.一种快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，其特征在于，包括：
（1）将水稻花药包埋冷冻、切片，将含有水稻花药组织的切片贴于载玻片上；
水稻花药包埋冷冻的方法为：将包埋剂冷冻至边缘凝固而中心区域仍呈液态，再将水稻花药置于中心区域内，再另加液态的包埋剂将水稻花药充分包埋，然后迅速冷冻至包埋剂完全凝固；
（2）在切片上滴加Fluo-3AM荧光探针孵育液，在25~30℃培养箱内避光孵育3~10min后，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片；
Fluo-3AM荧光探针孵育液的配制方法为：用二甲基亚砜将Fluo-3 AM荧光探针配制成储存液，再用无酚红的D-Hank’s溶液将储存液稀释至20μM，配置成Fluo-3AM荧光探针孵育液；
（3）用荧光显微镜观察装载有Fluo-3AM荧光探针的切片。
2.根据权利要求1所述的快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，其特征在于，对水稻花药在中心区域内的放置角度进行标记。
3.根据权利要求1所述的快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，其特征在于，步骤（1）中，切片的厚度为8~15μm。
4.根据权利要求1所述的快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，其特征在于，步骤（1）中，载玻片的温度为室温。
5.根据权利要求1所述的快速检测水稻花药游离钙离子分布的荧光标记方法，其特征在于，步骤（2）包括：
（a）将粘贴有切片的载玻片用缓冲溶液浸洗；
（b）用吸水纸从载玻片的一端吸去多余的缓冲溶液，在切片所在的位置滴加Fluo-3AM荧光探针孵育液，在25~30℃培养箱内避光孵育3~10min；
（c）取出载玻片，用吸水纸从载玻片一端吸去多余的Fluo-3AM荧光探针孵育液后，在缓冲溶液内浸洗，用吸水纸吸去缓冲溶液后，滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片。
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